Cirurgia de transferência de embriões por laparotomia em leitoas

Resumo

Este protocolo descreve a aplicação da técnica cirúrgica utilizada para transferência de embriões clonados de suínos via laparotomia em leitoas.

Resumo

Este protocolo tem como objetivo demonstrar a técnica cirúrgica de transferência de embriões de suínos clonados para o oviduto, método amplamente utilizado na produção de suínos geneticamente modificados para pesquisa biomédica. Nove leitoas foram submetidas à sincronização hormonal e laparotomia para transferência de embriões clonados produzidos por transferência nuclear de células somáticas (SCNT) em estágios de até 4 células no dia 2 para o oviduto. O diagnóstico gestacional foi realizado por meio de exame ultrassonográfico 30 dias após a cirurgia de transferência. Seis das nove leitoas operadas exibiram sinais de gravidez no exame de ultrassom. No entanto, como não houve progressão no desenvolvimento fetal avaliado pela ecografia, as leitoas foram submetidas à necropsia aos 60 dias para coleta de material biológico e avaliação do sistema reprodutivo. Aderências foram observadas nos cornos uterinos, ovários e ovidutos. A partir do lúmen uterino de duas das leitoas eutanasiadas, foram obtidas uma e quatro estruturas embrionárias com idades gestacionais variando entre 12 a 20 dias. Apesar da ausência de leitões vivos, provavelmente atribuída à baixa taxa de eficiência de transferência de embriões clonados de suínos, que é influenciada por vários fatores, incluindo o número e a qualidade dos embriões transferidos, a técnica cirúrgica apresentada mostrou-se rápida e segura.

Introdução

Os porcos são um excelente modelo experimental para pesquisa biomédica devido às suas semelhanças anatômicas, fisiológicas e genéticas com os humanos¹. Esses animais têm sido frequentemente utilizados em pesquisas relacionadas ao xenotransplante, com a intenção de produzir órgãos, células ou tecidos que promovam um baixo risco de rejeição quando transplantados para humanos. A pesquisa em xenotransplante visa aumentar a oferta de órgãos para transplante humano, reduzindo assim a lista de espera de pacientes².

A produção de suínos para xenotransplante envolve várias etapas, incluindo a produção de clones a partir de células suínas geneticamente editadas. Após a produção in vitro de embriões clonados geneticamente modificados, os embriões são transferidos para o sistema reprodutivo de uma porca com ciclo estral sincronizado para preparar a fisiologia uterina para a recepção e gestação do novo concepto³.

A transferência de embriões em suínos pode ser realizada por métodos não invasivos ou invasivos⁴. Entre os métodos não invasivos está a transferência transcervical, que não requer nenhuma intervenção cirúrgica. No entanto, esse método é restrito à transferência de embriões em estágios posteriores de desenvolvimento (ou seja, estágios de mórula ou blastocisto) e não permite a determinação precisa do local de inserção do cateter ou deposição do embrião⁵. A laparoscopia e a laparotomia são consideradas métodos invasivos de transferência de embriões. A laparoscopia é menos invasiva, mas requer equipamentos específicos e caros, e sua eficiência varia consideravelmente (de menos de 20% a mais de 80%) devido a vários fatores, como dificuldade de manipulação das estruturas reprodutivas e o tipo de cateter utilizado ^4,6. Portanto, a transferência por laparoscopia ainda é menos eficiente em comparação com os métodos de transferência cirúrgica por laparotomia⁴.

A cirurgia de transferência de embriões em porcas por laparotomia é um procedimento relativamente simples e rápido, geralmente levando cerca de 30 minutos. No entanto, deve ser realizada em centro cirúrgico equipado com aparelho de anestesia inalatória e equipe especializada. Para linhagens comerciais de suínos (como Landrace, Large White ou seus cruzamentos), equipamentos especiais como guinchos para levantar marrãs e uma mesa cirúrgica larga e robusta são necessários devido ao peso considerável dos animais (cerca de 130-150 kg).

Para que a cirurgia seja bem-sucedida, os embriões devem ser previamente avaliados quanto ao seu estágio de desenvolvimento. Embriões de até 4 células são recomendados para serem transferidos para a tuba uterina. Embriões em estágios além de 4 células, como mórulas e blastocistos, devem ser transferidos para o corno uterino ^7,8.

Embora grupos de pesquisa em todo o mundo estejam realizando a produção e transferência cirúrgica de embriões de suínos clonados geneticamente modificados, ainda não existem protocolos bem definidos que demonstrem esse procedimento por meio de vídeos. Essa abordagem é crucial para o sucesso da gestação, pois a técnica requer deposição precisa dos embriões na localização exata do oviduto, envolvendo a localização do óstio tubário e a introdução da pipeta contendo os embriões. Essa técnica pode ser melhor compreendida por meio de vídeos explicativos de todo o procedimento. Portanto, este artigo tem como objetivo demonstrar a cirurgia de laparotomia para transferência de embriões clonados para o oviduto de marrãs, um pré-requisito essencial para a futura produção de suínos geneticamente modificados para serem utilizados em xenotransplante ou outros fins relacionados.

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais em Pesquisa da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, protocolo número 6088030523. Foram utilizadas nove leitoas de sete meses de idade da suinocultura do núcleo Água Branca, localizada na cidade de Itu, estado de São Paulo, Brasil, logo após a detecção do segundo estro⁹. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação animal

1. Jejuar os animais por 12 h e restringir o acesso à água por 4 h antes do procedimento cirúrgico.
2. Usando uma agulha de 40 mm x 12 mm, retire 10 mg/kg de cetamina e 0,2 mg/kg de midazolam na mesma seringa de 50 mL. Conecte a seringa a um conjunto de administração intravenosa para facilitar a administração do medicamento, mantendo uma distância segura do animal e permitindo que ele se mova livremente.
3. Administrar a medicação pré-anestésica por injeção intramuscular no músculo trapézio, caudal ao canal auditivo externo.
4. Canular a veia auricular com cateter 20 G e conectá-la a um conjunto de administração de macrogotejamento para fluidoterapia intraoperatória com solução de NaCl a 0,9% a uma velocidade de 10 mL/kg/h.
5. Induzir anestesia com 4 mg/kg de propofol por via intravenosa (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
6. Realizar a intubação orotraqueal do animal com laringoscópio e tubo orotraqueal tamanho 9 com manguito¹⁰.
7. Mantenha a anestesia com inalação de isoflurano a 1.5% a 2%. Além disso, monitore a anestesia avaliando parâmetros fisiológicos como frequência cardíaca, que deve ser mantida entre 100 e 120 batimentos por minuto, saturação de oxigênio, que deve ser mantida entre 99% e 100%, relaxamento muscular, ausência de movimento e avaliação dos reflexos.
   NOTA: A temperatura corporal também deve ser monitorada e controlada, ficando entre 37,5-38,5 °C. Quando necessário, além do isoflurano, o propofol pode ser usado para manter o controle dos parâmetros. O cloridrato de fentanil deve ser administrado como analgésico na dose de 0,02 mg/kg a cada 20 minutos. Todos os parâmetros devem ser registrados a cada 5 minutos.
8. Administre analgesia perioperatória com uma dose única de 0,002 mg / kg de fentanil por via intravenosa e 4 mg / kg de cloridrato de tramadol por via intramuscular no músculo glúteo ou trapézio.
9. Coloque eletrodos cardíacos na região torácica para monitoramento intraoperatório da frequência cardíaca. Registre a frequência cardíaca, a temperatura retal e a saturação de oxigênio a cada 5 minutos.

2. Procedimento cirúrgico

1. Posicione a marrã na mesa cirúrgica em decúbito dorsal.
2. Cubra as pernas do animal com luvas de procedimento para minimizar a contaminação do campo cirúrgico.
3. Realize a depilação abdominal caudal ventral entre o penúltimo par de glândulas mamárias usando um aparador cirúrgico.
4. Realize a antissepsia da pele pré-operatória com uma escova antisséptica impregnada com clorexidina, fazendo movimentos circulares da região da cicatriz umbilical até o último par de glândulas mamárias. Remova a clorexidina com uma compressa limpa e umedecida.
5. Certifique-se de que o cirurgião e o assistente realizem a antissepsia cirúrgica e usem aventais e luvas cirúrgicas estéreis para a cirurgia.
   NOTA: O animal deve ser preparado para a cirurgia em uma área de preparação separada do local da cirurgia.
6. Prepare a mesa cirúrgica com os instrumentos apropriados e previamente esterilizados listados na Tabela de Materiais.
7. Realizar antissepsia final do campo cirúrgico com gaze estéril e antisséptico clorexidina, limpando a região em padrão espinha de peixe, iniciando no local da incisão e expandindo lateralmente.
8. Repita este procedimento três vezes com anti-séptico de clorexidina e, em seguida, repita o procedimento com clorexidina alcoólica.
9. Cubra completamente o animal com um campo cirúrgico estéril e, usando uma tesoura, crie uma abertura retangular no campo cirúrgico, de aproximadamente 10 x 20 cm², se o campo não estiver fenestrado.
10. Posicione o campo cirúrgico sobre o penúltimo par de glândulas mamárias inguinais. Coloque 4 grampos Backhaus para prender o campo cirúrgico sobre a pele do animal.
11. Incisar a pele com bisturi, criando uma incisão de aproximadamente 10 cm de comprimento.
12. Obter hemostasia de vasos subcutâneos com pinça hemostática e/ou sutura absorvível tamanho 2.
13. Dissecar o tecido subcutâneo com os dedos ou com o auxílio de tesouras de ponta fina, aprofundando a incisão para alcançar a linha alba na musculatura abdominal.
    NOTA: Palpe a linha média do abdômen para sentir a linha alba como uma área mais rígida e fibrosa; observar a separação dos músculos retos abdominais e observar a mudança na consistência do tecido durante a dissecação para identificar a linha alba com precisão¹¹.
14. Com a pinça Allis, segure a musculatura e levante-a para fazer uma incisão na linha alba com um bisturi.
15. Insira o dedo indicador na incisão para avaliar a presença de aderências. Estenda a incisão sobre a linha alba caudal e cranialmente com uma tesoura romba/romba ou fina/romba cuidadosamente para evitar ferir outros órgãos e estruturas subjacentes.
16. Faça uma incisão de comprimento suficiente para que uma mão do cirurgião possa ser inserida na cavidade abdominal para localizar e exteriorizar os cornos uterinos e/ou ovários. Um afastador de Gosset pode ser usado para facilitar a entrada na cavidade abdominal e a sutura da musculatura em uma única camada no final do procedimento.
17. Se um dos cornos uterinos estiver localizado antes dos ovários, siga-o suavemente até chegar à ponta do corno uterino e ao ovário ipsilateral. Durante esse procedimento, avalie a presença de líquido no interior do útero, o que pode comprometer a gestação.
18. Depois de localizar o ovário, puxe-o suavemente e exponha-o com cuidado. Avalie a presença de folículos pré-ovulatórios, corpos lúteos hemorrágicos, corpos lúteos cíclicos e corpo albicans para avaliar se a sincronização da leitoa é a esperada.
19. Remova suavemente as fímbrias da tuba uterina que cobre o ovário, everte sua mucosa e localize o óstio da tuba uterina.
    NOTA: Se o cirurgião tiver dificuldade em identificar o óstio das fímbrias, pode-se fazer uma bolsa na ampola do oviduto com uma agulha de sutura de corpo redondo, evitando punção dos vasos sanguíneos, para inserir o cateter Tomcat contendo os embriões.
20. Insira cuidadosamente um cateter Tomcat contendo os embriões no óstio das fímbrias até atingir a região da ampola da tuba uterina.
21. Conecte uma seringa de 1 mL ao cateter Tomcat para empurrar o fluido contendo embriões para dentro da trompa uterina. Cubra o ovário com as fímbrias e devolva-o à cavidade abdominal.
22. Localize o corno uterino e o ovário contralaterais e repita as etapas 2.17-2.21.
23. Reposicionar as estruturas dentro da cavidade abdominal e adicionar 1 L de solução salina ou solução de lactato de Ringer aquecida (39 °C) para evitar aderências antes de iniciar a abdominorrafia.
24. Suturar a musculatura abdominal com sutura absorvível tamanho 2 em "X" pontos (Sultão) interrompidos.
25. Aproxime o tecido subcutâneo com uma sutura contínua em colchão usando sutura absorvível tamanho 2.
26. Feche a pele com sutura de náilon tamanho 2 em pontos simples interrompidos, grampos cirúrgicos ou adesivo de etil-cianoacrilato. Nesse procedimento, optou-se pelo uso de adesivo.
27. Limpe a ferida cirúrgica com gaze embebida em peróxido de hidrogênio e seque com uma compressa para melhorar a fixação do adesivo cirúrgico na ferida cirúrgica. Aplique rifamicina ou pomada de Pearson, cubra com gaze e, por fim, aplique adesivo cirúrgico.
    NOTA: A ferida deve permanecer fechada com curativo por 5 dias.

3. Cuidados pós-operatórios

1. Avaliar os animais quanto a sinais de dor clínica característica por pelo menos os próximos 3 dias consecutivos, de acordo com a escala proposta por Luna et ^al.12.
   NOTA: Esta escala é baseada em diferentes comportamentos exibidos por porcos ao experimentar diferentes níveis de dor, como postura, interação e interesse pelo ambiente, atividade, apetite e atenção à área afetada. A pontuação varia de 0 a 3, dependendo do tipo de comportamento exibido, para cada parâmetro avaliado. Ao final da avaliação, a soma de todos os escores reflete a intensidade da dor experimentada pelo animal, onde 0 representa ausência de dor e 18 representa dor muito intensa¹².
2. Administrar uma dose única de 15 mg/kg de amoxicilina e 0,4 mg/kg de meloxicam a 2% por via intramuscular (no músculo glúteo ou cervical) uma vez por dia durante 3 dias como cuidados pós-operatórios para prevenir dor, processos inflamatórios e infeções.
   NOTA: Se o escore de dor for igual ou superior a 6 na escala de dor utilizada (escore de 0 a 18), administrar 5.000 mg/animal de dipirona sódica por via intramuscular (no músculo glúteo ou cervical) uma vez ao dia, além do anti-inflamatório e antibiótico. Como alternativa, realize analgesia conforme descrito nas diretrizes locais da IACUC.
3. No 6º dia de pós-operatório, retirar o adesivo cirúrgico para limpeza da ferida com gaze embebida em solução alcoólica de clorexidina a 2% e aplicar pomada tópica de Pearson até o 10º dia, quando se recomenda a retirada da sutura ou remoção dos grampos cirúrgicos, se utilizados.

4. Diagnóstico gestacional ultrassonográfico da gravidez

1. Realize a avaliação ultrassonográfica da gravidez transabdominal com um aparelho de ultrassom (faixa de frequência de 4,5 a 8,5 MHz) 30 dias após a cirurgia de transferência de embriões.
2. Aplique gel de ultrassom na sonda e posicione-a perto da região abdominal inguinal, voltada para medialmente.
   NOTA: A visualização de vesículas embrionárias anecoicas arredondadas, devido ao líquido no lúmen uterino, indica gestação. A não visualização do líquido intrauterino, ou a presença de líquido intrauterino sem delineamento das vesículas embrionárias, sugere a ausência de gestação.

5. Eutanásia dos animais

NOTA: Eutanasiar as leitoas que não apresentaram fetos de tamanho e aparência correspondentes à idade gestacional no exame ultrassonográfico.

1. Com agulha de 40 mm x 12 mm, aspirar 15 mg/kg de cetamina e 2 mg/kg de midazolam na mesma seringa de 50 mL acoplada a um aparelho de administração intravenosa e administrar por via intramuscular no músculo trapézio na região cervical caudal ao meato acústico externo, como medicação pré-anestésica.
2. Canular a veia auricular com cateter 20 G e induzir anestesia com 4 mg/kg de propofol por via intravenosa em bolus até que ocorra bradicardia (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
3. Em seguida, administrar 10 a 20 mL de cloreto de potássio a 19,1% por via intravenosa. Confirme a parada cardiorrespiratória observando a ausência de movimentos respiratórios, membranas mucosas pálidas, perda do reflexo da córnea e ausência de batimentos cardíacos, colocando um estetoscópio sobre a região cardíaca.
4. Coletar qualquer tipo de conteúdo intrauterino (tecido embrionário, líquido ou secreções mucosas) de fêmeas necropsiadas¹³ e encaminhá-lo para análise microbiológica para detecção de possíveis patógenos e também para caracterização genotípica dos clones (se necessário). Verifique visualmente a presença ou ausência de corpos lúteos, cistos ovarianos, secreções anormais e a ocorrência de aderências no útero, ovários e ovidutos¹⁴.

Resultados

Este artigo tem como objetivo demonstrar a cirurgia de laparotomia para transferência de embriões clonados para o oviduto de leitoas. Todos os animais permaneceram em plano anestésico adequado, sem incidentes ou complicações intraoperatórias durante a recuperação anestésica. As leitoas levaram, em média, 2-3 h para se levantar após o término da cirurgia.

Todos os procedimentos cirúrgicos duraram, em média, 44 min. Nove leitoas foram submetidas à...

Discussão

O método cirúrgico descrito já foi realizado anteriormente por outros grupos de pesquisa que trabalham com a produção de suínos clonados ou suínos clonados geneticamente modificados, com relatos de nascimentos após a implementação dessa técnica 15,16,17,18,19,20. As taxas de gravid...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mL straw	generic	-	Surgical material
1 mL syringe	Descarpack	341001	Surgical material
10 mL syringe	Descarpack	324601	Surgical material
20 mL syringe	Descarpack	324801	Surgical material
3 mL syringe	Descarpack	324201	Surgical material
5 mL syringe	Descarpack	324401	Surgical material
60 mL syringe	Descarpack	323201	Surgical material
9 mm endotracheal tube	Rusch	112482-000090	Surgical material
Allis forceps	generic	-	Surgical instrument
Amox LA	JA Saúde Animal	MAPA registration: 8.781/2004	Pharmaceutical drug
Bakhaus forceps	generic	-	Surgical instrument
Catheter 20G	Descarpack	362401	Catheter for intravenous access
Cetamin	Agener União	MAPA registration: SP-000292-5.000011	Anesthetic
Conductive clinical gel	RMC	ANVISA registration: 80122200013	Surgical material
Dipyrone D-500	Zoetis	MAPA registration: SP0000728-46	Pharmaceutical drug
Disposable scalpel n. 22	Wiltex	ANVISA registration: 10150470565	Surgical instrument
Disposable sterile sponge-brush	Rioquimica	7.89778E+12	Surgical asepsis
Easy-Scan:Go	IMV	ESCG01	Ultrasound
Endozime AW Plus	Ruhof	34514	Detergent for surgical instruments
Fentanil (Fentanest)	Cristália	ANVISA registration: 1029800810159	Anesthetic
Gosset retractor	generic	-	Surgical instrument
Halstead-mosquito hemostatic forceps	generic	-	Surgical instrument
Healing ointment - Unguento Pearson	Pearson SA	MAPA registration: SP0000094-16	Pharmaceutical drug
hydrogen peroxide solution	Rioquimica	ANVISA registration: 218690015	Surgical material
Isofluorane	Biochimico	ANVISA registration: 100630222	Anesthetic
IV Drip set extensor	generic	-	Fluid therapy
IV Macro drip set	Descarpack	410301	Fluid therapy
Lactofur (ceftiofur)	Ourofino SA	MAPA registration: SP0000051-50	Pharmaceutical drug
Laringoscope	-	-	Surgical instrument
Maxicam 2%	Ourofino SA	MAPA registration: SP0000051-69	Pharmaceutical drug
Micropore adhesive 5 cm x 10 cm	generic	1530	Surgical material
Midazolam	Hipolabor	ANVISA registration: 1134301430035	Anesthetic
Multi-Way IV Infusion Set	Descarpack	413201	Fluid therapy
Needle 40 mm x 1.2 mm	Descarpack	353601	Sterile needle for applying medicines and anesthetics.
Needle 40 mm x 1.6 mm	Wiltex	ANVISA registration: 10150470664	Sterile needle for applying medicines and anesthetics.
Needle holder	generic	-	Surgical instrument
Nylon 2 suture trhead	Shalon Medical	N502CTI40	Surgical material
Ordinary pen	generic	-	Regular pen for taking notes
Physiological solution 0.9% 500 mL bag	JP Farma	MS:1.0491.0070	Fluid therapy
Polyglycolic acid 2 suture thread	Atramat	G4099-75H	Surgical material
Potassium chloride	Samtec	ANVISA registration: 1559200010139	Parenteral drug
Procedure gloves	Descarpack	122401	Personal Protective Equipment (PPE)
Propofol (Provive)	União Química	ANVISA registration: 1049714490057	Anesthetic
Ringer lactate solution 500 mL bag	JP Farma	MS:1.0491.0061	Fluid therapy
Riohex 0.5% clorexidine alcohol solution	Rioquimica	218690356	Surgical asepsis
Riohex 2% clorexidine solution with surfactant	Rioquimica	218690356	Surgical asepsis
Scalp 21 G	Descarpack	421201	Surgical material
Shoe covers	generic	-	Personal Protective Equipment (PPE)
Sterile compresses	Cremer	ANVISA registration: 10071150065	Surgical material
Sterile gauze pad	Procitex	ANVISA registration: 80245210083	Surgical material
Sterile surgical drapes 140 cm x 90 cm	Venkuri	7010003	Surgical material
Sterile surgical drapes 150 cm x 190 cm	PolarFix	F00208	Surgical material
Sterile surgical gloves	Mucambo	CA: 39.317	Personal Protective Equipment (PPE)
Stethoscope	generic	-	Surgical equipment
Surgical cap	Descarpack	93201	Personal Protective Equipment (PPE)
Surgical gown	Descarpack	231101	Personal Protective Equipment (PPE)
Surgical mask	Descarpack	110701	Personal Protective Equipment (PPE)
Surgical scissors blunt-blunt	generic	-	Surgical instrument
Surgical scissors sharp-sharp	generic	-	Surgical instrument
Surgical stapler	Tradevet	-	Surgical material
Tekbond super glue	Tek Bond	78072720030	Surgical material
Thermometer	generic	-	Surgical equipment
Three Way Stopcock	Solidor	374	Surgical material
Tramadol hydrocloride	Agener União	MAPA registration: SP-000292-5.000002	Anesthetic
Transparent film dressing	Skinupper	ANVISA registration: 82307460014	Surgical material
Waterproof adhesive 10 cm x 4.5 cm	generic	364828	Surgical material