通过剖腹手术对后备母猪进行胚胎移植手术

摘要

该方案描述了 用于通过 剖腹手术在后备母猪中移植克隆猪胚胎的手术技术的应用。

摘要

该协议旨在演示将克隆猪胚胎转移到输卵管的手术技术，输卵管是一种广泛用于生产用于生物医学研究的转基因猪的方法。9 头后备母猪接受了激素同步和剖腹手术，以将体细胞核移植 （SCNT） 产生的克隆胚胎在第 2 天以多达 4 个细胞的阶段转移到输卵管。转移手术后 30 天 通过 超声检查进行妊娠诊断。9 头手术后备母猪中有 6 头在超声检查中表现出妊娠迹象。然而，由于通过回声造影评估胎儿发育没有进展，因此后备母猪在 60 天时进行了尸检，以收集生物材料和评估生殖系统。在子宫角、卵巢和输卵管中观察到粘连。从其中两头安乐死后备母猪的子宫腔中，获得了 1 和 4 个胎龄在 12 至 20 天之间的胚胎结构。尽管没有活仔猪，这可能是由于克隆猪胚胎的移植效率低，这受多种因素的影响，包括移植胚胎的数量和质量，但所提出的手术技术被证明是快速和安全的。

引言

猪是生物医学研究的优秀实验模型，因为它们在解剖学、生理学和遗传学上与人类相似¹。这些动物经常用于与异种移植相关的研究，目的是产生器官、细胞或组织，当移植到人类体内时，这些器官、细胞或组织会促进排斥反应的低风险。异种移植研究旨在增加人类移植的器官供应，从而减少患者的等待名单²。

用于异种移植的猪的生产涉及几个步骤，包括从基因编辑猪细胞生产克隆。在 体外 产生转基因克隆胚胎后，胚胎以同步的发情周期转移到母猪的生殖系统，为子宫生理学的接收和孕育新概念³ 做好准备。

猪的胚胎移植可以通过非侵入性或侵入性方法进行⁴。非侵入性方法包括经宫颈移植，它不需要任何手术干预。然而，这种方法仅限于在发育后期（即桑椹或囊胚阶段）移植胚胎，并且不允许精确确定导管插入部位或胚胎沉积⁵。腹腔镜检查和剖腹手术被认为是侵入性胚胎移植方法。腹腔镜检查侵入性较小，但需要特定且昂贵的设备，并且由于各种因素（例如难以操纵生殖结构和使用的导管类型）其效率差异很大（从不到 20% 到超过 80%）^4,6。因此，与通过剖腹手术的手术转移方法相比，通过腹腔镜进行的转移仍然效率较低⁴。

通过剖腹手术对母猪进行胚胎移植手术是一种相对简单和快速的手术，通常需要约 30 分钟。但是，它应该在配备吸入麻醉设备和专业团队的手术中心进行。对于商品猪品系（如长白猪、大白猪或其杂交品种），由于动物的体重相当大（约 130-150 公斤），因此需要特殊设备，如用于提升后备母猪的升降机和宽而坚固的手术台。

为了使手术成功，必须事先评估胚胎的发育阶段。建议将最多 4 个细胞的胚胎移植到子宫管中。超过 4 个细胞阶段的胚胎，例如桑椹和囊胚，应转移到子宫角 ^7,8。

尽管世界各地的研究小组都在进行转基因克隆猪胚胎的生产和手术转移，但仍然没有明确的方案通过视频来演示这一程序。这种方法对于妊娠的成功至关重要，因为该技术需要将胚胎精确沉积在输卵管的确切位置，包括定位输卵管口和引入包含胚胎的移液管。通过整个过程的解释性视频，可以更好地理解这种技术。因此，本文旨在演示将克隆胚胎转移到后备母猪输卵管的剖腹手术，这是未来生产用于异种移植或其他相关目的的转基因猪的重要先决条件。

研究方案

这项研究得到了圣保罗大学兽医和动物科学学院动物使用研究伦理委员会的批准，协议编号 6088030523。来自巴西圣保罗州伊图市 Água Branca 核心猪养殖场的 9 头 7 个月大的后备母猪在第二次发情检测后立即使用⁹。材料 表中列出了研究中使用的试剂和设备的详细信息。

1. 动物准备

1. 在手术前将动物禁食 12 小时并限制饮水 4 小时。
2. 使用 40 毫米 x 12 毫米的针头，在同一个 10 mL 注射器中吸取 0.2 mg/kg 氯胺酮和 50 mg/kg 咪达唑仑。将注射器连接到静脉注射装置上，以方便给药，与动物保持安全距离并允许其自由移动。
3. 通过肌肉注射到斜方肌中，在外耳道的尾部，给予麻醉前药物。
4. 用 20 G 导管插管耳静脉，并将其连接到用于术中液体治疗的大滴注给药装置，以 10 mL/kg/h 的速率使用 0.9% NaCl 溶液。
5. 静脉注射 4 mg/kg 异丙酚诱导麻醉（遵循机构批准的方案）。
6. 使用喉镜和带有袖带¹⁰ 的 9 号经口气管插管对动物进行经口气管插管。
7. 吸入 1.5% 至 2% 异氟醚维持麻醉。此外，通过评估生理参数来监测麻醉，例如心率（应保持在每分钟 100 至 120 次之间）、氧饱和度（应保持在 99% 至 100% 之间）、肌肉松弛、无运动和反射评估。
   注意:还应监测和控制体温，保持在 37.5-38.5 °C 之间。 必要时，除了异氟醚外，还可以使用异丙酚来维持对参数的控制。盐酸芬太尼应作为镇痛药以每 20 分钟 0.02 mg/kg 的剂量给药。所有参数应每 5 分钟记录一次。
8. 围手术期镇痛，单剂量 0.002 mg/kg 芬太尼静脉注射，4 mg/kg 盐酸曲马多肌肉注射到臀肌或斜方肌中。
9. 将心脏电极放在胸部区域，用于术中监测心率。每 5 分钟记录一次心率、直肠温度和血氧饱和度。

2. 外科手术

1. 将后备母猪放在手术台上，背卧。
2. 用手术手套盖住动物的腿，以尽量减少对手术区域的污染。
3. 使用手术剪刀在倒数第二对乳腺之间进行腹侧尾腹部脱毛。
4. 使用浸渍氯己定的消毒刷进行术前皮肤消毒，从脐疤痕区域到最后一对乳腺做圆周运动。用干净、湿润的敷料去除洗必泰。
5. 确保外科医生和助手进行手术消毒，并穿着无菌手术衣和手套进行手术。
   注意:动物应在与手术部位分开的准备区域准备手术。
6. 使用 材料表中列出的适当且先前消毒过的器械准备手术台。
7. 使用无菌纱布和洗必泰消毒剂进行最后的手术野消毒，以鱼骨状清洁该区域，从切口部位开始向侧面扩展。
8. 用洗必泰消毒剂重复此过程 3 次，然后用酒精洗必泰重复该过程。
9. 用无菌手术单完全覆盖动物，如果悬垂没有开窗，则用剪刀在手术单上创建一个大约 10 x 20 cm² 的矩形开口。
10. 将手术单放在倒数第二对腹股沟乳腺上。放置 4 个 Backhaus 夹子，将手术窗帘固定在动物的皮肤上。
11. 用手术刀切开皮肤，切开约 10 厘米长的切口。
12. 使用止血钳和/或尺寸为 2 的可吸收缝线实现皮下血管止血。
13. 用手指或借助细剪刀解剖皮下组织，加深切口以到达腹部肌肉组织中的 白线 。
    注意:触诊腹部中线，感觉白线是一个更坚硬和纤维化的区域;观察腹直肌的分离，并在解剖时注意组织稠度的变化，以准确识别 白线 ¹¹。
14. 用 Allis 镊子抓住肌肉组织并抬起它，用手术刀在 白线 上做一个刺切口。
15. 将食指插入切口以评估是否存在粘连。小心地用钝/钝或细/钝剪刀将切口延伸到白线的尾部和颅骨上，以避免伤害其他器官和底层结构。
16. 做一个足够长的切口，以便外科医生的一只手可以插入腹腔，以定位和切除子宫角和/或卵巢。Gosset 牵开器可用于促进进入腹腔并在手术结束时将肌肉组织缝合成单层。
17. 如果其中一个子宫角位于卵巢之前，请轻轻跟随它，直到到达子宫角尖端和同侧卵巢。在此过程中，评估子宫内是否存在液体，这可能会影响妊娠。
18. 找到卵巢后，轻轻拉动它并小心地露出它。评估排卵前卵泡、出血性黄体、环状黄体和白色体的存在，以评估后备母猪的同步是否符合预期。
19. 轻轻去除覆盖卵巢的子宫管菌毛，外翻其粘膜，并找到子宫管的开口。
    注意:如果外科医生发现难以识别菌毛的开口，可以用圆体缝合针在输卵管壶腹上做一个口袋，避免刺穿血管，以插入含有胚胎的 Tomcat 导管。
20. 小心地将含有胚胎的 Tomcat 导管插入菌毛口，直到到达子宫管的壶腹区域。
21. 将 1 mL 注射器连接到 Tomcat 导管上，将含有胚胎的液体推入子宫管。用菌毛覆盖卵巢并将其放回腹腔。
22. 找到对侧子宫角和卵巢，然后重复步骤 2.17-2.21。
23. 重新定位腹腔内的结构，并加入 1 L 生理盐水或加热 （39 °C） 的乳酸林格氏液，以防止粘连，然后再开始腹部小位按摩。
24. 用 2 号的可吸收缝合线缝合腹部肌肉组织，"X"针（Sultan）中断。
25. 使用尺寸为 2 的可吸收缝合线，用连续的床垫缝合线接近皮下组织。
26. 用 2 号尼龙缝合线在中断的简单缝合、手术订书钉或氰基丙烯酸乙酯粘合剂中闭合皮肤。在此过程中，我们选择了使用粘合剂。
27. 用蘸有过氧化氢的纱布清洁手术伤口，然后用热敷布擦干，以增强手术胶粘剂在手术伤口上的固定。涂抹利福霉素或 Pearson 软膏，用纱布覆盖，最后涂抹手术粘合剂。
    注意:伤口应用敷料保持闭合 5 天。

3. 术后护理

1. 根据 Luna 等人 ¹² 提出的量表，至少在接下来的 3 天内评估动物的特征性临床疼痛迹象。
   注意:该量表基于猪在经历不同程度的疼痛时表现出的不同行为，例如姿势、互动和对环境的兴趣、活动、食欲和对受影响区域的关注。对于评估的每个参数，分数范围从 0 到 3，具体取决于所表现出的行为类型。在评估结束时，所有分数的总和反映了动物所经历的疼痛强度，其中 0 表示没有疼痛，18 表示非常剧烈的疼痛¹²。
2. 单剂量 15 mg/kg 阿莫西林和 0.4 mg/kg 2% 美洛昔康均肌肉注射（在臀肌或颈肌中），每天一次，持续 3 天作为术后护理，以防止疼痛、炎症过程和感染。
   注意:如果疼痛评分等于或大于所使用的疼痛量表（评分从 0 到 18）的 6，除了抗炎药和抗生素外，每天一次肌肉注射 5,000 毫克/动物的安乃近钠（在臀肌或颈肌中）。或者，按照当地 IACUC 指南中的概述进行镇痛。
3. 手术后第 6 天，用浸泡在 2% 酒精洗必泰溶液中的纱布去除用于伤口清洁的手术粘合剂，并局部涂抹皮尔逊软膏，直到第 10 天，此时建议使用缝合线或手术缝合钉。

4. 妊娠的超声妊娠诊断

1. 胚胎移植手术后 30 天使用超声设备（频率范围 4.5 至 8.5 MHz）进行经腹妊娠超声评估。
2. 将超声凝胶涂抹在探头上，并将其放置在腹股沟腹部区域附近，面向内侧。
   注意:由于子宫腔中的液体，圆形无回声胚胎囊泡的可视化表明妊娠。宫内液不可见，或存在宫内液但未描绘胚胎囊泡，提示无妊娠。

5. 动物的安乐死

注意:对超声检查中没有出现与胎龄相对应的大小和外观胎儿的后备母猪实施安乐死。

1. 使用 40 毫米 x 12 毫米的针头，在连接到静脉给药装置的同一 50 mL 注射器中抽取 15 mg/kg 氯胺酮和 2 mg/kg 咪达唑仑，并肌肉注射到外耳道尾部颈部区域的斜方肌中，作为麻醉前药物。
2. 用 20 G 导管插管耳静脉，并在推注中静脉内用 4 mg/kg 异丙酚诱导麻醉，直至发生心动过缓（遵循机构批准的方案）。
3. 随后，静脉注射 10 至 20 mL 19.1% 氯化钾。通过将听诊器放在心脏区域上，观察无呼吸运动、粘膜苍白、角膜反射消失和无心跳，确认心肺骤停。
4. 从尸检的雌性¹³ 收集任何类型的宫内内容物（胚胎组织、液体或粘液分泌物），并将其转发用于微生物分析，以检测可能的病原体，以及用于克隆的基因型表征（如果需要）。目视检查黄体、卵巢囊肿、异常分泌物以及子宫、卵巢和输卵管粘连的发生¹⁴。

结果

本文旨在演示将克隆胚胎移植到后备母猪输卵管的剖腹手术。所有动物都保持在适当的麻醉平面内，在麻醉恢复期间没有任何术中事件或并发症。手术后，后备母猪平均需要 2-3 小时才能站起来。

所有外科手术平均持续 44 分钟。9 头后备母猪接受了手术，平均每头后备母猪移植 185 个克隆胚胎，双侧移植的胚胎总数为 1,664 个（表 1）。卵?...

讨论

所描述的手术方法以前已由其他从事克隆猪或转基因克隆猪生产的研究小组进行过，有报告称实施该技术后出生 15,16,17,18,19,20。由各种细胞系产生的 SCNT 胚胎的怀孕率和出生率约为 20%-30%（自 2017 年以来的 264 次转移中），?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mL straw	generic	-	Surgical material
1 mL syringe	Descarpack	341001	Surgical material
10 mL syringe	Descarpack	324601	Surgical material
20 mL syringe	Descarpack	324801	Surgical material
3 mL syringe	Descarpack	324201	Surgical material
5 mL syringe	Descarpack	324401	Surgical material
60 mL syringe	Descarpack	323201	Surgical material
9 mm endotracheal tube	Rusch	112482-000090	Surgical material
Allis forceps	generic	-	Surgical instrument
Amox LA	JA Saúde Animal	MAPA registration: 8.781/2004	Pharmaceutical drug
Bakhaus forceps	generic	-	Surgical instrument
Catheter 20G	Descarpack	362401	Catheter for intravenous access
Cetamin	Agener União	MAPA registration: SP-000292-5.000011	Anesthetic
Conductive clinical gel	RMC	ANVISA registration: 80122200013	Surgical material
Dipyrone D-500	Zoetis	MAPA registration: SP0000728-46	Pharmaceutical drug
Disposable scalpel n. 22	Wiltex	ANVISA registration: 10150470565	Surgical instrument
Disposable sterile sponge-brush	Rioquimica	7.89778E+12	Surgical asepsis
Easy-Scan:Go	IMV	ESCG01	Ultrasound
Endozime AW Plus	Ruhof	34514	Detergent for surgical instruments
Fentanil (Fentanest)	Cristália	ANVISA registration: 1029800810159	Anesthetic
Gosset retractor	generic	-	Surgical instrument
Halstead-mosquito hemostatic forceps	generic	-	Surgical instrument
Healing ointment - Unguento Pearson	Pearson SA	MAPA registration: SP0000094-16	Pharmaceutical drug
hydrogen peroxide solution	Rioquimica	ANVISA registration: 218690015	Surgical material
Isofluorane	Biochimico	ANVISA registration: 100630222	Anesthetic
IV Drip set extensor	generic	-	Fluid therapy
IV Macro drip set	Descarpack	410301	Fluid therapy
Lactofur (ceftiofur)	Ourofino SA	MAPA registration: SP0000051-50	Pharmaceutical drug
Laringoscope	-	-	Surgical instrument
Maxicam 2%	Ourofino SA	MAPA registration: SP0000051-69	Pharmaceutical drug
Micropore adhesive 5 cm x 10 cm	generic	1530	Surgical material
Midazolam	Hipolabor	ANVISA registration: 1134301430035	Anesthetic
Multi-Way IV Infusion Set	Descarpack	413201	Fluid therapy
Needle 40 mm x 1.2 mm	Descarpack	353601	Sterile needle for applying medicines and anesthetics.
Needle 40 mm x 1.6 mm	Wiltex	ANVISA registration: 10150470664	Sterile needle for applying medicines and anesthetics.
Needle holder	generic	-	Surgical instrument
Nylon 2 suture trhead	Shalon Medical	N502CTI40	Surgical material
Ordinary pen	generic	-	Regular pen for taking notes
Physiological solution 0.9% 500 mL bag	JP Farma	MS:1.0491.0070	Fluid therapy
Polyglycolic acid 2 suture thread	Atramat	G4099-75H	Surgical material
Potassium chloride	Samtec	ANVISA registration: 1559200010139	Parenteral drug
Procedure gloves	Descarpack	122401	Personal Protective Equipment (PPE)
Propofol (Provive)	União Química	ANVISA registration: 1049714490057	Anesthetic
Ringer lactate solution 500 mL bag	JP Farma	MS:1.0491.0061	Fluid therapy
Riohex 0.5% clorexidine alcohol solution	Rioquimica	218690356	Surgical asepsis
Riohex 2% clorexidine solution with surfactant	Rioquimica	218690356	Surgical asepsis
Scalp 21 G	Descarpack	421201	Surgical material
Shoe covers	generic	-	Personal Protective Equipment (PPE)
Sterile compresses	Cremer	ANVISA registration: 10071150065	Surgical material
Sterile gauze pad	Procitex	ANVISA registration: 80245210083	Surgical material
Sterile surgical drapes 140 cm x 90 cm	Venkuri	7010003	Surgical material
Sterile surgical drapes 150 cm x 190 cm	PolarFix	F00208	Surgical material
Sterile surgical gloves	Mucambo	CA: 39.317	Personal Protective Equipment (PPE)
Stethoscope	generic	-	Surgical equipment
Surgical cap	Descarpack	93201	Personal Protective Equipment (PPE)
Surgical gown	Descarpack	231101	Personal Protective Equipment (PPE)
Surgical mask	Descarpack	110701	Personal Protective Equipment (PPE)
Surgical scissors blunt-blunt	generic	-	Surgical instrument
Surgical scissors sharp-sharp	generic	-	Surgical instrument
Surgical stapler	Tradevet	-	Surgical material
Tekbond super glue	Tek Bond	78072720030	Surgical material
Thermometer	generic	-	Surgical equipment
Three Way Stopcock	Solidor	374	Surgical material
Tramadol hydrocloride	Agener União	MAPA registration: SP-000292-5.000002	Anesthetic
Transparent film dressing	Skinupper	ANVISA registration: 82307460014	Surgical material
Waterproof adhesive 10 cm x 4.5 cm	generic	364828	Surgical material