Операция по переносу эмбрионов с помощью лапаротомии у свинок

Резюме

В этом протоколе описывается применение хирургической техники, используемой для переноса клонированных эмбрионов свиней с помощью лапаротомии у свинок.

Аннотация

Этот протокол направлен на демонстрацию хирургической техники переноса клонированных эмбрионов свиньи в яйцевод, метода, широко используемого в производстве генетически модифицированных свиней для биомедицинских исследований. Девяти свинкам была проведена гормональная синхронизация и лапаротомия для переноса клонированных эмбрионов, полученных путем переноса ядра соматических клеток (SCNT) на стадии до 4 клеток на 2-й день в яйцевод. Гестационная диагностика проводилась с помощью ультразвукового исследования через 30 дней после операции. У шести из девяти оперированных свинок при ультразвуковом исследовании были обнаружены признаки беременности. Однако, поскольку не было никакого прогресса в развитии плода, оцененного с помощью эхографии, свинкам было проведено вскрытие через 60 дней для сбора биологического материала и оценки репродуктивной системы. Спайки наблюдались в рогах матки, яичниках и яйцеводах. Из просвета матки двух усыпленных свинок были получены одна и четыре эмбриональные структуры с гестационным возрастом от 12 до 20 дней. Несмотря на отсутствие живых поросят, вероятно, объясняющееся низкой эффективностью переноса клонированных эмбрионов свиней, на которую влияют различные факторы, в том числе количество и качество переносимых эмбрионов, представленная хирургическая методика оказалась быстрой и безопасной.

Введение

Свиньи являются отличной экспериментальной моделью для биомедицинских исследований из-за их анатомического, физиологического и генетического сходства^{с человеком.} Эти животные часто использовались в исследованиях, связанных с ксенотрансплантацией, с целью получения органов, клеток или тканей, которые способствуют низкому риску отторжения при трансплантации человеку. Исследования в области ксенотрансплантации направлены на увеличение поставок органов для трансплантации человеку, тем самым сокращая лист ожидания пациентов².

Производство свиней для ксенотрансплантации включает в себя несколько этапов, в том числе получение клонов из генетически отредактированных клеток свиней. После производства in vitro генетически модифицированных клонированных эмбрионов эмбрионы переносятся в репродуктивную систему свиноматки с синхронизированным эстральным циклом для подготовки физиологии матки к приему и вынашиванию нового зачатия³.

Перенос эмбрионов у свиней может быть выполнен неинвазивными или инвазивными методами⁴. К числу неинвазивных методов относится трансцервикальная пересадка, которая не требует хирургического вмешательства. Однако этот метод ограничен переносом эмбрионов на более поздних стадиях развития (т.е. на стадиях морулы или бластоцисты) и не позволяет точно определить место введения катетера или отложения эмбриона^. Лапароскопия и лапаротомия считаются инвазивными методами переноса эмбрионов. Лапароскопия менее инвазивна, но требует специального и дорогостоящего оборудования, а ее эффективность значительно варьируется (от менее чем 20% до более чем 80%) из-за различных факторов, таких как сложность манипуляций с репродуктивными структурами и тип используемого катетера ^4,6. Таким образом, перенос с помощью лапароскопии все еще менее эффективен по сравнению с хирургическими методами переноса с помощью лапаротомии⁴.

Операция по переносу эмбрионов у свиноматок с помощью лапаротомии является относительно простой и быстрой процедурой, обычно занимающей около 30 минут. Однако она должна проводиться в хирургическом центре, оснащенном аппаратом для ингаляционной анестезии и специализированной бригадой. Для коммерческих пород свиней (таких как ландрасы, крупные белые или их помеси) необходимо специальное оборудование, такое как подъемники для подъема свиней и широкий, прочный хирургический стол из-за значительного веса животных (около 130-150 кг).

Чтобы операция прошла успешно, эмбрионы должны быть предварительно оценены на стадии их развития. Эмбрионы до 4 клеток рекомендуется переносить в маточную трубу. Эмбрионы на стадиях выше 4 клеток, такие как морулы и бластоцисты, должны быть перенесены в рог матки ^7,8.

Несмотря на то, что исследовательские группы по всему миру занимаются производством и хирургическим переносом генетически модифицированных клонированных эмбрионов свиней, до сих пор нет четко определенных протоколов, демонстрирующих эту процедуру с помощью видео. Этот подход имеет решающее значение для успеха гестации, так как этот метод требует точного размещения эмбрионов в точном месте яйцевода, включая локализацию устья труб и введение пипетки, содержащей эмбрионы. Эту технику можно лучше понять с помощью поясняющих видеороликов обо всей процедуре. Таким образом, цель данной статьи – продемонстрировать лапаротомическую операцию по переносу клонированных эмбрионов в яйцевод свинок, что является важной предпосылкой для будущего производства генетически модифицированных свиней, которые будут использоваться для ксенотрансплантации или других связанных с этим целей.

протокол

Данное исследование было одобрено Этическим комитетом по использованию животных в научных исследованиях Колледжа ветеринарной медицины и зоотехнии Университета Сан-Паулу, протокол No 6088030523. Девять семимесячных свинок из свинофермы Água Branca, расположенной в городе Иту, штат Сан-Паулу, Бразилия, были использованы сразу после обнаружения второй течки⁹. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованном в исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка животных

1. Голодайте животных в течение 12 часов и ограничьте доступ к воде в течение 4 часов перед хирургической процедурой.
2. С помощью иглы размером 40 мм x 12 мм наберите 10 мг/кг кетамина и 0,2 мг/кг мидазолама в тот же шприц объемом 50 мл. Прикрепите шприц к набору для внутривенного введения, чтобы облегчить введение лекарства, сохраняя безопасную дистанцию от животного и позволяя ему свободно двигаться.
3. Вводите препарат перед анестезией путем внутримышечной инъекции в трапециевидную мышцу, каудально к наружному слуховому проходу.
4. Канюлировать ушную вену с помощью катетера 20 G и подключить ее к набору для введения макрокапель для интраоперационной инфузионной терапии 0,9% раствором NaCl со скоростью 10 мл/кг/ч.
5. Ввести анестезию с помощью 4 мг/кг пропофола внутривенно (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).
6. Проводят оротрахеальную интубацию животного с помощью ларингоскопа и оротрахеальной трубки размера 9 с манжетой¹⁰.
7. Поддерживайте анестезию при ингаляции от 1,5% до 2% изофлурана. Кроме того, контролируйте анестезию, оценивая физиологические параметры, такие как частота сердечных сокращений, которая должна поддерживаться в диапазоне от 100 до 120 ударов в минуту, сатурация кислорода, которая должна поддерживаться в диапазоне от 99% до 100%, мышечное расслабление, отсутствие движения и оценка рефлексов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Температура тела также должна контролироваться и контролироваться, оставаясь в пределах 37,5-38,5 °C. При необходимости, помимо изофлурана, для поддержания контроля параметров может использоваться пропофол. Фентанилгидрохлорид следует назначать в качестве анальгетика в дозе 0,02 мг/кг каждые 20 минут. Все параметры должны регистрироваться каждые 5 минут.
8. Вводите периоперационную анальгезию однократно в 0,002 мг/кг фентанила внутривенно и 4 мг/кг трамадола гидрохлорида внутримышечно в ягодичную или трапециевидную мышцу.
9. Поместите сердечные электроды в грудной отдел для интраоперационного мониторинга частоты сердечных сокращений. Записывайте частоту сердечных сокращений, ректальную температуру и сатурацию кислорода каждые 5 минут.

2. Хирургическое вмешательство

1. Расположите свинку на операционном столе в положении лежа на спине.
2. Накройте ноги животного процедурными перчатками, чтобы свести к минимуму загрязнение операционного поля.
3. Выполните удаление волос в вентральном каудальном отделе живота между предпоследней парой молочных желез с помощью хирургической машинки для стрижки.
4. Выполняйте предоперационную антисептическую обработку кожи антисептической щеткой, пропитанной хлоргексидином, совершая круговые движения от области пупочного рубца к последней паре молочных желез. Удалите хлоргексидин с помощью чистого, увлажненного компресса.
5. Убедитесь, что хирург и ассистент выполняют хирургическую антисептическую обработку и надевают стерильные хирургические халаты и перчатки для операции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Животное должно быть подготовлено к операции в зоне подготовки, отдельной от места операции.
6. Подготовьте операционный стол с помощью соответствующих и предварительно стерилизованных инструментов, перечисленных в Таблице материалов.
7. Проведите заключительную хирургическую полевую антисептическую обработку с использованием стерильной марли и антисептика хлоргексидина, очищая область по схеме «рыбья кость», начиная с места разреза и расширяясь в стороны.
8. Повторите эту процедуру трижды с хлоргексидиновым антисептиком, а затем повторите процедуру со спиртовым хлоргексидином.
9. Полностью накройте животное стерильной хирургической простыней, и с помощью ножниц создайте прямоугольное отверстие в хирургической простыне, примерно 10 х 20 см², если драпировка не фенестрирована.
10. Расположите хирургическую простыню над предпоследней парой паховых молочных желез. Поместите 4 зажима Backhaus, чтобы закрепить хирургическую простыню на коже животного.
11. Надрежьте кожу скальпелем, создав разрез примерно 10 см в длину.
12. Добиться гемостаза подкожных сосудов с помощью гемостатических щипцов и/или рассасывающегося шовного материала размера 2.
13. Рассеките подкожную клетчатку пальцами или с помощью ножниц с тонким острием, углубляя разрез так, чтобы достичь белой линии в мышцах живота.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пальпируйте среднюю линию живота, чтобы почувствовать белую линию как более жесткую и волокнистую область; Наблюдайте за разделением прямых мышц живота и отмечайте изменение консистенции тканей во время рассечения, чтобы точно определить белую линию ¹¹.
14. С помощью щипцов Allis захватите мускулатуру и поднимите ее, чтобы сделать колотый разрез в белой линии с помощью скальпеля.
15. Введите указательный палец в разрез, чтобы оценить наличие спаек. Осторожно расширьте разрез над белой линией каудально и краниально тупыми/тупыми или тонкими/тупыми ножницами, чтобы не повредить другие органы и нижележащие структуры.
16. Сделайте разрез достаточной длины, чтобы одна рука хирурга могла быть введена в брюшную полость для локализации и экстериоризации рогов матки и/или яичников. Ретрактор Госсета может быть использован для облегчения входа в брюшную полость и наложения швов на мускулатуру в один слой в конце процедуры.
17. Если один из рогов матки расположен перед яичниками, аккуратно проследите за ним до достижения кончика маточного рога и ипсилатерального яичника. Во время этой процедуры оцените наличие жидкости внутри матки, которая может поставить под угрозу беременность.
18. Обнаружив яичник, аккуратно потяните его и осторожно обнаживьте. Оцените наличие преовуляторных фолликулов, геморрагических желтых тел, циклических желтых тел и белых тел, чтобы оценить, соответствует ли ожидаемая синхронизация свинки.
19. Аккуратно удалите фимбрии маточной трубы, покрывающей яичник, выверните ее слизистую оболочку и найдите устье маточной трубы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если хирург затрудняется определить устье фимбрии, карман на ампуле яйцевода может быть сделан с помощью круглой иглы для наложения швов, избегая прокола кровеносных сосудов, чтобы ввести катетер Tomcat, содержащий эмбрионы.
20. Осторожно введите катетер Tomcat, содержащий эмбрионы, в устье фимбрий, пока не дойдете до ампульной области маточной трубы.
21. Прикрепите шприц объемом 1 мл к катетеру Tomcat, чтобы протолкнуть жидкость, содержащую эмбрион, в маточную трубу. Накройте яичник фимбриями и верните его в брюшную полость.
22. Найдите контралатеральный маточный рог и яичник и повторите шаги 2.17-2.21.
23. Переместите структуры внутри брюшной полости и добавьте 1 л физиологического раствора или раствора лактата Рингера, подогретого (39 °C), чтобы предотвратить спайки перед началом абдоминорафии.
24. Сшиваем мускулатуру живота рассасывающимся швом размера 2 в "Х" швами (Султан) прерываем.
25. Аппроксимируйте подкожную клетчатку непрерывным матрасным швом с помощью рассасывающегося шовного материала размера 2.
26. Закройте кожу нейлоновым швом размера 2 прерывистыми простыми швами, хирургическими скобами или этилцианоакрилатным клеем. В этой процедуре мы остановили свой выбор на использовании клея.
27. Очистите операционную рану марлей, смоченной в перекиси водорода, и обсушите компрессом для усиления фиксации хирургического клея на операционной ране. Нанесите рифамицин или мазь Пирсона, накройте марлей и, наконец, нанесите хирургический клей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рана должна оставаться закрытой с помощью повязки в течение 5 дней.

3. Послеоперационный уход

1. Оценивайте животных на наличие признаков характерной клинической боли в течение как минимум следующих 3 дней подряд в соответствии со шкалой, предложенной Luna et ^al.12.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта шкала основана на различных формах поведения, проявляемых свиньями при испытании разного уровня боли, таких как осанка, взаимодействие и интерес к окружающей среде, активность, аппетит и внимание к пораженной области. Оценка колеблется от 0 до 3, в зависимости от типа демонстрируемого поведения, для каждого оцениваемого параметра. В конце оценки сумма всех баллов отражает интенсивность боли, испытываемой животным, где 0 означает отсутствие боли, а 18 представляет очень интенсивную боль¹².
2. Вводите однократную дозу 15 мг/кг амоксициллина и 0,4 мг/кг 2% мелоксикама внутримышечно (в ягодичную или шейную мышцу) один раз в сутки в течение 3 дней в качестве послеоперационного ухода для предотвращения боли, воспалительных процессов и инфекции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если оценка боли равна или превышает 6 баллов по используемой шкале боли (оценка от 0 до 18), введите 5000 мг/животное дипирона натрия внутримышечно (в ягодичную или шейную мышцу) один раз в день в дополнение к противовоспалительным препаратам и антибиотикам. В качестве альтернативы можно провести анальгезию в соответствии с местными рекомендациями IACUC.
3. На 6-е сутки после операции удалить хирургический клей для очистки раны марлей, смоченной в 2% спиртовом растворе хлоргексидина, и нанести мазь Пирсона для местного применения до 10-го дня, когда рекомендуется снятие швов или хирургическое снятие скоб, если оно используется.

4. Ультразвуковая гестационная диагностика беременности

1. Проведите трансабдоминальную ультразвуковую оценку беременности с помощью ультразвукового аппарата (диапазон частот от 4,5 до 8,5 МГц) через 30 дней после операции по переносу эмбрионов.
2. Нанесите ультразвуковой гель на зонд и расположите его возле паховой области живота, лицом медиально.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация округлых безэховых эмбриональных пузырьков, обусловленных жидкостью в просвете матки, указывает на беременность. Отсутствие визуализации внутриматочной жидкости или наличие внутриматочной жидкости без разграничения эмбриональных пузырьков свидетельствует об отсутствии гестации.

5. Эвтаназия животных

ПРИМЕЧАНИЕ: Усыпить свинок, у которых при ультразвуковом исследовании не было плодов размеров и внешнего вида, соответствующих гестационному возрасту.

1. С помощью иглы размером 40 мм x 12 мм наберите 15 мг/кг кетамина и 2 мг/кг мидазолама в тот же шприц объемом 50 мл, прикрепленный к набору для внутривенного введения, и введите внутримышечно в трапециевидную мышцу в шейном отделе каудально к наружному слуховому проходу в качестве предобезболивающего препарата.
2. Канюлируйте ушную вену с помощью катетера 20 G и вводите анестезию 4 мг/кг пропофола внутривенно в болюсе до тех пор, пока не произойдет брадикардия (в соответствии с институционально утвержденными протоколами).
3. Затем введите от 10 до 20 мл 19,1% хлорида калия внутривенно. Подтвердите остановку сердца и легких, наблюдая за отсутствием дыхательных движений, бледностью слизистых оболочек, потерей роговичного рефлекса и отсутствием сердцебиения, поместив стетоскоп на сердечную область.
4. Соберите любой тип внутриматочного содержимого (эмбриональная ткань, жидкость или слизистый секрет) у вскрытых^самок13 и отправьте его на микробиологический анализ для выявления возможных патогенов, а также для генотипической характеристики клонов (при необходимости). Визуально проверьте наличие или отсутствие желтых тел, кист яичников, аномальных выделений, а также возникновение спаек в матке, яичниках и яйцеводах¹⁴.

Результаты

Целью данной статьи является демонстрация лапаротомической операции по переносу клонированных эмбрионов в яйцевод свинок. Все животные оставались в адекватной анестезиологической плоскости, без каких-либо интраоперационных инцидентов и осложнений во время восста...

Обсуждение

Описанный хирургический метод ранее был выполнен другими исследовательскими группами, работающими с производством клонированных свиней или генетически модифицированных клонированных свиней, с сообщениями о рождении после внедрения этой методики 15,16,1...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mL straw	generic	-	Surgical material
1 mL syringe	Descarpack	341001	Surgical material
10 mL syringe	Descarpack	324601	Surgical material
20 mL syringe	Descarpack	324801	Surgical material
3 mL syringe	Descarpack	324201	Surgical material
5 mL syringe	Descarpack	324401	Surgical material
60 mL syringe	Descarpack	323201	Surgical material
9 mm endotracheal tube	Rusch	112482-000090	Surgical material
Allis forceps	generic	-	Surgical instrument
Amox LA	JA Saúde Animal	MAPA registration: 8.781/2004	Pharmaceutical drug
Bakhaus forceps	generic	-	Surgical instrument
Catheter 20G	Descarpack	362401	Catheter for intravenous access
Cetamin	Agener União	MAPA registration: SP-000292-5.000011	Anesthetic
Conductive clinical gel	RMC	ANVISA registration: 80122200013	Surgical material
Dipyrone D-500	Zoetis	MAPA registration: SP0000728-46	Pharmaceutical drug
Disposable scalpel n. 22	Wiltex	ANVISA registration: 10150470565	Surgical instrument
Disposable sterile sponge-brush	Rioquimica	7.89778E+12	Surgical asepsis
Easy-Scan:Go	IMV	ESCG01	Ultrasound
Endozime AW Plus	Ruhof	34514	Detergent for surgical instruments
Fentanil (Fentanest)	Cristália	ANVISA registration: 1029800810159	Anesthetic
Gosset retractor	generic	-	Surgical instrument
Halstead-mosquito hemostatic forceps	generic	-	Surgical instrument
Healing ointment - Unguento Pearson	Pearson SA	MAPA registration: SP0000094-16	Pharmaceutical drug
hydrogen peroxide solution	Rioquimica	ANVISA registration: 218690015	Surgical material
Isofluorane	Biochimico	ANVISA registration: 100630222	Anesthetic
IV Drip set extensor	generic	-	Fluid therapy
IV Macro drip set	Descarpack	410301	Fluid therapy
Lactofur (ceftiofur)	Ourofino SA	MAPA registration: SP0000051-50	Pharmaceutical drug
Laringoscope	-	-	Surgical instrument
Maxicam 2%	Ourofino SA	MAPA registration: SP0000051-69	Pharmaceutical drug
Micropore adhesive 5 cm x 10 cm	generic	1530	Surgical material
Midazolam	Hipolabor	ANVISA registration: 1134301430035	Anesthetic
Multi-Way IV Infusion Set	Descarpack	413201	Fluid therapy
Needle 40 mm x 1.2 mm	Descarpack	353601	Sterile needle for applying medicines and anesthetics.
Needle 40 mm x 1.6 mm	Wiltex	ANVISA registration: 10150470664	Sterile needle for applying medicines and anesthetics.
Needle holder	generic	-	Surgical instrument
Nylon 2 suture trhead	Shalon Medical	N502CTI40	Surgical material
Ordinary pen	generic	-	Regular pen for taking notes
Physiological solution 0.9% 500 mL bag	JP Farma	MS:1.0491.0070	Fluid therapy
Polyglycolic acid 2 suture thread	Atramat	G4099-75H	Surgical material
Potassium chloride	Samtec	ANVISA registration: 1559200010139	Parenteral drug
Procedure gloves	Descarpack	122401	Personal Protective Equipment (PPE)
Propofol (Provive)	União Química	ANVISA registration: 1049714490057	Anesthetic
Ringer lactate solution 500 mL bag	JP Farma	MS:1.0491.0061	Fluid therapy
Riohex 0.5% clorexidine alcohol solution	Rioquimica	218690356	Surgical asepsis
Riohex 2% clorexidine solution with surfactant	Rioquimica	218690356	Surgical asepsis
Scalp 21 G	Descarpack	421201	Surgical material
Shoe covers	generic	-	Personal Protective Equipment (PPE)
Sterile compresses	Cremer	ANVISA registration: 10071150065	Surgical material
Sterile gauze pad	Procitex	ANVISA registration: 80245210083	Surgical material
Sterile surgical drapes 140 cm x 90 cm	Venkuri	7010003	Surgical material
Sterile surgical drapes 150 cm x 190 cm	PolarFix	F00208	Surgical material
Sterile surgical gloves	Mucambo	CA: 39.317	Personal Protective Equipment (PPE)
Stethoscope	generic	-	Surgical equipment
Surgical cap	Descarpack	93201	Personal Protective Equipment (PPE)
Surgical gown	Descarpack	231101	Personal Protective Equipment (PPE)
Surgical mask	Descarpack	110701	Personal Protective Equipment (PPE)
Surgical scissors blunt-blunt	generic	-	Surgical instrument
Surgical scissors sharp-sharp	generic	-	Surgical instrument
Surgical stapler	Tradevet	-	Surgical material
Tekbond super glue	Tek Bond	78072720030	Surgical material
Thermometer	generic	-	Surgical equipment
Three Way Stopcock	Solidor	374	Surgical material
Tramadol hydrocloride	Agener União	MAPA registration: SP-000292-5.000002	Anesthetic
Transparent film dressing	Skinupper	ANVISA registration: 82307460014	Surgical material
Waterproof adhesive 10 cm x 4.5 cm	generic	364828	Surgical material