Gilts의 개복술을 통한 배아 이식 수술

요약

이 프로토콜은 아가미에서 개복술을 통해 복제된 돼지 배아를 이식하는 데 사용되는 수술 기술의 적용을 설명합니다.

초록

이 프로토콜은 복제된 돼지 배아를 난관으로 이식하는 수술 기술을 시연하는 것을 목표로 하며, 이는 생물 의학 연구를 위한 유전자 변형 돼지 생산에 널리 사용되는 방법입니다. 9마리의 길트는 체세포 핵 전달(SCNT)에 의해 생성된 복제 배아를 2일째에 최대 4개의 세포 단계에서 난관으로 이식하기 위해 호르몬 동기화 및 개복술을 받았습니다. 임신 진단은 이식 수술 30일 후 초음파 검사를 통해 시행되었습니다. 수술을 받은 9명 중 6명은 초음파 검사에서 임신 징후를 보였다. 그러나 에코그래피에서 평가한 바와 같이 태아 발달에 진전이 없었기 때문에 길트는 생물학적 물질 수집 및 생식기관 평가를 위해 60일째에 부검을 받았습니다. 자궁 뿔, 난소 및 난관에서 유착이 관찰되었습니다. 안락사된 두 마리의 자궁 내강에서 재태 연령이 12일에서 20일 사이인 1개와 4개의 배아 구조를 얻었다. 이식된 배아의 수와 질을 포함한 다양한 요인에 의해 영향을 받는 복제 돼지 배아의 낮은 효율성에 기인하는 것으로 보이는 살아있는 새끼 돼지가 없음에도 불구하고, 제시된 수술 기법은 빠르고 안전한 것으로 입증되었습니다.

서문

돼지는 인간과 해부학적, 생리학적, 유전적 유사성으로 인해 생물의학 연구를 위한 훌륭한 실험 모델입니다¹. 이 동물은 인간에게 이식 할 때 거부 반응의 위험이 낮은 장기, 세포 또는 조직을 생산하려는 의도로 이종 이식과 관련된 연구에 자주 사용되었습니다. 이종장기이식 연구는 인간 이식을 위한 장기 공급을 증가시켜 환자 대기자를 줄이는 것을 목표로 한다².

이종 이식을 위한 돼지 생산에는 유전자 편집된 돼지 세포에서 클론을 생산하는 것을 포함하여 여러 단계가 포함됩니다. 유전자 변형된 복제 배아의 시험관 내 생산 후, 배아는 새로운 개념³의 수용 및 임신을 위한 자궁 생리를 준비하기 위해 동기화된 발정 주기를 가진 암퇘지의 생식계로 이식된다.

돼지에서의 배아 이식은 비침습적 또는 침습적 방법으로 수행할 수 있다⁴. 비침습적 방법 중에는 외과적 개입이 필요하지 않은 경경부 이식이 있습니다. 그러나, 이 방법은 후기 발달 단계(즉, 모룰라 또는 배반포 단계)에서 배아를 이식하는 것으로 제한되며, 카테터 삽입 부위 또는 배아 침착물의 정확한 측정을 허용하지 않는다⁵. 복강경 검사와 개복술은 배아 이식의 침습적 방법으로 간주됩니다. 복강경 검사는 덜 침습적이지만 구체적이고 값비싼 장비가 필요하며, 생식 구조 조작의 어려움^{및 사용되는 카}테터 유형과 같은 다양한 요인으로 인해 효율성이 상당히 다양합니다(20% 미만에서 80% 이상^까지). 따라서 복강경을 통한 이식은 개복술을 통한 외과적 이식 방법에 비해 여전히 효율성이 떨어진다⁴.

개복술을 통한 모돈의 배아 이식 수술은 비교적 간단하고 빠른 절차로 일반적으로 약 30분이 소요됩니다. 그러나 흡입 마취 장치를 갖춘 수술 센터와 전문 팀에서 수행해야합니다. 상업용 돼지 품종 (예 : Landrace, Large White 또는 그들의 교배종)의 경우 동물의 상당한 무게 (약 130-150kg)로 인해 아가미를 들어 올리기위한 호이스트와 넓고 견고한 수술 테이블과 같은 특수 장비가 필요합니다.

수술이 성공적이려면 배아의 발달 단계에 대한 평가를 미리 받아야 합니다. 최대 4개의 세포로 이루어진 배아는 자궁관으로 이식하는 것이 권장됩니다. 모룰라(morulas)와 배반포(blastocyst)와 같은 4개 세포를 넘어서는 단계의 배아는 자궁 뿔(uterine horn)로 옮겨져야 한다 ^7,8.

전 세계 연구 그룹이 유전자 변형 복제 돼지 배아의 생산 및 외과적 이식을 수행하고 있지만 비디오를 통해 이 절차를 입증하는 잘 정의된 프로토콜은 아직 없습니다. 이 접근법은 난관의 정확한 위치에 배아를 정밀하게 배치해야 하기 때문에 임신의 성공에 매우 중요하며, 여기에는 난관 골의 국소화와 배아가 포함된 피펫의 도입이 포함됩니다. 이 기술은 전체 절차에 대한 설명 비디오를 통해 더 잘 이해할 수 있습니다. 따라서 이 논문은 복제된 배아를 길트의 난관으로 이식하기 위한 개복술 수술을 시연하는 것을 목표로 하며, 이는 이종 이식 또는 기타 관련 목적으로 사용되는 유전자 변형 돼지의 미래 생산을 위한 필수 전제 조건입니다.

프로토콜

이 연구는 상파울루 대학교 수의학 및 동물 과학 대학의 동물 사용 연구 윤리 위원회(프로토콜 번호 6088030523)의 승인을 받았습니다. 브라질 상파울루주 이투시에 위치한 아구아 브랑카(Água Branca) 핵돼지 농장에서 생산된 7개월 된 9마리의 금박이 두 번째 발정 감지 직후 사용되었다⁹. 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 동물 준비

1. 수술 전에 12시간 동안 동물을 단식시키고 4시간 동안 물 접근을 제한하십시오.
2. 40mm x 12mm 바늘을 사용하여 동일한 50mL 주사기에 10mg/kg의 케타민과 0.2mg/kg의 미다졸람을 흡입합니다. 약물 투여를 용이하게 하기 위해 주사기를 IV 투여 세트에 부착하고 동물로부터 안전한 거리를 유지하고 동물이 자유롭게 움직일 수 있도록 합니다.
3. 외이도의 꼬리 부분인 승모근에 근육 주사를 통해 마취 전 약물을 투여합니다.
4. 20G 카테터로 귓바퀴 정맥을 캐뉼링하고 10mL/kg/h의 속도로 0.9% NaCl 용액을 사용하여 수술 중 수액 치료를 위한 매크로드립 투여 세트에 연결합니다.
5. 4mg/kg의 프로포폴로 정맥 주사로 마취를 유도합니다(기관에서 승인된 프로토콜에 따름).
6. 후두경과 커프¹⁰이 있는 크기 9 구강 튜브를 사용하여 동물의 구강 삽관을 수행합니다.
7. 1.5%에서 2%의 이소플루란 흡입으로 마취를 유지합니다. 또한 분당 100회에서 120회 사이로 유지되어야 하는 심박수, 99%에서 100% 사이로 유지되어야 하는 산소 포화도, 근육 이완, 움직임 부재 및 반사 평가와 같은 생리적 매개변수를 평가하여 마취를 모니터링합니다.
   알림: 체온도 37.5-38.5 °C 사이로 유지하여 모니터링하고 제어해야 합니다. 필요한 경우, 이소플루란 외에도 프로포폴을 사용하여 파라미터의 제어를 유지할 수 있습니다. 펜타닐 염산염은 진통제로 20분마다 0.02mg/kg의 용량으로 투여해야 합니다. 모든 매개변수는 5분마다 기록되어야 합니다.
8. 0.002mg/kg의 펜타닐을 정맥 주사하고 4mg/kg의 트라마돌 염산염을 둔근 또는 승모근에 근육 주사하여 수술 전후 진통제를 투여합니다.
9. 수술 중 심박수를 모니터링하기 위해 흉부에 심장 전극을 배치합니다. 5분마다 심박수, 직장 온도 및 산소 포화도를 기록합니다.

2. 수술 절차

1. 수술 테이블의 등쪽 누운 곳에 금테를 놓습니다.
2. 수술 부위의 오염을 최소화하기 위해 시술 장갑으로 동물의 다리를 덮으십시오.
3. 외과용 가위를 사용하여 끝에서 두 번째 쌍의 유선 사이의 복부 꼬리 복부 제모를 수행합니다.
4. 클로르헥시딘이 함침된 소독 브러시로 수술 전 피부 소독을 수행하여 배꼽 흉터 영역에서 마지막 유선까지 원을 그리며 움직입니다. 깨끗하고 축축한 찜질로 클로르헥시딘을 제거하십시오.
5. 외과의와 보조원이 수술용 방부제를 수행하고 수술을 위해 멸균 수술 가운과 장갑을 착용하도록 합니다.
   참고: 동물은 수술 부위와 분리된 준비 구역에서 수술을 준비해야 합니다.
6. 재료 표에 나열된 적절하고 이전에 멸균된 기구로 수술 테이블을 준비합니다.
7. 멸균 거즈와 클로르헥시딘 소독제를 사용하여 절개 부위에서 시작하여 측면으로 확장되는 피쉬본 패턴으로 해당 부위를 청소하여 최종 수술 현장 소독을 수행합니다.
8. 클로르헥시딘 소독제로 이 절차를 세 번 반복한 다음 알코올성 클로르헥시딘으로 이 절차를 반복합니다.
9. 멸균 수술 드레이프로 동물을 완전히 덮고 가위를 사용하여 드레이프가 페네스트되지 않은 경우 수술 드레이프에 약 10 x 20cm²의 직사각형 구멍을 만듭니다.
10. 서혜부 유선의 끝에서 두 번째 쌍 위에 수술용 드레이프를 놓습니다. 4개의 Backhaus cl을 배치합니다.amp동물의 피부 위에 수술용 드레이프를 고정합니다.
11. 메스로 피부를 절개하여 약 10cm 길이의 절개를 만듭니다.
12. 지혈 겸자 및/또는 흡수성 봉합사 크기 2를 사용하여 피하 혈관의 지혈을 달성합니다.
13. 손가락이나 가느다란 가위를 사용하여 피하 조직을 절개하여 복부 근육의 linea alba 에 도달하도록 절개 부위를 깊게 합니다.
    참고: 복부의 정중선을 촉진하여 linea alba를 더 단단하고 섬유질이 많은 영역으로 느껴보십시오. 복직근의 분리를 관찰하고 해부하는 동안 조직 일관성의 변화를 관찰하여 linea alba 를 정확하게 식별합니다¹¹.
14. Allis 겸자를 사용하여 근육 조직을 잡고 들어 올려 메스로 linea alba 를 찌릅니다.
15. 집게 손가락을 절개 부위에 삽입하여 유착 유무를 평가합니다. 다른 장기와 기저 구조물이 다치지 않도록 둔기/무딘 또는 가늘고 무딘 가위로 선(linea alba) 꼬리 및 두개골 쪽으로 절개 부위를 조심스럽게 확장합니다.
16. 외과 의사의 한 손을 복강에 삽입하여 자궁 뿔 및/또는 난소를 찾아 외부로 볼 수 있도록 충분한 길이로 절개합니다. Gosset 견인기는 절차가 끝날 때 복강으로의 진입과 단일 층으로의 근육 봉합을 용이하게 하는 데 사용할 수 있습니다.
17. 자궁 뿔 중 하나가 난소 앞에 위치한 경우 자궁 뿔 끝과 동측 난소에 도달할 때까지 부드럽게 따라갑니다. 이 시술 중에는 임신을 방해할 수 있는 자궁 내부에 액체가 있는지 평가해야 한다.
18. 난소를 찾은 후 부드럽게 당겨 조심스럽게 노출시킵니다. 배란 전 난포, 출혈성 황태체, 고리형 황태체 및 뇌관 알비칸의 존재를 평가하여 금박의 동기화가 예상과 같은지 평가합니다.
19. 난소를 덮고 있는 자궁관의 fimbriae를 부드럽게 제거하고 점막을 제거한 다음 자궁관의 osium을 찾습니다.
    참고: 외과 의사가 fimbriae의 ostium을 식별하기 어렵다고 판단하는 경우, 혈관에 구멍을 뚫지 않고 둥근 몸체의 봉합 바늘로 난관의 ampulla에 있는 주머니를 만들어 배아가 들어있는 Tomcat 카테터를 삽입할 수 있습니다.
20. 자궁관의 앰풀라 영역에 도달할 때까지 배아를 포함하는 Tomcat 카테터를 fimbriae의 골방에 조심스럽게 삽입합니다.
21. 1mL 주사기를 Tomcat 카테터에 부착하여 배아 함유액을 자궁관으로 밀어 넣습니다. 난소를 fimbriae로 덮고 복강으로 되돌립니다.
22. 반대쪽 자궁 뿔과 난소를 찾아 2.17-2.21단계를 반복합니다.
23. 복강 내부의 구조를 재배치하고 복부 형성술을 시작하기 전에 접착을 방지하기 위해 1L의 식염수 또는 예열된 링거 젖산 용액(39°C)을 추가합니다.
24. 흡수 가능한 봉합사 크기 2의 "X" 스티치(술탄)로 복부 근육을 봉합합니다(술탄).
25. 흡수성 봉합사 크기 2를 사용하여 연속 매트리스 봉합사로 피하 조직을 근사화합니다.
26. 사이즈 2 나일론 봉합사로 단속된 단순 봉합사, 수술용 스테이플 또는 에틸-시아노아크릴레이트 접착제로 피부를 닫습니다. 이 절차에서는 접착제 사용을 선택했습니다.
27. 과산화수소에 적신 거즈로 수술 상처를 세척하고 압박으로 건조시켜 수술 상처에 수술용 접착제의 부착을 강화합니다. 리파마이신(rifamycin)이나 피어슨(Pearson)의 연고를 바르고 거즈로 덮은 다음 수술용 접착제를 바릅니다.
    참고: 상처는 5일 동안 드레싱으로 봉합해야 합니다.

3. 수술 후 관리

1. Luna et ^al.12가 제안한 척도에 따라 적어도 다음 3일 연속 동안 특징적인 임상적 통증의 징후에 대해 동물을 평가합니다.
   참고: 이 척도는 자세, 상호 작용 및 환경에 대한 관심, 활동, 식욕 및 영향을 받는 부위에 대한 관심과 같은 다양한 수준의 통증을 경험할 때 돼지가 나타내는 다양한 행동을 기반으로 합니다. 점수 범위는 평가된 각 매개 변수에 대해 나타난 동작 유형에 따라 0에서 3까지입니다. 평가가 끝나면 모든 점수의 합은 동물이 경험한 통증의 강도를 반영하며, 여기서 0은 통증이 없음을 나타내고 18은 매우 심한 통증¹²를 나타냅니다.
2. 통증, 염증 과정 및 감염을 예방하기 위해 수술 후 관리로 아목시실린 15mg/kg과 2% 멜록시캄 0.4mg/kg을 1회 투여(둔부 또는 자궁경부 근육)하여 3일 동안 1일 동안 투여합니다.
   참고: 통증 점수가 사용된 통증 척도에서 6 이상인 경우(0에서 18까지의 점수) 항염증 및 항생제 외에 하루에 한 번 디피론나트륨/마리당 5,000mg을 근육 주사(둔부 또는 경추 근육)로 투여하십시오. 또는 현지 IACUC 지침에 설명된 대로 진통제를 수행합니다.
3. 수술 후 6일째 되는 날에는 2% 알코올성 클로르헥시딘 용액에 적신 거즈로 상처 세척용 접착제를 제거하고 10일째까지 국소 피어슨 연고를 바르고 이때 봉합사 제거 또는 수술용 스테이플 제거(사용 시)가 권장됩니다.

4. 임신의 초음파 임신 진단

1. 배아 이식 수술 후 30일 후에 초음파 장치(주파수 범위 4.5 - 8.5 MHz)로 경복부 임신 초음파 평가를 수행합니다.
2. 프로브에 초음파 젤을 바르고 내측을 향하도록 서혜부 복부 근처에 위치시킵니다.
   참고: 자궁 내강의 액체로 인한 둥근 무반향 배아 소포의 시각화는 임신을 나타냅니다. 자궁 내 액체가 시각화되지 않거나 배아 소포의 묘사 없이 자궁 내 액체가 존재하면 임신이 없음을 시사합니다.

5. 동물의 안락사

참고: 초음파 검사에서 재태 연령에 해당하는 크기와 외모의 태아가 나타나지 않은 아가미를 안락사시킨다.

1. 40mm x 12mm 바늘을 사용하여 정맥 투여 세트에 부착된 동일한 50mL 주사기에 케타민 15mg/kg과 미다졸람 2mg/kg을 넣고 외이도 꼬리 경부의 승모근에 마취전 약물로 근육 주사합니다.
2. 20G 카테터로 귓바퀴 정맥을 캐뉼레이팅하고 서맥이 발생할 때까지 볼루스에서 4mg/kg의 프로포폴로 정맥 주사로 마취를 유도합니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름).
3. 그 후, 19.1% 염화칼륨 10-20mL를 정맥 주사한다. 심장 부위에 청진기를 대고 호흡 움직임의 부재, 창백한 점막의 부재, 각막 반사의 상실, 심장 박동의 부재를 관찰하여 심폐 정지를 확인합니다.
4. 괴사된 암컷¹³ 으로부터 모든 유형의 자궁 내 내용물(배아 조직, 액체 또는 점액 분비물)을 수집하고, 가능한 병원체를 검출하기 위한 미생물 분석 및 클론의 유전형 특성 분석(필요한 경우)을 위해 이를 전달한다. 황체, 난소 낭종, 비정상적인 분비물의 유무, 자궁, 난소, 난관의 유착 발생 여부를 육안으로 확인한다¹⁴.

결과

이 기사는 복제된 배아를 금박의 난관으로 이식하는 개복술 수술을 시연하는 것을 목표로 합니다. 모든 동물은 마취 회복 중 수술 중 사고나 합병증 없이 적절한 마취 상태에 있었습니다. 수술이 끝난 후 길트가 일어서기까지 평균 2-3시간이 걸렸다.

모든 수술 과정은 평균 44분 동안 지속되었습니다. 9개의 배아가 수술을 받았고, 길트당 평균 185개의 ?...

토론

설명된 수술 방법은 복제 돼지 또는 유전자 변형 복제 돼지의 생산에 종사하는 다른 연구 그룹에 의해 이전에 수행되었으며, 이 기술의 구현 후 출생에 대한 보고가 있습니다 15,16,17,18,19,20. 다양한 세포주에서 생산된 SCNT ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mL straw	generic	-	Surgical material
1 mL syringe	Descarpack	341001	Surgical material
10 mL syringe	Descarpack	324601	Surgical material
20 mL syringe	Descarpack	324801	Surgical material
3 mL syringe	Descarpack	324201	Surgical material
5 mL syringe	Descarpack	324401	Surgical material
60 mL syringe	Descarpack	323201	Surgical material
9 mm endotracheal tube	Rusch	112482-000090	Surgical material
Allis forceps	generic	-	Surgical instrument
Amox LA	JA Saúde Animal	MAPA registration: 8.781/2004	Pharmaceutical drug
Bakhaus forceps	generic	-	Surgical instrument
Catheter 20G	Descarpack	362401	Catheter for intravenous access
Cetamin	Agener União	MAPA registration: SP-000292-5.000011	Anesthetic
Conductive clinical gel	RMC	ANVISA registration: 80122200013	Surgical material
Dipyrone D-500	Zoetis	MAPA registration: SP0000728-46	Pharmaceutical drug
Disposable scalpel n. 22	Wiltex	ANVISA registration: 10150470565	Surgical instrument
Disposable sterile sponge-brush	Rioquimica	7.89778E+12	Surgical asepsis
Easy-Scan:Go	IMV	ESCG01	Ultrasound
Endozime AW Plus	Ruhof	34514	Detergent for surgical instruments
Fentanil (Fentanest)	Cristália	ANVISA registration: 1029800810159	Anesthetic
Gosset retractor	generic	-	Surgical instrument
Halstead-mosquito hemostatic forceps	generic	-	Surgical instrument
Healing ointment - Unguento Pearson	Pearson SA	MAPA registration: SP0000094-16	Pharmaceutical drug
hydrogen peroxide solution	Rioquimica	ANVISA registration: 218690015	Surgical material
Isofluorane	Biochimico	ANVISA registration: 100630222	Anesthetic
IV Drip set extensor	generic	-	Fluid therapy
IV Macro drip set	Descarpack	410301	Fluid therapy
Lactofur (ceftiofur)	Ourofino SA	MAPA registration: SP0000051-50	Pharmaceutical drug
Laringoscope	-	-	Surgical instrument
Maxicam 2%	Ourofino SA	MAPA registration: SP0000051-69	Pharmaceutical drug
Micropore adhesive 5 cm x 10 cm	generic	1530	Surgical material
Midazolam	Hipolabor	ANVISA registration: 1134301430035	Anesthetic
Multi-Way IV Infusion Set	Descarpack	413201	Fluid therapy
Needle 40 mm x 1.2 mm	Descarpack	353601	Sterile needle for applying medicines and anesthetics.
Needle 40 mm x 1.6 mm	Wiltex	ANVISA registration: 10150470664	Sterile needle for applying medicines and anesthetics.
Needle holder	generic	-	Surgical instrument
Nylon 2 suture trhead	Shalon Medical	N502CTI40	Surgical material
Ordinary pen	generic	-	Regular pen for taking notes
Physiological solution 0.9% 500 mL bag	JP Farma	MS:1.0491.0070	Fluid therapy
Polyglycolic acid 2 suture thread	Atramat	G4099-75H	Surgical material
Potassium chloride	Samtec	ANVISA registration: 1559200010139	Parenteral drug
Procedure gloves	Descarpack	122401	Personal Protective Equipment (PPE)
Propofol (Provive)	União Química	ANVISA registration: 1049714490057	Anesthetic
Ringer lactate solution 500 mL bag	JP Farma	MS:1.0491.0061	Fluid therapy
Riohex 0.5% clorexidine alcohol solution	Rioquimica	218690356	Surgical asepsis
Riohex 2% clorexidine solution with surfactant	Rioquimica	218690356	Surgical asepsis
Scalp 21 G	Descarpack	421201	Surgical material
Shoe covers	generic	-	Personal Protective Equipment (PPE)
Sterile compresses	Cremer	ANVISA registration: 10071150065	Surgical material
Sterile gauze pad	Procitex	ANVISA registration: 80245210083	Surgical material
Sterile surgical drapes 140 cm x 90 cm	Venkuri	7010003	Surgical material
Sterile surgical drapes 150 cm x 190 cm	PolarFix	F00208	Surgical material
Sterile surgical gloves	Mucambo	CA: 39.317	Personal Protective Equipment (PPE)
Stethoscope	generic	-	Surgical equipment
Surgical cap	Descarpack	93201	Personal Protective Equipment (PPE)
Surgical gown	Descarpack	231101	Personal Protective Equipment (PPE)
Surgical mask	Descarpack	110701	Personal Protective Equipment (PPE)
Surgical scissors blunt-blunt	generic	-	Surgical instrument
Surgical scissors sharp-sharp	generic	-	Surgical instrument
Surgical stapler	Tradevet	-	Surgical material
Tekbond super glue	Tek Bond	78072720030	Surgical material
Thermometer	generic	-	Surgical equipment
Three Way Stopcock	Solidor	374	Surgical material
Tramadol hydrocloride	Agener União	MAPA registration: SP-000292-5.000002	Anesthetic
Transparent film dressing	Skinupper	ANVISA registration: 82307460014	Surgical material
Waterproof adhesive 10 cm x 4.5 cm	generic	364828	Surgical material