Идентификация редких антиген-специфических Т-клеток из легких мышей с помощью пептид:Тетрамеры основного комплекса гистосовместимости

Резюме

Мы предоставляем подробный протокол для выделения и идентификации популяций редких антиген-специфических Т-клеток в легких мышей с помощью обогащения Т-клеток на основе магнитных гранул и тетрамеров комплекса пептида:главного комплекса гистосовместимости (MHC).

Аннотация

Идентификация и характеристика антиген-специфических Т-клеток в период здоровья и болезни остается ключом к улучшению нашего понимания иммунной патофизиологии. Технические проблемы отслеживания антиген-специфических популяций Т-клеток в эндогенном репертуаре Т-клеток значительно усложнились благодаря разработке реагентов пептида: тетрамера MHC. Эти флуоресцентно меченные растворимые мультимеры молекул MHC класса I или II, комплексованных с антигенными пептидными эпитопами, связываются непосредственно с Т-клетками с соответствующей специфичностью рецептора Т-клеток (TCR) и, следовательно, могут идентифицировать антиген-специфические популяции Т-клеток в их нативном состоянии без необходимости функционального ответа, индуцированного ex vivo стимуляция. Для чрезвычайно редких популяций Т-клетки, связанные с тетрамером, могут быть обогащены магнитами для повышения чувствительности и надежности обнаружения.

По мере углубления исследований тканевого резидентного Т-клеточного иммунитета существует насущная потребность в идентификации антиген-специфических Т-клеток, которые перемещаются и находятся в нелимфоидных тканях. В этом протоколе мы представляем подробный набор инструкций по выделению и характеристике антиген-специфических Т-клеток, присутствующих в легких мыши. Это включает в себя выделение Т-клеток из переваренной легочной ткани с последующим этапом общего магнитного обогащения Т-клеток и окрашивание тетрамерами для анализа и сортировки проточной цитометрии. Этапы, описанные в этом протоколе, используют общие методы и легкодоступные реагенты, что делает его доступным практически для любого исследователя, занимающегося иммунологией Т-клеток мышей, и хорошо адаптируется для различных последующих анализов любой популяции низкочастотных антиген-специфических Т-клеток, находящихся в легких.

Введение

В основе адаптивной иммунной системы лежит способность Т-клеток распознавать и реагировать на определенный антиген. Когда и где Т-клетка реагирует на родственный ей антиген, определяет баланс инфекции и аутоиммунитета, гомеостаза и рака, здоровья и болезни¹. Из этого следует, что изучение Т-клеток в конкретном контексте иммунитета должно быть сосредоточено на клетках, специфичных к соответствующему антигену, представляющему интерес. К числу технологических достижений, которые значительно расширили возможности по освидетельствованию антиген-специфических популяций Т-клеток, относятся флуоресцентно меченые растворимые мультимеры (обычно тетрамеры....

протокол

Процедуры, описанные в этом протоколе, одобрены и разработаны в соответствии с руководящими принципами, изложенными Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) Массачусетской больницы общего профиля, программой по содержанию животных, аккредитованной Американской ассоциацией по аккредитации ухода за лабораторными животными (AAALAC). Эксперименты проводились на 8-12-недельных самцах и самках мышей с генетическим фоном C57BL/6, выращенных и содержащихся в животноводческом хозяйстве MGH в специфических условиях, свободных от патогенов.

1. Приготовление исходных растворов

1. Приготовьте ....

Результаты

На рисунке 2 показана репрезентативная стратегия гейтирования, используемая при идентификации редких антиген-специфичных CD4⁺ Т-клеток в легких с тетрамеров класса II пептид:МНС. Тот же процесс может быть применен к антиген-специфичным CD8⁺ Т-клеткам с тетрамеро.......

Обсуждение

Предыдущая характеристика антиген-специфических Т-клеток из легких выиграла от значительного количества антиген-специфических Т-клеток, которые расширяются после острого прайминг-события, такого как интраназальная иммунизация или инфекция 20,21,22.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm cell strainer	Fisher Scientific	22-363-549
10x PBS without Ca++ or Mg++	Corning	46-013-CM
1x PBS without Ca++ or Mg++	Corning	21-031-CV
AccuCheck Counting Beads	Invitrogen	PCB100
Aminoguanidine Hemisulfate Salt	Sigma-Aldrich	A7009
CD90.2 microbeads, mouse	Miltenyi	130-121-278
Cell separation magnet (MidiMACS Separator)	Miltenyi	130-042-302	Holds single LS column
Cell separation magnet (QuadroMACS Separator)	Miltenyi	130-090-976	Holds 4 LS columns
Dasatinib	Sigma-Aldrich	CDS023389
DNase I	Roche	10104159001
Eagle’s Ham’s Amino Acids medium	Sigma-Aldrich	C5572
gentleMACS	Miltenyi	130-093-235	Automated tissue dissociator
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237	Automated tissue dissociator tubes
Hank's Balanced Salt Solution with Ca++ or Mg++	Corning	21-020-CM
HEPES	Gibco	15630080
Ketamine	Vedco	NDC 50989-996-06
Liberase TM	Roche	5401119001
Pacific Blue anti-mouse CD45 antibody (Clone: 30-F11)	Biolegend	103126
Paramagnetic cell separation columns (LS Columns)	Miltenyi	130-042-401	Comes with plunger
Purified anti mouse CD16/32 antibody (Clone: 93)	Biolegend	101302
RPMI 1640 medium without L-glutamine	Corning	15-040-CM
Sodium Chloride 0.9% (Normal Saline)	Cytiva	Z1376
Xylazine	Pivetal	NDC 466066-750-02