Identifizierung seltener antigenspezifischer T-Zellen aus der Lunge von Mäusen mit Peptid:Major-Histokompatibilitätskomplex-Tetrameren

Zusammenfassung

Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Identifizierung seltener antigenspezifischer T-Zellpopulationen in der Lunge von Mäusen durch magnetische T-Zell-Anreicherung und Peptid:Major Histocompatibility Complex (MHC)-Tetramere.

Zusammenfassung

Die Identifizierung und Charakterisierung antigenspezifischer T-Zellen während der Zeit von Gesundheit und Krankheit ist nach wie vor ein Schlüssel zur Verbesserung unseres Verständnisses der Immunpathophysiologie. Die technischen Herausforderungen bei der Verfolgung antigenspezifischer T-Zellpopulationen innerhalb des endogenen T-Zell-Repertoires wurden durch die Entwicklung von Peptid:MHC-Tetramerreagenzien erheblich vorangetrieben. Diese fluoreszenzmarkierten löslichen Multimere von MHC-Molekülen der Klasse I oder II, die an antigene Peptidepitope komplexiert sind, binden direkt an T-Zellen mit entsprechender T-Zell-Rezeptor (TCR)-Spezifität und können daher antigenspezifische T-Zellpopulationen in ihrem nativen Zustand identifizieren, ohne dass eine durch ex vivo induzierte funktionelle Reaktion erforderlich ist Anregung. Für äußerst seltene Populationen können tetramergebundene T-Zellen magnetisch angereichert werden, um die Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit des Nachweises zu erhöhen.

Da sich die Untersuchung der geweberesidenten T-Zell-Immunität vertieft, besteht ein dringender Bedarf, antigenspezifische T-Zellen zu identifizieren, die zu nicht-lymphoiden Geweben gelangen und sich dort aufhalten. In diesem Protokoll stellen wir eine detaillierte Reihe von Anweisungen für die Isolierung und Charakterisierung von antigenspezifischen T-Zellen vor, die in der Lunge von Mäusen vorhanden sind. Dies beinhaltet die Isolierung von T-Zellen aus verdautem Lungengewebe, gefolgt von einem allgemeinen Schritt der magnetischen Anreicherung von T-Zellen und einer Tetramerfärbung für die durchflusszytometrische Analyse und Sortierung. Die in diesem Protokoll hervorgehobenen Schritte verwenden gängige Techniken und leicht verfügbare Reagenzien, so dass es für nahezu jeden Forscher, der sich mit Maus-T-Zell-Immunologie beschäftigt, zugänglich ist, und sind hochgradig anpassbar für eine Vielzahl von nachgelagerten Analysen jeder niederfrequenten antigenspezifischen T-Zell-Population, die sich in der Lunge befindet.

Einleitung

Das Herzstück des adaptiven Immunsystems ist die Fähigkeit einer T-Zelle, ein bestimmtes Antigen zu erkennen und darauf zu reagieren. Wann und wo eine T-Zelle auf ihr verwandtes Antigen reagiert, bestimmt das Gleichgewicht von Infektion und Autoimmunität, Homöostase und Krebs, Gesundheit und Krankheit¹. Daraus folgt, dass sich die Untersuchung von T-Zellen in einem spezifischen Kontext der Immunität auf die Zellen konzentrieren sollte, die spezifisch für ein relevantes Antigen von Interesse sind. Zu den technologischen Fortschritten, die die Fähigkeit zur Charakterisierung antigenspezifischer T-Zellpopulationen erheblich verbessert haben, gehör....

Protokoll

Die in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren sind in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Massachusetts General Hospital, einem von der American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) akkreditierten Tiermanagementprogramm, genehmigt und entwickelt. Die Experimente wurden an 8-12 Wochen alten männlichen und weiblichen Mäusen mit einem genetischen Hintergrund von C57BL/6 durchgeführt, die in der MGH-Tieranlage unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gezüchtet und gehalten wurden.

1. Herstellung von Stammlösungen

1. Bereite....

Diskussion

Frühere Charakterisierungen von antigenspezifischen T-Zellen aus der Lunge haben von der robusten Anzahl antigenspezifischer T-Zellen profitiert, die sich nach einem akuten Priming-Ereignis wie einer intranasalen Immunisierung oder Infektion vermehren 20,21,22. Seltenere T-Zellpopulationen in der Lunge, wie z. B. selbstantigenspezifische T-Zellen oder geweberesidente Gedächtnis-T-Zellen, sind jedoch ohne irgendeine Form der Pr.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm cell strainer	Fisher Scientific	22-363-549
10x PBS without Ca++ or Mg++	Corning	46-013-CM
1x PBS without Ca++ or Mg++	Corning	21-031-CV
AccuCheck Counting Beads	Invitrogen	PCB100
Aminoguanidine Hemisulfate Salt	Sigma-Aldrich	A7009
CD90.2 microbeads, mouse	Miltenyi	130-121-278
Cell separation magnet (MidiMACS Separator)	Miltenyi	130-042-302	Holds single LS column
Cell separation magnet (QuadroMACS Separator)	Miltenyi	130-090-976	Holds 4 LS columns
Dasatinib	Sigma-Aldrich	CDS023389
DNase I	Roche	10104159001
Eagle’s Ham’s Amino Acids medium	Sigma-Aldrich	C5572
gentleMACS	Miltenyi	130-093-235	Automated tissue dissociator
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237	Automated tissue dissociator tubes
Hank's Balanced Salt Solution with Ca++ or Mg++	Corning	21-020-CM
HEPES	Gibco	15630080
Ketamine	Vedco	NDC 50989-996-06
Liberase TM	Roche	5401119001
Pacific Blue anti-mouse CD45 antibody (Clone: 30-F11)	Biolegend	103126
Paramagnetic cell separation columns (LS Columns)	Miltenyi	130-042-401	Comes with plunger
Purified anti mouse CD16/32 antibody (Clone: 93)	Biolegend	101302
RPMI 1640 medium without L-glutamine	Corning	15-040-CM
Sodium Chloride 0.9% (Normal Saline)	Cytiva	Z1376
Xylazine	Pivetal	NDC 466066-750-02