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Resumo

Fornecemos um protocolo detalhado para isolar e identificar populações raras de células T específicas de antígenos em pulmões de camundongos por meio de enriquecimento de células T baseadas em esferas magnéticas e tetrâmeros peptídicos: complexo principal de histocompatibilidade (MHC).

Resumo

A identificação e caracterização de células T específicas do antígeno durante a saúde e a doença continua sendo a chave para melhorar nossa compreensão da fisiopatologia imunológica. Os desafios técnicos de rastrear populações de células T específicas do antígeno dentro do repertório de células T endógenas foram muito avançados pelo desenvolvimento de reagentes de tetrâmero peptídeo: MHC. Esses multímeros solúveis marcados com fluorescência de moléculas MHC classe I ou classe II complexadas a epítopos de peptídeos antigênicos ligam-se diretamente às células T com especificidade correspondente do receptor de células T (TCR) e podem, portanto, identificar populações de células T específicas do antígeno em seu estado nativo sem a necessidade de uma resposta funcional induzida por ex vivo estimulação. Para populações extremamente raras, as células T ligadas ao tetrâmero podem ser enriquecidas magneticamente para aumentar a sensibilidade e a confiabilidade da detecção.

À medida que a investigação da imunidade das células T residentes no tecido se aprofunda, há uma necessidade premente de identificar células T específicas do antígeno que trafegam e residem em tecidos não linfoides. Neste protocolo, apresentamos um conjunto detalhado de instruções para o isolamento e caracterização de células T específicas do antígeno presentes nos pulmões de camundongos. Isso envolve o isolamento de células T do tecido pulmonar digerido, seguido por uma etapa geral de enriquecimento magnético de células T e coloração de tetrâmero para análise e classificação por citometria de fluxo. As etapas destacadas neste protocolo utilizam técnicas comuns e reagentes prontamente disponíveis, tornando-o acessível para quase qualquer pesquisador envolvido em imunologia de células T de camundongos, e são altamente adaptáveis para uma variedade de análises a jusante de qualquer população de células T específicas de antígeno de baixa frequência que residam nos pulmões.

Introdução

No coração do sistema imunológico adaptativo está a capacidade de uma célula T de reconhecer e responder a um antígeno específico. Quando e onde uma célula T responde ao seu antígeno cognato determina o equilíbrio entre infecção e autoimunidade, homeostase e câncer, saúde e doença1. Segue-se que o estudo de células T em um contexto específico de imunidade deve se concentrar nas células com especificidade para um antígeno relevante de interesse. Entre os avanços tecnológicos que aumentaram muito a capacidade de caracterizar populações de células T específicas do antígeno estão multímeros solúveis marcados com fluorescência (geralmente tetrâmeros) de moléculas de classe I ou classe II do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) complexadas a epítopos de peptídeos antigênicos, mais conhecidos como "tetrâmeros peptídeo: MHC" 2 , 3 , 4 , 5. Ao representar os ligantes naturais dos receptores de antígenos de células T (TCRs), os tetrâmeros peptídeo:MHC classe I e classe II fornecem um meio de identificar diretamente as células T CD8+ e CD4+ específicas do antígeno, respectivamente, dentro do repertório endógeno de células T no sistema imunológico sem a necessidade de uma resposta à estimulação do antígeno em um ensaio. Os tetrâmeros representam uma abordagem mais elegante para o estudo de células T específicas do antígeno do que os modelos de transferência adotiva de células T transgênicas TCR6 e têm sido cada vez mais usados para identificar populações de células T estranhas e auto-específicas de antígenos em modelos experimentais de camundongos e doenças humanas 4,5.

Embora os tetrâmeros possam identificar prontamente populações de alta frequência de células T que se expandiram em resposta à estimulação de antígenos, seu uso para células T ingênuas, autoantígenas específicas ou de memória é limitado pelas frequências muito baixas dessas populações7. Nosso grupo e outros desenvolveram e popularizaram estratégias de enriquecimento magnético baseadas em tetrâmeros que aumentam a sensibilidade de detecção para permitir estudos dessas populações de células em tecidos linfóides de camundongos 8,9,10,11.

O surgimento de células T residentes no tecido no campo colocou uma ênfase maior no desenvolvimento de novas maneiras de investigar células T no espaço não linfóide. Como muitas outras superfícies mucosas, as células T nos pulmões encontram uma variedade de antígenos próprios e estranhos derivados do epitélio do hospedeiro, micróbios comensais e infecciosos e entidades ambientais, incluindo alérgenos. A análise transcricional de células T colhidas de tecido não linfóide (NLT) demonstra um fenótipo semelhante à memória que tem destino e função únicos específicos do tecido, muitas vezes direcionados ao tráfego e à homeostase do tecido12. Além disso, as células T de memória residentes no tecido (Trms) tendem a ser mais restritas clonalmente do que aquelas em circulação13. Determinar como e por que os antígenos impulsionam a residência das células T na NLT é fundamental para entender como o sistema imunológico protege contra infecções, mantém a homeostase do tecido e, às vezes, se transforma em autoimunidade. No entanto, parece haver maior atrito entre as células T residentes nos tecidos dos pulmões em comparação com outros NLT14. Consequentemente, a capacidade de identificar e caracterizar células T endógenas do pulmão com uma determinada especificidade de antígeno é limitada por sua raridade inerente.

Ao combinar o uso de técnicas de enriquecimento celular baseadas em esferas magnéticas e coloração de tetrâmero peptídeo: MHC, conseguimos detectar células T auto-específicas expandidas, mas raras, em pulmões de camundongos15,16. Aqui, apresentamos uma descrição detalhada de um protocolo que otimizamos para isolar e caracterizar de forma confiável qualquer população rara de células T específicas do antígeno presente nos pulmões de camundongos (Figura 1). Este protocolo incorpora uma etapa de coloração de anticorpos in vivo para distinguir células T residentes no tecido das células T vasculares17, seguida por dois métodos diferentes para processamento de tecido pulmonar para acomodar a disponibilidade de recursos. Isso é seguido por uma etapa geral de enriquecimento magnético de células T, coloração de tetrâmero e análise por citometria de fluxo. A viabilidade celular e a coloração do tetrâmero são aprimoradas ainda mais neste protocolo pela adição de aminoguanidina, que bloqueia a apoptose induzida por ativação de células T mediada por óxido nítrico sintase induzível (iNOS)18 e Dasatinibe, que limita a regulação negativa do TCR19. As etapas destacadas neste protocolo utilizam técnicas comuns e reagentes prontamente disponíveis, tornando-o acessível para quase todos os pesquisadores envolvidos em imunologia de células T de camundongos e é altamente adaptável para uma variedade de análises posteriores. Embora não seja provável que as células T virgens sejam encontradas nos pulmões, acreditamos que este protocolo será particularmente útil para o estudo de células T autoantígenas específicas e Trms nos pulmões.

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Figura 1: Visão geral do fluxo de trabalho do protocolo. Os pulmões são colhidos de camundongos e dissociados em células únicas. As amostras são posteriormente enriquecidas para células T antes da coloração com tetrâmeros peptídicos:MHC e anticorpos marcados com fluorescência para análise de citometria de fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

Os procedimentos descritos neste protocolo são aprovados e desenvolvidos de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Massachusetts General Hospital, um programa de manejo de animais credenciado pela Associação Americana para o Credenciamento de Cuidados com Animais de Laboratório (AAALAC). Os experimentos foram realizados em camundongos machos e fêmeas de 8 a 12 semanas de idade em um fundo genético C57BL / 6 criados e mantidos no biotério MGH sob condições específicas livres de patógenos.

1. Preparação de soluções de estoque

  1. Prepare o tampão HEPES dissolvendo 10 mM HEPES, 5 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 150 mM NaCl e 1 mM MgCl2 e ajuste para pH 7.4.
  2. Prepare 10x solução estoque de Liberase dissolvendo 700 μg/mL de Meio de Termolisina Liberase (TM) (ver Tabela de Materiais) na Solução Salina Balanceada de Hank com Ca++ e Mg++ (ver Tabela de Materiais).
  3. Prepare 10x solução estoque de aminoguanidina dissolvendo 100 mM de sal de hemissulfato de aminoguanidina (consulte a Tabela de Materiais) na solução salina balanceada de Hank com Ca++ e Mg++ (consulte a Tabela de Materiais).
  4. Prepare o meio completo de Aminoácidos do Presunto de Águia (EHAA) misturando o meio EHAA (ver Tabela de Materiais) com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 U / mL de penicilina / estreptomicina, 50 μg / mL de gentamicina, 2 mM de L-glutamina e 55 μM de 2-mercaptoetanol.
    NOTA: Outros meios de células T comuns, como RPMI ou DMEM, também podem ser usados.
  5. Prepare o tampão classificador misturando 1x PBS com 2% de FBS e 0,05% de azida de sódio.
  6. Prepare o bloqueio Fc diluindo o anticorpo anti-camundongo CD16 / 32 purificado (consulte a Tabela de Materiais) a 1: 100 v / v no tampão classificador.
  7. Prepare a solução de digestão Liberase TM / DNase adicionando 100 μg / mL de Liberase TM e 50 μg / mL DNase I (ver Tabela de Materiais) em meio RPMI 1640 sem L-glutamina (ver Tabela de Materiais).
  8. Prepare a mistura de cetamina / xilazina adicionando 10 mg / mL de cetamina (ver Tabela de Materiais) e 1 mg / mL de xilazina (ver Tabela de Materiais) em solução salina normal (0,9% NaCl) (ver Tabela de Materiais).

2. Geração de suspensão unicelular a partir do tecido pulmonar via dissociador de tecido automatizado

  1. Para cada camundongo, prepare 4 mL de tampão HEPES gelado em um tubo dissociador de tecido especializado (consulte a Tabela de Materiais) e mantenha-o no gelo.
  2. Anestesiar camundongos por injeção intraperitoneal de 150-200 μL de mistura de cetamina / xilazina. Injete 1-3 μg de anticorpo CD45 de camundongo conjugado com fluoróforo (ver Tabela de Materiais) diluído em 100 μL de solução salina normal por via intravenosa em cada camundongo anestesiado. Eutanasiar o camundongo 3 min após a administração do anticorpo com uma injeção intraperitoneal de 500-600 μL de mistura de cetamina/xilazina.
  3. Ressecção os pulmões e coloque-os em seus respectivos tubos dissociadores de tecidos resfriados em gelo. Coloque os tubos no dissociador de tecido automatizado (consulte a Tabela de Materiais) e execute o primeiro programa (programa predefinido) para o tecido pulmonar.
  4. Adicione 500 μL de solução-mãe de Liberase e 500 μL de solução-mãe de aminoguanidina a cada tubo que contém o tecido pulmonar dissociado. Incubar num misturador de nutantes durante 30 min a 37 °C.
  5. Coloque os tubos de volta no dissociador e execute o segundo programa (programa predefinido) para o tecido pulmonar.
  6. Despeje a suspensão de célula única do tubo dissociador de tecido através de um filtro de células de 100 μm (consulte a Tabela de Materiais) em um tubo cônico de 50 mL. Enxágue o tubo dissociador de tecido com 5 mL de EHAA completo (ou qualquer meio de células T equivalente) e passe pelo filtro para o tubo de 50 mL.
  7. Remova o filtro e aumente o volume da suspensão celular para 50 mL com EHAA completo. Centrifugar a suspensão celular a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Aspire cuidadosamente o sobrenadante, deixando para trás aproximadamente 100 μL de sobrenadante e pellet celular.
  8. Adicione aproximadamente 100 μL de solução de bloco Fc para elevar o volume total até 200 μL e vortex vigorosamente para ressuspender o pellet.

3. Protocolo alternativo: Gerando suspensão de célula única do tecido pulmonar por meio de dissociação manual

  1. Para cada camundongo, prepare 1 mL de EHAA completo em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e mantenha no gelo.
  2. Anestesiar camundongos por injeção intraperitoneal de 150-200 μL de mistura de cetamina / xilazina. Injete 1-3 μg de anticorpo CD45 de camundongo conjugado com fluoróforo diluído em 100 μL de solução salina normal por via intravenosa em cada camundongo anestesiado. Eutanasiar o camundongo 3 min após a administração do anticorpo com uma injeção intraperitoneal de 500-600 μL de mistura de cetamina/xilazina.
  3. Ressecção os pulmões e coloque-os em seus respectivos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL resfriados no gelo.
  4. Depois que todos os pulmões forem colhidos, transfira cada pulmão para um novo tubo de microcentrífuga sem nenhum meio celular.
  5. Corte os pulmões em pequenos fragmentos (pedaços de ~ 2-3 mm) usando uma tesoura dentro do tubo de microcentrífuga.
  6. Adicione 1 mL de coquetel de digestão Liberase TM / DNase I a cada tubo.
  7. Incubar durante 30 min a 37 °C em banho-maria. Retorne as amostras ao gelo depois para evitar a digestão excessiva.
  8. Despeje a amostra sobre um filtro de células de 100 μm colocado em cima de um tubo cônico de 50 mL. Amasse o tecido contra a malha com a extremidade de borracha do êmbolo de uma seringa estéril de 1 mL.
  9. Enxágue o filtro com tampão classificador frio, coletando um volume final de 7 mL no tubo. Centrifugar a suspensão celular a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Aspire cuidadosamente o sobrenadante, deixando aproximadamente 100 μL de sobrenadante e pellet celular.
  10. Adicione 100 μL de solução de bloco Fc para elevar o volume total até 200 μL e vortex vigorosamente para ressuspender o pellet.

4. Enriquecimento da amostra de pulmão para células T por meio do enriquecimento de esferas magnéticas

  1. Adicione 50 μL de microesferas CD90.2 anti-mouse (consulte a Tabela de Materiais). Vortex e incubar por 10 min a 4 °C.
    NOTA: CD90.2 corresponde ao alelo expresso por células T em camundongos C57BL/6. Verifique o genótipo do alelo se outras cepas de camundongos forem usadas.
  2. Enquanto isso, coloque uma coluna de separação de células paramagnéticas (consulte a Tabela de Materiais) em um ímã de separação de células de uma ou quatro posições (consulte a Tabela de Materiais). Posicione um tubo cônico aberto de 15 mL sob cada coluna para capturar o fluxo. Prepare a coluna com 3 mL de tampão classificador frio, permitindo que a coluna seja drenada por gravidade para o tubo cônico abaixo.
  3. Depois que as células forem incubadas com as microesferas por 10 min, adicione tampão classificador frio a um volume de 1 mL e transfira através de um filtro de células de 100 μm colocado no topo da coluna. Recolha o fluxo da coluna para um novo tubo cónico de 15 ml colocado por baixo da coluna.
  4. Uma vez que a suspensão celular tenha drenado completamente através da coluna por gravidade, lave a coluna enxaguando o tubo original com mais 3 mL de tampão classificador a frio e aplicando-o na coluna através da malha, enxaguando assim o filtro. Remova o filtro.
  5. Quando a amostra tiver sido novamente completamente drenada para a coluna e nenhum fluxo adicional estiver saindo da coluna, remova a coluna do ímã e coloque-a sobre um novo tubo cônico de 15 mL.
  6. Adicione 5 mL de tampão classificador frio à coluna.
  7. Eluir imediatamente as células ligadas à coluna empurrando o êmbolo da coluna para o topo em um movimento contínuo e forçando o buffer do classificador para fora da parte inferior da coluna para o novo tubo.
  8. Centrifugar as amostras eluídas a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Aspire cuidadosamente o sobrenadante, deixando para trás aproximadamente 100 μL de sobrenadante e pellet celular.
  9. Adicione 100 μL de tampão classificador a frio para elevar o volume total até 200 μL e vortex vigorosamente para ressuspender o pellet.
  10. Analise a amostra de fluxo contendo a fração de células não ligadas, se desejar.

5. Coloração das células T específicas do antígeno com peptídeo: tetrâmeros MHC

  1. Adicione 1 μL de 10 μM de Dasatinibe (consulte a Tabela de Materiais) a cada amostra, vórtice e incube por 5 min em RT.
  2. Adicione peptídeo conjugado com PE ou APC: tetrâmero MHC a uma concentração final de 10 nM (ou concentração empiricamente otimizada para um determinado tetrâmero).
  3. Vórtice e incubar no escuro por 1 h em RT (ou tempo e temperatura empiricamente otimizados).

6. Análise das células T marcadas com tetrâmero por citometria de fluxo

  1. Enquanto a amostra está sendo corada com tetrâmeros peptídeo: MHC, prepare uma mistura mestre de anticorpos para corar os marcadores de superfície das células (Tabela 1).
    NOTA: Evite fluoróforos que entrem em conflito com o anticorpo CD45 administrado por via intravenosa ou com os tetrâmeros.
  2. Com 15 minutos restantes no período de incubação para coloração com tetrâmero, adicione a mistura principal de anticorpos de superfície a 1:100 (ou concentração empiricamente otimizada) a cada amostra.
  3. Continue a incubar no escuro em RT pelo restante do período de incubação de 1 h.
  4. Adicione 50.000 grânulos de contagem de citometria de fluxo (consulte a Tabela de Materiais) e adicione tampão classificador frio a um volume final de aproximadamente 5 mL. Centrifugue a amostra corada a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Aspire cuidadosamente o sobrenadante, deixando para trás aproximadamente 100 μL de sobrenadante e pellet de célula/esfera.
  5. Ressuspenda a amostra com mais 200 μL de tampão classificador e transfira a amostra para um tubo de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) de 5 mL.
  6. Analisar a amostra num citómetro de fluxo. Colete o maior número possível de células, até um máximo de 2.500.000 eventos no total. Certifique-se de que pelo menos 20.000 eventos de contagem de contas tenham sido coletados. Mantenha a taxa de aquisição igual ou inferior a 5.000 eventos por segundo.
  7. Salve todos os dados como arquivos FCS.

  

FluorochromeAnticorpo
BUV395CD90.2
Azul PacíficoCD45 (adicionado anteriormente por injeção intravenosa)
Laranja do PacíficoCD8
Violeta Brilhante 785CD4
FITCCD3
PerCP-Cy5.5Despejo (B220, CD11b, CD11c, F4/80)
PEtetrâmero pMHC ou marcador fenotípico
PE-Cy7Marcador fenotípico (por exemplo, CD44, PD-1, CD69, etc.)
APCtetrâmero pMHC ou marcador fenotípico
AlexaFluor 700Marcador fenotípico (por exemplo, CD44, PD-1, CD69, etc.)
APC-Cy7Mancha viva/morta

Tabela 1: Matriz de coloração da amostra. Um painel típico de anticorpos de citometria de fluxo conjugados com fluoróforo utilizados para identificar e caracterizar células T específicas do antígeno.

7. Análise de dados

  1. Analise os arquivos de dados FCS usando o software de citometria de fluxo apropriado.
    1. Configure uma sequência de portões de inclusão sucessivos para identificar 1) eventos semelhantes a linfócitos, 2) únicos, 3) vivos, 4) extravasculares, 5) negativos para despejo e 6) CD90.2 positivos para CD4 ou CD8 positivos (Figura 2).
    2. Identifique as células T positivas para tetrâmero nessas populações.
  2. Determine a contagem absoluta de células tetrâmero positivo calculando a proporção de grânulos adicionados (50.000) para o número de grânulos coletados durante a execução da amostra e multiplicando o valor pelo número total de células tetrâmero positivas coletadas.
    figure-protocol-13476

Resultados

A Figura 2 mostra a estratégia de gating representativa usada na identificação de células T CD4+ específicas para antígenos raros nos pulmões com tetrâmeros peptídeo:MHC classe II. O mesmo processo pode ser aplicado para células T CD8+ específicas do antígeno com tetrâmeros peptídeo:MHC classe I (dados não mostrados).

Devido ao alto número de células não linfóides nos pulmões, a detecção confiável de células T raras es...

Discussão

Caracterizações anteriores de células T específicas do antígeno dos pulmões se beneficiaram do número robusto de células T específicas do antígeno que se expandem após um evento de priming agudo, como imunização intranasal ou infecção 20,21,22. No entanto, populações de células T mais raras nos pulmões, como células T específicas do autoantígeno ou células T de memória residentes no tecido, são difíceis...

Divulgações

Os autores não têm conflitos a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos a L. Kuhn pela assistência técnica no processamento de tissue e na produção de tetrâmeros. Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01 AI107020 e P01 AI165072 para J.J.M., T32 AI007512 para D.S.S.), o Massachusetts Consortium on Pathogen Readiness (J.J.M) e o Comitê Executivo de Pesquisa do Hospital Geral de Massachusetts (J.J.M.).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm cell strainerFisher Scientific22-363-549
10x PBS without Ca++ or Mg++Corning46-013-CM
1x PBS without Ca++ or Mg++Corning21-031-CV
AccuCheck Counting BeadsInvitrogenPCB100
Aminoguanidine Hemisulfate SaltSigma-AldrichA7009
CD90.2 microbeads, mouseMiltenyi130-121-278
Cell separation magnet (MidiMACS Separator)Miltenyi130-042-302Holds single LS column
Cell separation magnet (QuadroMACS Separator)Miltenyi130-090-976Holds 4 LS columns
DasatinibSigma-AldrichCDS023389
DNase IRoche10104159001
Eagle’s Ham’s Amino Acids mediumSigma-AldrichC5572
gentleMACSMiltenyi130-093-235Automated tissue dissociator
gentleMACS C TubesMiltenyi130-093-237Automated tissue dissociator tubes
Hank's Balanced Salt Solution with Ca++ or Mg++Corning21-020-CM
HEPESGibco15630080
KetamineVedcoNDC 50989-996-06
Liberase TMRoche5401119001
Pacific Blue anti-mouse CD45 antibody (Clone: 30-F11)Biolegend103126
Paramagnetic cell separation columns (LS Columns)Miltenyi130-042-401Comes with plunger
Purified anti mouse CD16/32 antibody (Clone: 93)Biolegend101302
RPMI 1640 medium without L-glutamineCorning15-040-CM
Sodium Chloride 0.9% (Normal Saline)CytivaZ1376
XylazinePivetalNDC 466066-750-02

Referências

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