Identificazione di rare cellule T antigene-specifiche da polmoni di topo con tetrameri del complesso peptide:istocompatibilità maggiore

Riepilogo

Forniamo un protocollo dettagliato per l'isolamento e l'identificazione di rare popolazioni di cellule T antigene-specifiche nei polmoni di topo attraverso l'arricchimento di cellule T basato su biglie magnetiche e i tetrameri peptide:complesso maggiore di istocompatibilità (MHC).

Abstract

L'identificazione e la caratterizzazione delle cellule T antigene-specifiche durante la salute e la malattia rimane una chiave per migliorare la nostra comprensione della fisiopatologia immunitaria. Le sfide tecniche legate al tracciamento delle popolazioni di cellule T antigene-specifiche all'interno del repertorio endogeno delle cellule T sono state notevolmente avanzate dallo sviluppo dei reagenti tetrameri peptide:MHC. Questi multimeri solubili marcati in fluorescenza di molecole MHC di classe I o II complessate con epitopi di peptidi antigenici si legano direttamente alle cellule T con corrispondente specificità del recettore delle cellule T (TCR) e possono, quindi, identificare popolazioni di cellule T antigene-specifiche nel loro stato nativo senza la necessità di una risposta funzionale indotta da ex vivo stimolazione. Per popolazioni estremamente rare, le cellule T legate ai tetrameri possono essere arricchite magneticamente per aumentare la sensibilità e l'affidabilità del rilevamento.

Con l'approfondimento dello studio dell'immunità delle cellule T residenti nei tessuti, vi è un urgente bisogno di identificare le cellule T antigene-specifiche che viaggiano e risiedono nei tessuti non linfoidi. In questo protocollo, presentiamo una serie dettagliata di istruzioni per l'isolamento e la caratterizzazione delle cellule T antigene-specifiche presenti all'interno dei polmoni di topo. Ciò comporta l'isolamento delle cellule T dal tessuto polmonare digerito, seguito da una fase generale di arricchimento magnetico delle cellule T e dalla colorazione con tetramero per l'analisi e lo smistamento della citometria a flusso. Le fasi evidenziate in questo protocollo utilizzano tecniche comuni e reagenti prontamente disponibili, rendendolo accessibile a quasi tutti i ricercatori impegnati nell'immunologia delle cellule T di topo, e sono altamente adattabili per una varietà di analisi a valle di qualsiasi popolazione di cellule T antigene-specifiche a bassa frequenza che risiedono nei polmoni.

Introduzione

Al centro del sistema immunitario adattativo c'è la capacità di una cellula T di riconoscere e rispondere a un antigene specifico. Quando e dove una cellula T risponde al suo antigene affine determina l'equilibrio tra infezione e autoimmunità, omeostasi e cancro, salute e malattia¹. Ne consegue che lo studio delle cellule T in un contesto specifico di immunità dovrebbe concentrarsi sulle cellule con specificità per un antigene rilevante di interesse. Tra i progressi tecnologici che hanno notevolmente migliorato la capacità di caratterizzare popolazioni di cellule T antigene-specifiche vi sono multimeri solubili marcati in fluorescenza (solitamente tetrameri) di molecole di complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe I o di classe II complessate a epitopi peptidici antigenici, meglio noti come "tetrameri peptide:MHC"2,3,4,5 . Rappresentando i ligandi naturali dei recettori dell'antigene delle cellule T (TCR), i tetrameri peptide:MHC di classe I e II forniscono un mezzo per identificare direttamente le cellule T CD8⁺ e CD4⁺ antigene-specifiche, rispettivamente, all'interno del repertorio endogeno delle cellule T nel sistema immunitario senza la necessità di una risposta alla stimolazione dell'antigene in un test. I tetrameri rappresentano un approccio più elegante allo studio delle cellule T antigene-specifiche rispetto ai modelli di trasferimento adottivo delle cellule T transgeniche TCR⁶ e sono stati sempre più utilizzati per identificare popolazioni di cellule T estranee e auto-antigene-specifiche sia in modelli murini sperimentali che in malattie umane ^4,5.

Mentre i tetrameri possono facilmente identificare popolazioni ad alta frequenza di cellule T che si sono espanse in risposta alla stimolazione dell'antigene, il loro uso per le cellule T naive, auto-antigene-specifiche o di memoria è limitato dalle frequenze molto basse di queste popolazioni⁷. Il nostro gruppo e altri hanno sviluppato e reso popolari strategie di arricchimento magnetico basate su tetrameri che aumentano la sensibilità di rilevamento per consentire studi di queste popolazioni cellulari nei tessuti linfoidi di topo 8,9,10,11.

L'emergere di cellule T residenti nei tessuti in questo campo ha posto una maggiore enfasi sullo sviluppo di nuovi modi per studiare le cellule T nello spazio non linfoide. Come molte altre superfici mucose, le cellule T nei polmoni incontrano una serie di antigeni propri ed estranei derivati dall'epitelio ospite, dai microbi commensali e infettivi e dalle entità ambientali, compresi gli allergeni. L'analisi trascrizionale delle cellule T raccolte da tessuto non linfoide (NLT) dimostra un fenotipo simile alla memoria che ha un destino e una funzione tessuto-specifici unici, spesso diretti al traffico e all'omeostasi tissutale¹². Inoltre, le cellule T di memoria residenti nei tessuti (Trms) tendono ad essere più limitate clonalmente rispetto a quelle in circolazione¹³. Determinare come e perché gli antigeni guidano la residenza delle cellule T nella NLT è fondamentale per capire come il sistema immunitario protegge dalle infezioni, mantiene l'omeostasi dei tessuti e, a volte, si trasforma in autoimmunità. Tuttavia, sembra esserci un maggiore attrito tra le cellule T residenti nei tessuti dai polmoni rispetto ad altri NLT¹⁴. Di conseguenza, la capacità di identificare e caratterizzare le cellule T endogene del polmone con una data antigene-specificità è limitata dalla loro rarità intrinseca.

Combinando l'uso di tecniche di arricchimento cellulare basate su biglie magnetiche e la colorazione con tetramero peptide:MHC, siamo riusciti a rilevare cellule T auto-antigene specifiche espanse ma rare nei polmoni di topo^15,16. Qui, presentiamo una descrizione dettagliata di un protocollo che abbiamo ottimizzato per isolare e caratterizzare in modo affidabile qualsiasi rara popolazione di cellule T antigene-specifiche presente nei polmoni di topo (Figura 1). Questo protocollo incorpora una fase di colorazione degli anticorpi in vivo per distinguere le cellule T vascolari residenti nel tessuto¹⁷, seguita da due diversi metodi per l'elaborazione del tessuto polmonare per soddisfare la disponibilità di risorse. Questo è quindi seguito da una fase generale di arricchimento magnetico delle cellule T, dalla colorazione del tetramero e dall'analisi mediante citometria a flusso. La vitalità cellulare e la colorazione del tetramero sono ulteriormente migliorate in questo protocollo dall'aggiunta di aminoguanidina, che blocca l'apoptosi indotta dall'attivazione delle cellule T¹⁸ mediata dall'ossido nitrico sintasi (iNOS) e Dasatinib che limita la sottoregolazione del TCR¹⁹. Le fasi evidenziate in questo protocollo utilizzano tecniche comuni e reagenti prontamente disponibili, rendendolo accessibile a quasi tutti i ricercatori impegnati nell'immunologia delle cellule T di topo ed è altamente adattabile per una varietà di analisi a valle. Sebbene non sia probabile che le cellule T naive si trovino nei polmoni, riteniamo che questo protocollo sarà particolarmente utile per lo studio delle cellule T auto-antigene-specifiche e dei Trm nei polmoni.

Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro del protocollo. I polmoni vengono prelevati dai topi e dissociati in singole cellule. I campioni vengono successivamente arricchiti per le cellule T prima della colorazione con tetrameri peptide:MHC e anticorpi marcati con fluorescenza per l'analisi citofluorimetrica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

Le procedure descritte in questo protocollo sono approvate e sviluppate in conformità con le linee guida stabilite dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Massachusetts General Hospital, un programma di gestione degli animali accreditato dall'American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). Gli esperimenti sono stati eseguiti su topi maschi e femmine di 8-12 settimane su un background genetico C57BL/6 allevati e mantenuti nella struttura per animali MGH in specifiche condizioni prive di agenti patogeni.

1. Preparazione delle soluzioni madre

1. Preparare il tampone HEPES sciogliendo 10 mM di HEPES, 5 mM di KCl, 1,8 mM di CaCl₂, 150 mM di NaCl e 1 mM di MgCl₂ e regolare a pH 7,4.
2. Preparare 10 volte la soluzione madre di Liberase sciogliendo 700 μg/mL di terreno di Liberase Thermolysin (TM) (vedere la Tabella dei materiali) nella soluzione salina bilanciata di Hank con Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺ (vedere la Tabella dei materiali).
3. Preparare 10 volte la soluzione madre di aminoguanidina sciogliendo 100 mM di sale di amiguanidina emisolfato (vedi Tabella dei materiali) nella soluzione salina bilanciata di Hank con Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺ (vedi Tabella dei materiali).
4. Preparare il terreno completo degli aminoacidi del prosciutto d'aquila (EHAA) mescolando il terreno EHAA (vedere la tabella dei materiali) con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 100 U/mL di penicillina/streptomicina, 50 μg/mL di gentamicina, 2 mM di L-glutammina e 55 μM di 2-mercaptoetanolo.
   NOTA: Possono essere utilizzati anche altri comuni mezzi di comunicazione delle cellule T, come RPMI o DMEM.
5. Preparare il tampone di smistamento mescolando 1x PBS con FBS al 2% e azoturo di sodio allo 0,05%.
6. Preparare il blocco Fc diluendo l'anticorpo CD16/32 purificato anti-topo (vedere la tabella dei materiali) a 1:100 v/v nel tampone di smistamento.
7. Preparare la soluzione di digestione Liberase TM/DNasi aggiungendo 100 μg/mL di Liberase TM e 50 μg/mL di DNasi I (vedere la Tabella dei materiali) in terreno RPMI 1640 senza L-glutammina (vedere la Tabella dei materiali).
8. Preparare la miscela ketamina/xilazina aggiungendo 10 mg/mL di ketamina (vedere la Tabella dei Materiali) e 1 mg/mL di xilazina (vedere la Tabella dei Materiali) in soluzione salina normale (0,9% NaCl) (vedere la Tabella dei Materiali).

2. Generazione di sospensioni unicellulari dal tessuto polmonare tramite dissociatore tissutale automatizzato

1. Per ogni topo, preparare 4 mL di tampone HEPES ghiacciato in una provetta specializzata per dissociazione tissutale (vedere la Tabella dei materiali) e tenerlo in ghiaccio.
2. Anestetizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale di 150-200 μL di miscela ketamina/xilazina. Iniettare 1-3 μg di anticorpo CD45 anti-topo coniugato con fluorofori (vedere la Tabella dei materiali) diluito in 100 μL di soluzione fisiologica normale per via endovenosa in ciascun topo anestetizzato. Eutanasia nel topo 3 minuti dopo la somministrazione degli anticorpi con un'iniezione intraperitoneale di 500-600 μL di miscela ketamina/xilazina.
3. Resecare i polmoni e metterli nel rispettivo tubo dissociatore tissutale raffreddato su ghiaccio. Posizionare le provette sul dissociatore tissutale automatizzato (vedere Tabella dei materiali) ed eseguire il primo programma (programma preimpostato) per il tessuto polmonare.
4. Aggiungere 500 μL di soluzione madre di Liberase e 500 μL di soluzione madre di aminoguanidina a ciascuna provetta contenente il tessuto polmonare dissociato. Incubare su un miscelatore nutante per 30 minuti a 37 °C.
5. Riposizionare i tubi sul dissociatore ed eseguire il secondo programma (programma preimpostato) per il tessuto polmonare.
6. Versare la sospensione unicellulare dalla provetta dissociatrice tissutale attraverso un filtro cellulare da 100 μm (vedere la Tabella dei materiali) in una provetta conica da 50 mL. Sciacquare la provetta del dissociatore tissutale con 5 mL di EHAA completo (o qualsiasi terreno di coltura a cellule T equivalente) e farla passare attraverso il colino nella provetta da 50 mL.
7. Rimuovere il filtro e aumentare il volume della sospensione cellulare a 50 mL con EHAA completo. Centrifugare la sospensione cellulare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare con cura il surnatante, lasciando circa 100 μl di surnatante e pellet cellulare.
8. Aggiungere circa 100 μl di soluzione di blocco Fc per portare il volume totale fino a 200 μl e agitare energicamente per risospendere il pellet.

3. Protocollo alternativo: generazione di sospensioni unicellulari dal tessuto polmonare mediante dissociazione manuale

1. Per ogni topo, preparare 1 mL di EHAA completo in una provetta microfuge da 1,5 mL e conservare in ghiaccio.
2. Anestetizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale di 150-200 μL di miscela ketamina/xilazina. Iniettare 1-3 μg di anticorpo CD45 anti-topo coniugato con fluorofori diluito in 100 μL di soluzione fisiologica normale per via endovenosa in ciascun topo anestetizzato. Eutanasia nel topo 3 minuti dopo la somministrazione degli anticorpi con un'iniezione intraperitoneale di 500-600 μL di miscela ketamina/xilazina.
3. Resecare i polmoni e metterli nella rispettiva provetta per microfuge da 1,5 ml raffreddata su ghiaccio.
4. Una volta che tutti i polmoni sono stati prelevati, trasferire ciascun polmone in una nuova provetta per microfugi senza alcun mezzo cellulare.
5. Tagliare i polmoni in piccoli frammenti (~2-3 mm di pezzi) usando le forbici all'interno del tubo di microfuga.
6. Aggiungere 1 mL di cocktail digestivo Liberase TM/DNase I in ciascuna provetta.
7. Incubare per 30 minuti a 37 °C a bagnomaria. Rimettere i campioni nel ghiaccio per evitare una digestione eccessiva.
8. Versare il campione su un colino cellulare da 100 μm posizionato sopra una provetta conica da 50 mL. Schiacciare il tessuto contro la rete con l'estremità in gomma dello stantuffo da una siringa sterile da 1 ml.
9. Sciacquare il colino con un tampone selezionatore freddo, raccogliendo un volume finale di 7 mL nella provetta. Centrifugare la sospensione cellulare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare con cautela il surnatante, lasciando circa 100 μL di surnatante e pellet cellulare.
10. Aggiungere 100 μl di soluzione Fc Block per portare il volume totale fino a 200 μl e agitare energicamente per risospendere il pellet.

4. Arricchimento del campione polmonare per le cellule T tramite arricchimento di biglie magnetiche

1. Aggiungere 50 μl di microsfere CD90.2 anti-topo (vedere la tabella dei materiali). Agitare e incubare per 10 minuti a 4 °C.
   NOTA: CD90.2 corrisponde all'allele espresso dalle cellule T nei topi C57BL/6. Controllare il genotipo dell'allele se vengono utilizzati altri ceppi di topi.
2. Nel frattempo, posizionare una colonna di separazione cellulare paramagnetica (vedi Tabella dei materiali) su un magnete di separazione delle celle a una o quattro posizioni (vedi Tabella dei materiali). Posizionare una provetta conica aperta da 15 mL sotto ciascuna colonna per catturare il flusso. Adescare la colonna con 3 mL di tampone selezionatore a freddo, consentendo alla colonna di drenare per gravità nella provetta conica sottostante.
3. Una volta che le cellule sono state incubate con le microsfere per 10 minuti, aggiungere un tampone selezionatore a freddo a un volume di 1 mL e trasferire attraverso un colino cellulare da 100 μm posizionato sopra la colonna. Raccogliere il flusso della colonna in una provetta conica fresca da 15 mL posizionata sotto la colonna.
4. Una volta che la sospensione cellulare è stata completamente drenata attraverso la colonna per gravità, lavare la colonna risciacquando la provetta originale con altri 3 mL di tampone selezionatore a freddo e applicandolo alla colonna attraverso la rete, risciacquando così il filtro. Rimuovere il colino.
5. Quando il campione è di nuovo completamente drenato nella colonna e non esce più alcun flusso dalla colonna, rimuovere la colonna dal magnete e posizionarla sopra una provetta conica fresca da 15 mL.
6. Aggiungere 5 mL di tampone per lo smistamento a freddo alla colonna.
7. Eluire immediatamente le celle legate alla colonna spingendo lo stantuffo della colonna verso l'alto con un movimento continuo e forzando il tampone di selezione fuori dal fondo della colonna nella nuova provetta.
8. Centrifugare i campioni eluiti a 400 x g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare con cura il surnatante, lasciando circa 100 μl di surnatante e pellet cellulare.
9. Aggiungere 100 μl di tampone per selezionatrice a freddo per portare il volume totale fino a 200 μl e agitare energicamente per risospendere il pellet.
10. Analizzare il campione di flusso contenente la frazione di cella non legata, se lo si desidera.

5. Colorazione delle cellule T antigene-specifiche con tetrameri peptide:MHC

1. Aggiungere 1 μL di Dasatinib da 10 μM (vedere la Tabella dei materiali) a ciascun campione, agitare e incubare per 5 minuti a RT.
2. Aggiungere peptide:MHC coniugato con PE o APC a una concentrazione finale di 10 nM (o concentrazione empiricamente ottimizzata per un dato tetramero).
3. Vorticare e incubare al buio per 1 ora a RT (o tempo e temperatura ottimizzati empiricamente).

6. Analisi delle cellule T marcate con tetrameri mediante citometria a flusso

1. Mentre il campione viene colorato con i tetrameri peptide:MHC, preparare una miscela master di anticorpi per colorare i marcatori di superficie delle cellule (Tabella 1).
   NOTA: Evitare i fluorofori che entrano in conflitto con l'anticorpo CD45 somministrato per via endovenosa o con i tetrameri.
2. A 15 minuti dalla fine del periodo di incubazione per la colorazione con tetramero, aggiungere la miscela master di anticorpi di superficie a 1:100 (o concentrazione empiricamente ottimizzata) a ciascun campione.
3. Continuare a incubare al buio a RT per il resto del periodo di incubazione di 1 ora.
4. Aggiungere 50.000 microsfere per citometria a flusso (vedere la Tabella dei materiali) e aggiungere un tampone per selezionatrice a freddo fino a un volume finale di circa 5 mL. Centrifugare il campione colorato a 400 x g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare con cautela il surnatante, lasciando circa 100 μl di surnatante e pellet di cellule/perline.
5. Risospendere il campione con altri 200 μL di tampone di selezione e trasferire il campione in una provetta da 5 mL di smistamento cellulare attivato a fluorescenza (FACS).
6. Analizzare il campione su un citometro a flusso. Raccogli il maggior numero possibile di celle, fino a un massimo di 2.500.000 eventi totali. Assicurarsi che siano stati raccolti almeno 20.000 eventi di conteggio delle perline. Mantieni la velocità di acquisizione pari o inferiore a 5.000 eventi al secondo.
7. Salva tutti i dati come file FCS.

  

Fluorocromo	Anticorpo
BUV395	CD90.2
Blu Pacifico	CD45 (aggiunto in precedenza per iniezione endovenosa)
Arancio Pacifico	CD8
Viola Brillante 785	CD4
FITC	CD3
PerCP-Cy5.5	Scarico (B220, CD11b, CD11c, F4/80)
PE	tetramero pMHC o marcatore fenotipico
PE-Cy7	Marcatore fenotipico (es. CD44, PD-1, CD69, ecc.)
APC	tetramero pMHC o marcatore fenotipico
AlexaFluor 700	Marcatore fenotipico (es. CD44, PD-1, CD69, ecc.)
APC-Cy7	Macchia viva/morta

Tabella 1: Matrice di colorazione del campione. Un tipico pannello di anticorpi per citometria a flusso coniugati con fluorofori utilizzati per identificare e caratterizzare le cellule T antigene-specifiche.

7. Analisi dei dati

1. Analizzare i file di dati FCS utilizzando un software di citometria a flusso appropriato.
   1. Impostare una sequenza di porte di inclusione successive per identificare 1) eventi simili ai linfociti, 2) singoli, 3) vivi, 4) extravascolari, 5) negativi al dump e 6) CD90.2-positivi che sono CD4 o CD8 positivi (Figura 2).
   2. Identificare le cellule T tetramero-positive all'interno di queste popolazioni.
2. Determinare il numero assoluto di cellule tetrameri-positive calcolando il rapporto tra le perle aggiunte (50.000) e il numero di perle raccolte durante l'esecuzione del campione e moltiplicando il valore per il numero totale di cellule tetrameri-positive raccolte.
   

Risultati

La Figura 2 illustra la strategia di gating rappresentativa utilizzata nell'identificazione di rare cellule T CD4⁺ antigene-specifiche nei polmoni con tetrameri peptide:MHC di classe II. Lo stesso processo può essere applicato per le cellule T CD8⁺ antigene-specifiche con tetrameri peptide:MHC di classe I (dati non mostrati).

A causa dell'elevato numero di cellule non linfoidi nei polmoni, la rilevazione affidabile di cellule T rare antigene...

Discussione

Le precedenti caratterizzazioni delle cellule T antigene-specifiche dei polmoni hanno beneficiato del robusto numero di cellule T antigene-specifiche che si espandono a seguito di un evento di priming acuto come l'immunizzazione intranasale o l'infezione 20,21,22. Tuttavia, le popolazioni di cellule T più rare nei polmoni, come le cellule T auto-antigene-specifiche o le cellule T di memoria residenti nei tessuti, sono difficili...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm cell strainer	Fisher Scientific	22-363-549
10x PBS without Ca++ or Mg++	Corning	46-013-CM
1x PBS without Ca++ or Mg++	Corning	21-031-CV
AccuCheck Counting Beads	Invitrogen	PCB100
Aminoguanidine Hemisulfate Salt	Sigma-Aldrich	A7009
CD90.2 microbeads, mouse	Miltenyi	130-121-278
Cell separation magnet (MidiMACS Separator)	Miltenyi	130-042-302	Holds single LS column
Cell separation magnet (QuadroMACS Separator)	Miltenyi	130-090-976	Holds 4 LS columns
Dasatinib	Sigma-Aldrich	CDS023389
DNase I	Roche	10104159001
Eagle’s Ham’s Amino Acids medium	Sigma-Aldrich	C5572
gentleMACS	Miltenyi	130-093-235	Automated tissue dissociator
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237	Automated tissue dissociator tubes
Hank's Balanced Salt Solution with Ca++ or Mg++	Corning	21-020-CM
HEPES	Gibco	15630080
Ketamine	Vedco	NDC 50989-996-06
Liberase TM	Roche	5401119001
Pacific Blue anti-mouse CD45 antibody (Clone: 30-F11)	Biolegend	103126
Paramagnetic cell separation columns (LS Columns)	Miltenyi	130-042-401	Comes with plunger
Purified anti mouse CD16/32 antibody (Clone: 93)	Biolegend	101302
RPMI 1640 medium without L-glutamine	Corning	15-040-CM
Sodium Chloride 0.9% (Normal Saline)	Cytiva	Z1376
Xylazine	Pivetal	NDC 466066-750-02