АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы предоставляем подробный протокол для выделения и идентификации популяций редких антиген-специфических Т-клеток в легких мышей с помощью обогащения Т-клеток на основе магнитных гранул и тетрамеров комплекса пептида:главного комплекса гистосовместимости (MHC).

Аннотация

Идентификация и характеристика антиген-специфических Т-клеток в период здоровья и болезни остается ключом к улучшению нашего понимания иммунной патофизиологии. Технические проблемы отслеживания антиген-специфических популяций Т-клеток в эндогенном репертуаре Т-клеток значительно усложнились благодаря разработке реагентов пептида: тетрамера MHC. Эти флуоресцентно меченные растворимые мультимеры молекул MHC класса I или II, комплексованных с антигенными пептидными эпитопами, связываются непосредственно с Т-клетками с соответствующей специфичностью рецептора Т-клеток (TCR) и, следовательно, могут идентифицировать антиген-специфические популяции Т-клеток в их нативном состоянии без необходимости функционального ответа, индуцированного ex vivo стимуляция. Для чрезвычайно редких популяций Т-клетки, связанные с тетрамером, могут быть обогащены магнитами для повышения чувствительности и надежности обнаружения.

По мере углубления исследований тканевого резидентного Т-клеточного иммунитета существует насущная потребность в идентификации антиген-специфических Т-клеток, которые перемещаются и находятся в нелимфоидных тканях. В этом протоколе мы представляем подробный набор инструкций по выделению и характеристике антиген-специфических Т-клеток, присутствующих в легких мыши. Это включает в себя выделение Т-клеток из переваренной легочной ткани с последующим этапом общего магнитного обогащения Т-клеток и окрашивание тетрамерами для анализа и сортировки проточной цитометрии. Этапы, описанные в этом протоколе, используют общие методы и легкодоступные реагенты, что делает его доступным практически для любого исследователя, занимающегося иммунологией Т-клеток мышей, и хорошо адаптируется для различных последующих анализов любой популяции низкочастотных антиген-специфических Т-клеток, находящихся в легких.

Введение

В основе адаптивной иммунной системы лежит способность Т-клеток распознавать и реагировать на определенный антиген. Когда и где Т-клетка реагирует на родственный ей антиген, определяет баланс инфекции и аутоиммунитета, гомеостаза и рака, здоровья и болезни1. Из этого следует, что изучение Т-клеток в конкретном контексте иммунитета должно быть сосредоточено на клетках, специфичных к соответствующему антигену, представляющему интерес. К числу технологических достижений, которые значительно расширили возможности по освидетельствованию антиген-специфических популяций Т-клеток, относятся флуоресцентно меченые растворимые мультимеры (обычно тетрамеры) молекул основного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I или класса II, интегрированные в антигенные пептидные эпитопы, более известные как «пептид: тетрамеры MHC»2,3,4,5 . Представляя собой естественные лиганды Т-клеточных антигенных рецепторов (TCR), тетрамеры пептида:MHC класса I и класса II обеспечивают средства для прямой идентификации антиген-специфических CD8+ и CD4+ Т-клеток соответственно в эндогенном репертуаре Т-клеток в иммунной системе без необходимости ответа на стимуляцию антигена в анализе. Тетрамеры представляют собой более элегантный подход к изучению антиген-специфичных Т-клеток, чем модели адаптивного переноса трансгенных Т-клеток TCR6, и все чаще используются для идентификации чужеродных и собственных антиген-специфических популяций Т-клеток как в экспериментальных моделях мышей, так и в моделях заболеваний человека 4,5.

В то время как тетрамеры могут легко идентифицировать высокочастотные популяции Т-клеток, которые разрослись в ответ на стимуляцию антигена, их использование для наивных, самоантиген-специфичных Т-клеток или Т-клеток памяти ограничено очень низкими частотами этихпопуляций. Наша группа и другие разработали и популяризировали стратегии магнитного обогащения на основе тетрамеров, которые увеличивают чувствительность обнаружения, что позволяет изучать эти клеточные популяции в лимфоидных тканях мышей 8,9,10,11.

Появление тканевых резидентных Т-клеток в этой области поставило повышенный акцент на разработку новых способов исследования Т-клеток в нелимфоидном пространстве. Как и многие другие поверхности слизистых оболочек, Т-клетки в легких сталкиваются с рядом собственных и чужеродных антигенов, полученных из эпителия хозяина, комменсальных и инфекционных микробов, а также объектов окружающей среды, включая аллергены. Транскрипционный анализ Т-клеток, полученных из нелимфоидной ткани (НЛТ), демонстрирует фенотип, подобный памяти, который несет уникальную тканеспецифическую судьбу и функцию, часто направленную на транспортировку и тканевый гомеостаз12. Более того, тканевые резидентные Т-клетки памяти (Trms), как правило, более клонально ограничены, чем те, которые находятсяв циркуляции. Определение того, как и почему антигены стимулируют проживание Т-клеток в NLT, имеет решающее значение для понимания того, как иммунная система защищает от инфекции, поддерживает гомеостаз тканей и, иногда, переходит в аутоиммунную систему. Тем не менее, по-видимому, наблюдается больший истирание среди тканевых резидентных Т-клеток легких по сравнению с другими NLT14. Соответственно, возможность идентификации и характеристики эндогенных Т-клеток легкого с заданной антиген-специфичностью ограничена присущей им редкостью.

Комбинируя использование методов обогащения клеток на основе магнитных шариков и окрашивание пептидом:тетрамером MHC, нам удалось обнаружить расширенные, но редкие аутоантиген-специфические Т-клетки в легких мышей15,16. В этой статье мы представляем подробное описание протокола, который мы оптимизировали для надежной изоляции и характеристики любой популяции редких антиген-специфических Т-клеток, присутствующих в легких мышей (Рисунок 1). Этот протокол включает в себя стадию окрашивания антителами in vivo для отличия резидентных в ткани Т-клеток от сосудистых Т-клеток17, за которыми следуют два различных метода обработки легочной ткани для учета имеющихся ресурсов. Затем следует этап общего магнитного обогащения Т-клеток, окрашивание тетрамером и анализ с помощью проточной цитометрии. Жизнеспособность клеток и окрашивание тетрамерами дополнительно усиливаются в этом протоколе за счет добавления аминогуанидина, который блокирует индуцируемый апоптоз Т-клеток, индуцируемый активацией оксида азота (iNOS)18, и дазатиниба, который ограничивает подавление TCR19. Этапы, описанные в этом протоколе, используют общие методы и легкодоступные реагенты, что делает его доступным практически для любого исследователя, занимающегося иммунологией Т-клеток мышей, и легко адаптируется для различных последующих анализов. Несмотря на то, что наивные Т-клетки вряд ли будут обнаружены в легких, мы считаем, что этот протокол будет особенно полезен для изучения собственных антиген-специфических Т-клеток и Trm в легких.

figure-introduction-5694
Рисунок 1: Обзор рабочего процесса протокола. Легкие собирают у мышей и диссоциируют на отдельные клетки. Образцы затем обогащают для Т-клеток перед окрашиванием тетрамисами пептида:МНС и флуоресцентно меченными антителами для проточного цитометрического анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

протокол

Процедуры, описанные в этом протоколе, одобрены и разработаны в соответствии с руководящими принципами, изложенными Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) Массачусетской больницы общего профиля, программой по содержанию животных, аккредитованной Американской ассоциацией по аккредитации ухода за лабораторными животными (AAALAC). Эксперименты проводились на 8-12-недельных самцах и самках мышей с генетическим фоном C57BL/6, выращенных и содержащихся в животноводческом хозяйстве MGH в специфических условиях, свободных от патогенов.

1. Приготовление исходных растворов

  1. Приготовьте буфер HEPES, растворив 10 мМ HEPES, 5 мМ KCl, 1,8 мМ CaCl2, 150 мМ NaCl и 1 мМ MgCl2, и доведите до pH 7,4.
  2. Приготовьте 10-кратный стоковый раствор либеразы, растворив 700 мкг/мл термолизиновой среды (ТМ) либеразы (см. Таблицу материалов) в сбалансированном солевом растворе Хэнка с Ca++ и Mg++ (см. Таблицу материалов).
  3. Приготовьте 10-кратный стоковый раствор аминогуанидина, растворив 100 мМ соли аминогуанидина гемисульфата (см. Таблицу материалов) в сбалансированном солевом растворе Хэнка с Ca++ и Mg++ (см. Таблицу материалов).
  4. Приготовьте полную среду Eagle's Ham's Aminoacids (EHAA), смешав среду EHAA (см. Таблицу материалов) с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 100 Ед/мл пенициллина/стрептомицина, 50 мкг/мл гентамицина, 2 мМ L-глутамина и 55 мкМ 2-меркаптоэтанола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно использовать другие распространенные среды для Т-клеток, такие как RPMI или DMEM.
  5. Приготовьте буфер для сортировщика, смешав 1x PBS с 2% FBS и 0,05% азидом натрия.
  6. Приготовьте Fc-блок, разбавив очищенное антитело против мыши CD16/32 (см. Таблицу материалов) при 1:100 v/v в буфере сортировщика.
  7. Приготовьте раствор для разложения Либераза ТМ/ДНКаза путем добавления 100 мкг/мл Либеразы ТМ и 50 мкг/мл ДНКазы I (см. Таблицу материалов) в среду RPMI 1640 без L-глютамина (см. Таблицу материалов).
  8. Приготовьте смесь кетамина/ксилазина, добавив 10 мг/мл кетамина (см. Таблицу материалов) и 1 мг/мл ксилазина (см. Таблицу материалов) в обычный физиологический раствор (0,9% NaCl) (см. Таблицу материалов).

2. Генерация суспензии одиночных клеток из легочной ткани с помощью автоматического диссоциатора тканей

  1. Для каждой мыши приготовьте 4 мл ледяного буфера HEPES в специализированной пробирке для диссоциации тканей (см. Таблицу материалов) и держите его на льду.
  2. Обезболивание мышей путем внутрибрюшинного введения 150-200 мкл смеси кетамина/ксилазина. Введите 1-3 мкг флуорофор-конъюгированного антитела против мыши CD45 (см. Таблицу материалов), разведенного в 100 мкл физиологического раствора, внутривенно каждой мыши, находящейся под наркозом. Усыпить мышь через 3 минуты после введения антител с внутрибрюшинным введением 500-600 мкл смеси кетамина/ксилазина.
  3. Резецируйте легкие и поместите их в соответствующие тканевые диссоциаторные трубки, охлажденные на льду. Поместите трубки на автоматический тканевый диссоциатор (см. Таблицу материалов) и запустите первую программу (предустановленную программу) для легочной ткани.
  4. Добавьте 500 мкл стокового раствора либеразы и 500 мкл стокового раствора аминогуанидина в каждую пробирку, содержащую диссоциированную легочную ткань. Выдерживать на смесителе в течение 30 минут при температуре 37 °C.
  5. Поместите трубки обратно на диссоциатор и запустите вторую программу (предустановленную программу) для легочной ткани.
  6. Вылейте одноклеточную суспензию из пробирки для диссоциатора тканей через клеточный фильтр 100 мкм (см. Таблицу материалов) в коническую пробирку объемом 50 мл. Промойте пробирку для диссоциатора тканей 5 мл полной EHAA (или любой эквивалентной Т-клеточной среды) и пропустите через ситечко в пробирку объемом 50 мл.
  7. Снимите ситечко и увеличьте объем клеточной суспензии до 50 мл с помощью полного EHAA. Центрифугируйте клеточную суспензию при 400 x g в течение 5 мин при 4 °C. Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость, оставляя после себя примерно 100 мкл надосадочной жидкости и клеточной гранулы.
  8. Добавьте примерно 100 μL раствора Fc Block, чтобы довести общий объем до 200 μL и энергично завихрите, чтобы повторно суспендировать гранулу.

3. Альтернативный протокол: получение суспензии одиночных клеток из легочной ткани путем ручной диссоциации

  1. Для каждой мыши приготовьте 1 мл полной EHAA в микрофуге объемом 1,5 мл и держите на льду.
  2. Обезболивание мышей путем внутрибрюшинного введения 150-200 мкл смеси кетамина/ксилазина. Введите 1-3 мкг флуорофор-конъюгированного антитела против мыши CD45, разведенного в 100 мкл нормального физиологического раствора, внутривенно каждой мыши, находящейся под наркозом. Усыпить мышь через 3 минуты после введения антител с внутрибрюшинным введением 500-600 мкл смеси кетамина/ксилазина.
  3. Резецируйте легкие и поместите их в соответствующую микрофужную пробирку объемом 1,5 мл, охлажденную на льду.
  4. После того, как все легкие будут собраны, перенесите каждое легкое в свежую микрофугальную пробирку без какой-либо клеточной среды.
  5. Разрежьте легкие на мелкие фрагменты (кусочки ~2-3 мм) с помощью ножниц внутри микрофуговой пробирки.
  6. Добавьте в каждую тюбик по 1 мл коктейля для пищеварения Liberase TM/DNase I.
  7. Выдерживать 30 минут при температуре 37 °C на водяной бане. После этого верните образцы на лед, чтобы предотвратить переваривание.
  8. Налейте образец через сетчатое фильтр размером 100 мкм, помещенное поверх конической пробирки объемом 50 мл. Разомните ткань о сетку резиновым концом поршня из стерильного шприца объемом 1 мл.
  9. Промойте сетчатое фильтр с помощью буфера холодного сортировщика, собрав итоговый объем 7 мл в пробирке. Центрифугируйте клеточную суспензию при 400 x g в течение 5 мин при 4 °C. Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость, оставляя примерно 100 мкл надосадочной жидкости и клеточной гранулы.
  10. Добавьте 100 μL раствора Fc Block, чтобы довести общий объем до 200 μL и энергично завихрите, чтобы ресуспендировать гранулу.

4. Обогащение образца легких на Т-клетки с помощью магнитных шариков

  1. Добавьте 50 мкл микрогранул CD90.2, противомышиных (см. Таблицу материалов). Вдохните и инкубируйте в течение 10 минут при 4 °C.
    Примечание: CD90.2 соответствует аллелю, экспрессируемому Т-клетками у мышей C57BL/6. Проверьте аллельный генотип, если используются другие линии мышей.
  2. Тем временем поместите парамагнитную разделительную колонку (см. Таблицу материалов) на одно- или четырехпозиционный разделительный магнит (см. Таблицу материалов). Поместите открытую коническую трубку объемом 15 мл под каждую колонну, чтобы улавливать поток. Заправьте колонну 3 мл буфера для холодной сортировки, чтобы колонна могла стекать под действием силы тяжести в коническую трубу внизу.
  3. После того, как клетки инкубируются с микрогранулами в течение 10 минут, добавьте холодный сортировочный буфер объемом 1 мл и пропустите через клеточное сетчатое фильтр размером 100 мкм, расположенное на вершине колонки. Соберите поток из колонны в свежую коническую трубку объемом 15 мл, расположенную ниже колонны.
  4. После того, как клеточная суспензия полностью прососалась через колонну под действием силы тяжести, промойте колонку, промыв исходную пробирку дополнительными 3 мл холодного буфера сортировщика и нанеся его на колонну через сетку, тем самым промыв сетчатое фильтр. Снимите ситечко.
  5. Когда образец снова полностью стекает в колонку и больше не будет протекать из колонки, снимите колонку с магнита и поместите ее на свежую коническую пробирку объемом 15 мл.
  6. Добавьте в колонку 5 мл буфера холодного сортировщика.
  7. Немедленно элюируйте ячейки, связанные с колонной, одним непрерывным движением вдавливая поршень колонны в верхнюю часть и выталкивая буфер сортировщика из нижней части колонны в новую трубку.
  8. Центрифугируйте элюированные образцы при давлении 400 x g в течение 5 мин при 4 °C. Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость, оставляя после себя примерно 100 мкл надосадочной жидкости и клеточной гранулы.
  9. Добавьте 100 μL буфера для холодной сортировки, чтобы довести общий объем до 200 μL и энергично завихрите, чтобы повторно суспендировать гранулу.
  10. При необходимости проанализируйте проточный образец, содержащий несвязанную фракцию клетки.

5. Окрашивание антиген-специфических Т-клеток тетрамерами пептид:МНС

  1. Добавьте 1 мкл 10 мкМ дазатиниба (см. Таблицу материалов) в каждый образец, вихрь и инкубируйте в течение 5 мин при RT.
  2. Добавьте PE- или APC-конъюгированный пептид:тетрамер MHC до конечной концентрации 10 нМ (или эмпирически оптимизированной концентрации для данного тетрамера).
  3. Сделайте вихрь и инкубируйте в темноте в течение 1 ч при RT (или эмпирически оптимизированном времени и температуре).

6. Анализ меченных тетрамером Т-клеток с помощью проточной цитометрии

  1. В то время как образец окрашивается тетрамеров пептида:МНС, готовят мастер-смесь антител для окрашивания поверхностных маркеров клеток (табл. 1).
    Примечание: Избегайте флуорофонов, которые конфликтуют с внутривенно вводимыми антителами к CD45 или тетрамерами.
  2. За 15 минут до окончания инкубационного периода для окрашивания тетрамером добавьте поверхностную смесь антител в соотношении 1:100 (или эмпирически оптимизированной концентрации) к каждому образцу.
  3. Продолжайте инкубацию в темноте в RT в течение оставшейся части 1-часового инкубационного периода.
  4. Добавьте 50 000 шариков проточной цитометрии (см. Таблицу материалов) и добавьте буфер холодного сортировщика до конечного объема около 5 мл. Центрифугируйте окрашенный образец при 400 x g в течение 5 минут при 4 °C. Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость, оставляя после себя около 100 μл надосадочной жидкости и клеточных/гранулированных гранул.
  5. Повторно суспендируйте образец с помощью дополнительного буфера для сортировки объемом 200 мкл и перенесите образец в пробирку для сортировки флуоресцентных активированных клеток (FACS) объемом 5 мл.
  6. Проанализируйте образец на проточном цитометре. Соберите как можно больше ячеек, максимум до 2 500 000 событий. Убедитесь, что собрано не менее 20 000 событий с количеством бусин. Поддерживайте скорость привлечения на уровне 5 000 событий в секунду или ниже.
  7. Сохраните все данные в виде файлов FCS.

  

ФлуорохромАнтитело
БУВ395КД90.2
Тихоокеанский синийCD45 (добавлен ранее при внутривенном введении)
Тихоокеанский апельсинСД8
Бриллиантовый фиолетовый 785СД4
ФИТКCD3
ПерХП-Cy5.5Дамп (B220, CD11b, CD11c, F4/80)
ПЭТетрамер pMHC или фенотипический маркер
ПЭ-CY7Фенотипический маркер (например, CD44, PD-1, CD69 и т.д.)
БТРТетрамер pMHC или фенотипический маркер
АлексаФлюор 700Фенотипический маркер (например, CD44, PD-1, CD69 и т.д.)
БТР-CY7Живое/мертвое пятно

Таблица 1: Образец матрицы окрашивания. Типичная панель антител флуорофор-конъюгированной проточной цитометрии, используемая для идентификации и характеристики антиген-специфических Т-клеток.

7. Анализ данных

  1. Проанализируйте файлы данных FCS с помощью соответствующего программного обеспечения для проточной цитометрии.
    1. Установите последовательность последовательных ворот включения, чтобы идентифицировать 1) лимфоцитоподобные, 2) одиночные, 3) живые, 4) экстраваскулярные, 5) дамп-отрицательные и 6) CD90.2-положительные события, которые являются либо CD4, либо CD8-положительными (рис. 2).
    2. Определите тетрамер-положительные Т-клетки в этих популяциях.
  2. Определите абсолютное количество тетрамеров-положительных клеток, рассчитав отношение добавленных гранул (50 000) к количеству гранул, собранных во время выборки, и умножив это значение на общее количество собранных тетрамеров-положительных клеток.
    figure-protocol-13459

Результаты

На рисунке 2 показана репрезентативная стратегия гейтирования, используемая при идентификации редких антиген-специфичных CD4+ Т-клеток в легких с тетрамеров класса II пептид:МНС. Тот же процесс может быть применен к антиген-специфичным CD8+ Т-клеткам с тетрамеро...

Обсуждение

Предыдущая характеристика антиген-специфических Т-клеток из легких выиграла от значительного количества антиген-специфических Т-клеток, которые расширяются после острого прайминг-события, такого как интраназальная иммунизация или инфекция 20,21,22.

Раскрытие информации

У авторов нет никаких противоречий для раскрытия.

Благодарности

Мы благодарим Л. Куна за техническую помощь в обработке тканей и производстве тетрамеров. Эта работа финансировалась Национальными институтами здравоохранения (R01 AI107020 и P01 AI165072 к J.J.M., T32 AI007512 к D.S.S.), Массачусетским консорциумом по готовности к патогенам (J.J.M) и Исполнительным комитетом по исследованиям Массачусетской больницы общего профиля (J.J.M.).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm cell strainerFisher Scientific22-363-549
10x PBS without Ca++ or Mg++Corning46-013-CM
1x PBS without Ca++ or Mg++Corning21-031-CV
AccuCheck Counting BeadsInvitrogenPCB100
Aminoguanidine Hemisulfate SaltSigma-AldrichA7009
CD90.2 microbeads, mouseMiltenyi130-121-278
Cell separation magnet (MidiMACS Separator)Miltenyi130-042-302Holds single LS column
Cell separation magnet (QuadroMACS Separator)Miltenyi130-090-976Holds 4 LS columns
DasatinibSigma-AldrichCDS023389
DNase IRoche10104159001
Eagle’s Ham’s Amino Acids mediumSigma-AldrichC5572
gentleMACSMiltenyi130-093-235Automated tissue dissociator
gentleMACS C TubesMiltenyi130-093-237Automated tissue dissociator tubes
Hank's Balanced Salt Solution with Ca++ or Mg++Corning21-020-CM
HEPESGibco15630080
KetamineVedcoNDC 50989-996-06
Liberase TMRoche5401119001
Pacific Blue anti-mouse CD45 antibody (Clone: 30-F11)Biolegend103126
Paramagnetic cell separation columns (LS Columns)Miltenyi130-042-401Comes with plunger
Purified anti mouse CD16/32 antibody (Clone: 93)Biolegend101302
RPMI 1640 medium without L-glutamineCorning15-040-CM
Sodium Chloride 0.9% (Normal Saline)CytivaZ1376
XylazinePivetalNDC 466066-750-02

Ссылки

  1. Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235 (2023).
  2. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  3. Crawford, F., Kozono, H., White, J., Marrack, P., Kappler, J. Detection of antigen-specific T cells with multivalent soluble class II MHC covalent peptide complexes. Immunity. 8 (6), 675-682 (1998).
  4. Nepom, G. T., et al. HLA class II tetramers: tools for direct analysis of antigen-specific CD4+ T cells. Arthritis Rheum. 46 (1), 5-12 (2002).
  5. Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
  6. Moon, J. J., et al. Tracking epitope-specific T cells. Nat Protoc. 4 (4), 565-581 (2009).
  7. Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. J Immunol. 188 (9), 4135-4140 (2012).
  8. Moon, J. J., et al. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).
  9. Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection. Immunity. 28 (6), 859-869 (2008).
  10. Kotturi, M. F., et al. Naive precursor frequencies and MHC binding rather than the degree of epitope diversity shape CD8+ T cell immunodominance. J Immunol. 181 (3), 2124-2133 (2008).
  11. Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. J Vis Exp. (68), e4420 (2012).
  12. Szabo, P. A., Miron, M., Farber, D. L. Location, location, location: Tissue resident memory T cells in mice and humans. Sci Immunol. 4 (34), 9673 (2019).
  13. Poon, M. M. L., et al. Tissue adaptation and clonal segregation of human memory T cells in barrier sites. Nat Immunol. 24 (2), 309-319 (2023).
  14. Zheng, M. Z. M., Wakim, L. M. Tissue resident memory T cells in the respiratory tract. Mucosal Immunol. 15 (3), 379-388 (2022).
  15. Legoux, F. P., et al. CD4+ T cell tolerance to tissue-restricted self antigens is mediated by antigen-specific regulatory T Cells rather than deletion. Immunity. 43 (5), 896-908 (2015).
  16. Shin, D. S., et al. Lung injury induces a polarized immune response by self-antigen-specific CD4(+) Foxp3(+) regulatory T cells. Cell Rep. 42 (8), 112839 (2023).
  17. Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nat Protoc. 9 (1), 209-222 (2014).
  18. Vig, M., et al. Inducible nitric oxide synthase in T cells regulates T cell death and immune memory. J Clin Invest. 113 (12), 1734-1742 (2004).
  19. Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
  20. Hogan, R. J., et al. Protection from respiratory virus infections can be mediated by antigen-specific CD4(+) T cells that persist in the lungs. J Exp Med. 193 (8), 981-986 (2001).
  21. Hogan, R. J., et al. Activated antigen-specific CD8+ T cells persist in the lungs following recovery from respiratory virus infections. J Immunol. 166 (3), 1813-1822 (2001).
  22. Zhao, J., et al. Airway memory CD4(+) T cells mediate protective immunity against emerging respiratory coronaviruses. Immunity. 44 (6), 1379-1391 (2016).
  23. Hondowicz, B. D., et al. Interleukin-2-dependent allergen-specific tissue-resident memory cells drive asthma. Immunity. 44 (1), 155-166 (2016).
  24. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. J Vis Exp. (29), e1266 (2009).
  25. Faustino, L. D., et al. Interleukin-33 activates regulatory T cells to suppress innate gammadelta T cell responses in the lung. Nat Immunol. 21 (11), 1371-1383 (2020).
  26. Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies. Methods Mol Biol. 1784, 69-76 (2018).
  27. Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
  28. Naeher, D., et al. A constant affinity threshold for T cell tolerance. J Exp Med. 204 (11), 2553-2559 (2007).
  29. Moon, J. J., et al. Quantitative impact of thymic selection on Foxp3+ and Foxp3- subsets of self-peptide/MHC class II-specific CD4+ T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (35), 14602-14607 (2011).
  30. Koehli, S., Naeher, D., Galati-Fournier, V., Zehn, D., Palmer, E. Optimal T-cell receptor affinity for inducing autoimmunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (48), 17248-17253 (2014).
  31. Zhang, Z., Legoux, F. P., Vaughan, S. W., Moon, J. J. Opposing peripheral fates of tissue-restricted self antigen-specific conventional and regulatory CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 50 (1), 63-72 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены