Chirurgia di trasferimento di embrioni tramite laparotomia nelle scrofette

Riepilogo

Questo protocollo descrive l'applicazione della tecnica chirurgica utilizzata per trasferire embrioni di suino clonati tramite laparotomia nelle scrofette.

Abstract

Questo protocollo ha lo scopo di dimostrare la tecnica chirurgica per il trasferimento di embrioni di suino clonati nell'ovidotto, un metodo ampiamente utilizzato nella produzione di suini geneticamente modificati per la ricerca biomedica. Nove scrofette sono state sottoposte a sincronizzazione ormonale e laparotomia per il trasferimento di embrioni clonati prodotti mediante trasferimento nucleare di cellule somatiche (SCNT) in fasi fino a 4 cellule il giorno 2 all'ovidotto. La diagnosi gestazionale è stata condotta tramite esame ecografico 30 giorni dopo l'intervento chirurgico di trasferimento. Sei delle nove scrofette operate hanno mostrato segni di gravidanza all'esame ecografico. Tuttavia, poiché non vi è stata alcuna progressione nello sviluppo fetale come valutato dall'ecografia, le scrofette sono state sottoposte a necroscopia a 60 giorni per la raccolta di materiale biologico e la valutazione del sistema riproduttivo. Sono state osservate aderenze nelle corna uterine, nelle ovaie e negli ovidotti. Dal lume uterino di due delle scrofette eutanasiate, sono state ottenute una e quattro strutture embrionali con età gestazionale compresa tra 12 e 20 giorni. Nonostante l'assenza di suinetti vivi, probabilmente attribuita al basso tasso di efficienza del trasferimento di embrioni di suini clonati, che è influenzato da vari fattori, tra cui il numero e la qualità degli embrioni trasferiti, la tecnica chirurgica presentata si è dimostrata rapida e sicura.

Introduzione

I suini sono un eccellente modello sperimentale per la ricerca biomedica grazie alle loro somiglianze anatomiche, fisiologiche e genetiche con gli esseri umani¹. Questi animali sono stati spesso utilizzati nella ricerca relativa allo xenotrapianto, con l'intenzione di produrre organi, cellule o tessuti che promuovono un basso rischio di rigetto quando trapiantati nell'uomo. La ricerca sugli xenotrapianti mira ad aumentare l'offerta di organi per il trapianto umano, riducendo così la lista d'attesa dei pazienti².

La produzione di suini per lo xenotrapianto prevede diverse fasi, tra cui la produzione di cloni da cellule suine geneticamente modificate. Dopo la produzione in vitro di embrioni clonati geneticamente modificati, gli embrioni vengono trasferiti nel sistema riproduttivo di una scrofa con un ciclo estrale sincronizzato per preparare la fisiologia uterina alla ricezione e alla gestazione del nuovo concetto³.

Il trasferimento di embrioni nei suini può essere effettuato con metodi non invasivi o invasivi⁴. Tra i metodi non invasivi c'è il trasferimento transcervicale, che non richiede alcun intervento chirurgico. Tuttavia, questo metodo è limitato al trasferimento di embrioni nelle fasi di sviluppo successive (ad esempio, stadi di morula o blastocisti) e non consente la determinazione precisa del sito di inserimento del catetere o della deposizione di embrioni⁵. La laparoscopia e la laparotomia sono considerate metodi invasivi di trasferimento degli embrioni. La laparoscopia è meno invasiva ma richiede apparecchiature specifiche e costose, e la sua efficienza varia notevolmente (da meno del 20% a oltre l'80%) a causa di vari fattori come la difficoltà di manipolare le strutture riproduttive e il tipo di catetere utilizzato ^4,6. Pertanto, il trasferimento per laparoscopia è ancora meno efficiente rispetto ai metodi di trasferimento chirurgico per laparotomia⁴.

La chirurgia di trasferimento degli embrioni nelle scrofe tramite laparotomia è una procedura relativamente semplice e veloce, che in genere richiede circa 30 minuti. Tuttavia, dovrebbe essere eseguito in un centro chirurgico dotato di un apparecchio per anestesia inalatoria e di un'équipe specializzata. Per i ceppi di suini commerciali (come Landrace, Large White o i loro incroci), sono necessarie attrezzature speciali come paranchi per il sollevamento delle scrofette e un tavolo chirurgico ampio e robusto a causa del notevole peso degli animali (circa 130-150 kg).

Affinché l'intervento chirurgico abbia successo, gli embrioni devono essere valutati in anticipo per il loro stadio di sviluppo. Si consiglia di trasferire embrioni fino a 4 cellule nella tuba uterina. Gli embrioni in stadi superiori a 4 cellule, come le morelle e le blastocisti, dovrebbero essere trasferiti nel corno uterino ^7,8.

Sebbene gruppi di ricerca in tutto il mondo stiano eseguendo la produzione e il trasferimento chirurgico di embrioni di maiale clonati geneticamente modificati, non esistono ancora protocolli ben definiti che dimostrino questa procedura attraverso i video. Questo approccio è fondamentale per il successo della gestazione, poiché la tecnica richiede una deposizione precisa degli embrioni nella posizione esatta dell'ovidotto, che comporta la localizzazione dell'ostio tubarico e l'introduzione della pipetta contenente gli embrioni. Questa tecnica può essere meglio compresa attraverso video esplicativi dell'intera procedura. Pertanto, questo articolo mira a dimostrare l'intervento chirurgico di laparotomia per il trasferimento di embrioni clonati nell'ovidotto delle scrofette, un prerequisito essenziale per la futura produzione di suini geneticamente modificati da utilizzare per xenotrapianti o altri scopi correlati.

Protocollo

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico per l'Uso degli Animali nella Ricerca del College of Veterinary Medicine and Animal Science dell'Università di San Paolo, numero di protocollo 6088030523. Nove scrofette di sette mesi provenienti dall'allevamento di suini Água Branca, situato nella città di Itu, nello stato di San Paolo, in Brasile, sono state utilizzate subito dopo il secondo rilevamento dell'estro⁹. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Preparazione degli animali

1. Digiunare gli animali per 12 ore e limitare l'accesso all'acqua per 4 ore prima della procedura chirurgica.
2. Utilizzando un ago da 40 mm x 12 mm, aspirare 10 mg/kg di ketamina e 0,2 mg/kg di midazolam nella stessa siringa da 50 ml. Collegare la siringa a un set per la somministrazione endovenosa per facilitare la somministrazione del farmaco, mantenendo una distanza di sicurezza dall'animale e consentendogli di muoversi liberamente.
3. Somministrare il farmaco pre-anestetico tramite iniezione intramuscolare nel muscolo trapezio, caudale al condotto uditivo esterno.
4. Cannulare la vena auricolare con un catetere da 20 G e collegarla a un set di somministrazione di macrogocce per la fluidoterapia intraoperatoria con soluzione di NaCl allo 0,9% alla velocità di 10 mL/kg/h.
5. Indurre l'anestesia con 4 mg/kg di propofol per via endovenosa (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati).
6. Eseguire l'intubazione orotracheale dell'animale utilizzando un laringoscopio e un tubo orotracheale di misura 9 con una cuffia¹⁰.
7. Mantenere l'anestesia con inalazione di isoflurano dall'1,5% al 2%. Inoltre, monitorare l'anestesia valutando parametri fisiologici come la frequenza cardiaca, che deve essere mantenuta tra i 100 e i 120 battiti al minuto, la saturazione di ossigeno, che deve essere mantenuta tra il 99% e il 100%, il rilassamento muscolare, l'assenza di movimento e la valutazione dei riflessi.
   NOTA: Anche la temperatura corporea deve essere monitorata e controllata, rimanendo tra 37,5 e 38,5 °C. Quando necessario, oltre all'isoflurano, il propofol può essere utilizzato per mantenere il controllo dei parametri. Il fentanil cloridrato deve essere somministrato come analgesico alla dose di 0,02 mg/kg ogni 20 minuti. Tutti i parametri devono essere registrati ogni 5 minuti.
8. Somministrare analgesia perioperatoria con una singola dose di 0,002 mg/kg di fentanil per via endovenosa e 4 mg/kg di tramadolo cloridrato per via intramuscolare nel muscolo gluteo o trapezio.
9. Posizionare gli elettrodi cardiaci sulla regione toracica per il monitoraggio intraoperatorio della frequenza cardiaca. Registra la frequenza cardiaca, la temperatura rettale e la saturazione di ossigeno ogni 5 minuti.

2. Procedura chirurgica

1. Posizionare la doratura sul tavolo chirurgico in decubito dorsale.
2. Coprire le zampe dell'animale con guanti procedurali per ridurre al minimo la contaminazione del campo chirurgico.
3. Eseguire la depilazione addominale caudale ventrale tra il penultimo paio di ghiandole mammarie utilizzando un tagliacapelli chirurgico.
4. Eseguire l'antisepsi cutanea preoperatoria con uno spazzolino antisettico impregnato di clorexidina, effettuando movimenti circolari dalla regione della cicatrice ombelicale all'ultimo paio di ghiandole mammarie. Rimuovere la clorexidina con un impacco pulito e inumidito.
5. Assicurarsi che il chirurgo e l'assistente eseguano l'antisepsi chirurgica e indossino camici e guanti chirurgici sterili per l'intervento chirurgico.
   NOTA: L'animale deve essere preparato per l'intervento chirurgico in un'area di preparazione separata dal sito chirurgico.
6. Preparare il tavolo operatorio con gli strumenti appropriati e precedentemente sterilizzati elencati nella Tabella dei Materiali.
7. Eseguire l'antisepsi finale del campo chirurgico utilizzando una garza sterile e un antisettico alla clorexidina, pulendo la regione a lisca di pesce, iniziando dal sito dell'incisione ed espandendosi lateralmente.
8. Ripetere questa procedura tre volte con l'antisettico alla clorexidina, quindi ripetere la procedura con la clorexidina alcolica.
9. Coprire completamente l'animale con un telo chirurgico sterile e, utilizzando le forbici, creare un'apertura rettangolare nel telo chirurgico, di circa 10 x 20 cm², se il telo non è fenestrato.
10. Posizionare il telo chirurgico sul penultimo paio di ghiandole mammarie inguinali. Posizionare 4 morsetti Backhaus per fissare il telo chirurgico sulla pelle dell'animale.
11. Incidere la pelle con un bisturi, creando un'incisione di circa 10 cm di lunghezza.
12. Ottenere l'emostasi dei vasi sottocutanei con una pinza emostatica e/o una sutura riassorbibile di dimensione 2.
13. Sezionare il tessuto sottocutaneo con le dita o con l'ausilio di forbici a punta fine, approfondendo l'incisione fino a raggiungere la linea alba nella muscolatura addominale.
    NOTA: Palpare la linea mediana dell'addome per sentire la linea alba come una zona più rigida e fibrosa; Osservare la separazione dei muscoli retti dell'addome e notare il cambiamento nella consistenza dei tessuti durante la dissezione per identificare accuratamente la linea alba ¹¹.
14. Con la pinza Allis, afferrare la muscolatura e sollevarla per praticare un'incisione a pugnalata nella linea alba con un bisturi.
15. Inserire il dito indice nell'incisione per valutare la presenza di aderenze. Estendere l'incisione sulla linea alba caudalmente e cranialmente con forbici smussate/smussate o fini/smussate con attenzione per evitare di ferire altri organi e strutture sottostanti.
16. Praticare un'incisione di lunghezza sufficiente in modo che l'unica mano del chirurgo possa essere inserita nella cavità addominale per localizzare ed esteriorizzare le corna uterine e/o le ovaie. Un divaricatore Gosset può essere utilizzato per facilitare l'ingresso nella cavità addominale e la sutura della muscolatura in un unico strato al termine della procedura.
17. Se una delle corna uterine si trova prima delle ovaie, seguirla delicatamente fino a raggiungere la punta delle corna uterine e l'ovaio omolaterale. Durante questa procedura, valutare la presenza di liquido all'interno dell'utero, che può compromettere la gestazione.
18. Dopo aver individuato l'ovaio, tirarlo delicatamente ed esporlo con cura. Valutare la presenza di follicoli pre-ovulatori, corpi lutei emorragici, corpi lutei ciclici e corpi albici per valutare se la sincronizzazione della scrofa è quella prevista.
19. Rimuovere delicatamente le fimbrie della tuba uterina che copre l'ovaio, estrofrangere la mucosa e individuare l'ostio della tuba uterina.
    NOTA: Se il chirurgo ha difficoltà ad identificare l'ostio delle fimbrie, si può praticare una tasca sull'ampolla dell'ovidotto con un ago da sutura a corpo tondo, evitando di perforare i vasi sanguigni, per inserire il catetere Tomcat contenente gli embrioni.
20. Inserire con cautela un catetere Tomcat contenente gli embrioni nell'ostio delle fimbrie fino a raggiungere la regione dell'ampolla della tuba uterina.
21. Collegare una siringa da 1 ml al catetere Tomcat per spingere il liquido contenente l'embrione nella tuba uterina. Copri l'ovaio con le fimbrie e rimettilo nella cavità addominale.
22. Individuare il corno uterino controlaterale e l'ovaio e ripetere i passaggi 2.17-2.21.
23. Riposizionare le strutture all'interno della cavità addominale e aggiungere 1 L di soluzione salina o soluzione di lattato di Ringer riscaldata (39 °C) per prevenire aderenze prima di iniziare l'addominorrafia.
24. Sutura la muscolatura addominale con sutura riassorbibile misura 2 in punti a "X" (Sultano) interrotti.
25. Approssimare il tessuto sottocutaneo con una sutura continua a materasso utilizzando una sutura riassorbibile misura 2.
26. Chiudere la pelle con una sutura di nylon misura 2 in punti semplici interrotti, graffette chirurgiche o adesivo etil-cianoacrilato. In questa procedura, abbiamo optato per l'uso dell'adesivo.
27. Pulire la ferita chirurgica con una garza imbevuta di perossido di idrogeno e asciugare con un impacco per migliorare la fissazione dell'adesivo chirurgico sulla ferita chirurgica. Applicare la rifamicina o l'unguento di Pearson, coprire con una garza e, infine, applicare l'adesivo chirurgico.
    NOTA: La ferita deve rimanere chiusa con una medicazione per 5 giorni.

3. Cure postoperatorie

1. Valutare gli animali per segni di dolore clinico caratteristico per almeno i successivi 3 giorni consecutivi, secondo la scala proposta da Luna et ^al.12.
   NOTA: Questa scala si basa sui diversi comportamenti esibiti dai suini quando sperimentano diversi livelli di dolore, come la postura, l'interazione e l'interesse per l'ambiente, l'attività, l'appetito e l'attenzione all'area interessata. Il punteggio va da 0 a 3, a seconda del tipo di comportamento esibito, per ogni parametro valutato. Al termine della valutazione, la somma di tutti i punteggi riflette l'intensità del dolore provato dall'animale, dove 0 rappresenta nessun dolore e 18 rappresenta un dolore molto intenso¹².
2. Somministrare una singola dose di 15 mg/kg di amoxicillina e 0,4 mg/kg di meloxicam al 2% sia per via intramuscolare (nel muscolo gluteo o cervicale) una volta al giorno per 3 giorni come cura postoperatoria per prevenire il dolore, i processi infiammatori e le infezioni.
   NOTA: Se il punteggio del dolore è uguale o superiore a 6 sulla scala del dolore utilizzata (punteggio da 0 a 18), somministrare 5.000 mg/animale di dipirone di sodio per via intramuscolare (nel muscolo gluteo o cervicale) una volta al giorno in aggiunta all'antinfiammatorio e all'antibiotico. In alternativa, eseguire l'analgesia come indicato nelle linee guida IACUC locali.
3. Il 6° giorno dopo l'intervento, rimuovere l'adesivo chirurgico per la pulizia della ferita con una garza imbevuta di soluzione alcolica di clorexidina al 2% e applicare l'unguento topico di Pearson fino al 10° giorno, quando si consiglia la rimozione della sutura o la rimozione delle graffette chirurgiche, se utilizzate.

4. Diagnosi gestazionale ecografica della gravidanza

1. Eseguire la valutazione ecografica transaddominale della gravidanza con un dispositivo a ultrasuoni (gamma di frequenza da 4,5 a 8,5 MHz) 30 giorni dopo l'intervento chirurgico di trasferimento dell'embrione.
2. Applicare il gel per ultrasuoni sulla sonda e posizionarla vicino alla regione addominale inguinale, rivolta medialmente.
   NOTA: La visualizzazione di vescicole embrionali anecoiche arrotondate, dovute al liquido nel lume uterino, indica la gestazione. La mancata visualizzazione del liquido intrauterino, o la presenza di liquido intrauterino senza la delineazione delle vescicole embrionali, suggerisce l'assenza di gestazione.

5. Eutanasia degli animali

NOTA: All'esame ecografico sopprimere le scrofette che non presentavano feti di dimensioni e aspetto corrispondenti all'età gestazionale.

1. Utilizzando un ago da 40 mm x 12 mm, prelevare 15 mg/kg di ketamina e 2 mg/kg di midazolam nella stessa siringa da 50 ml collegata a un set di somministrazione endovenosa e somministrare per via intramuscolare nel muscolo trapezio nella regione cervicale caudale al condotto uditivo esterno, come farmaco preanestetico.
2. Incannulare la vena auricolare con un catetere da 20 G e indurre l'anestesia con 4 mg/kg di propofol per via endovenosa in bolo fino a quando non si verifica la bradicardia (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati).
3. Successivamente, somministrare da 10 a 20 ml di cloruro di potassio al 19,1% per via endovenosa. Confermare l'arresto cardiopolmonare osservando l'assenza di movimenti respiratori, le mucose pallide, la perdita del riflesso corneale e l'assenza di battiti cardiaci posizionando uno stetoscopio sulla regione cardiaca.
4. Raccogliere qualsiasi tipo di contenuto intrauterino (tessuto embrionale, secrezioni liquide o mucose) da femmine sottoposte a necroscopia¹³ e inviarlo per l'analisi microbiologica per rilevare possibili agenti patogeni e anche per la caratterizzazione genotipica dei cloni (se necessario). Controllare visivamente la presenza o l'assenza di corpi lutei, cisti ovariche, secrezioni anomale e la presenza di aderenze nell'utero, nelle ovaie e negli ovidotti¹⁴.

Risultati

Questo articolo ha lo scopo di dimostrare l'intervento di laparotomia per il trasferimento di embrioni clonati nell'ovidotto delle scrofette. Tutti gli animali sono rimasti in un piano anestetico adeguato, senza incidenti intraoperatori o complicazioni durante il recupero in anestesia. Le scrofette impiegavano, in media, 2-3 ore per alzarsi dopo la fine dell'intervento.

Tutte le procedure chirurgiche sono durate, in media, 44 minuti. Nove scrofette sono state ...

Discussione

Il metodo chirurgico descritto è stato precedentemente eseguito da altri gruppi di ricerca che lavorano con la produzione di suini clonati o suini clonati geneticamente modificati, con segnalazioni di nascite dopo l'implementazione di questa tecnica 15,16,17,18,19,20. I tassi di gravidanza e...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mL straw	generic	-	Surgical material
1 mL syringe	Descarpack	341001	Surgical material
10 mL syringe	Descarpack	324601	Surgical material
20 mL syringe	Descarpack	324801	Surgical material
3 mL syringe	Descarpack	324201	Surgical material
5 mL syringe	Descarpack	324401	Surgical material
60 mL syringe	Descarpack	323201	Surgical material
9 mm endotracheal tube	Rusch	112482-000090	Surgical material
Allis forceps	generic	-	Surgical instrument
Amox LA	JA Saúde Animal	MAPA registration: 8.781/2004	Pharmaceutical drug
Bakhaus forceps	generic	-	Surgical instrument
Catheter 20G	Descarpack	362401	Catheter for intravenous access
Cetamin	Agener União	MAPA registration: SP-000292-5.000011	Anesthetic
Conductive clinical gel	RMC	ANVISA registration: 80122200013	Surgical material
Dipyrone D-500	Zoetis	MAPA registration: SP0000728-46	Pharmaceutical drug
Disposable scalpel n. 22	Wiltex	ANVISA registration: 10150470565	Surgical instrument
Disposable sterile sponge-brush	Rioquimica	7.89778E+12	Surgical asepsis
Easy-Scan:Go	IMV	ESCG01	Ultrasound
Endozime AW Plus	Ruhof	34514	Detergent for surgical instruments
Fentanil (Fentanest)	Cristália	ANVISA registration: 1029800810159	Anesthetic
Gosset retractor	generic	-	Surgical instrument
Halstead-mosquito hemostatic forceps	generic	-	Surgical instrument
Healing ointment - Unguento Pearson	Pearson SA	MAPA registration: SP0000094-16	Pharmaceutical drug
hydrogen peroxide solution	Rioquimica	ANVISA registration: 218690015	Surgical material
Isofluorane	Biochimico	ANVISA registration: 100630222	Anesthetic
IV Drip set extensor	generic	-	Fluid therapy
IV Macro drip set	Descarpack	410301	Fluid therapy
Lactofur (ceftiofur)	Ourofino SA	MAPA registration: SP0000051-50	Pharmaceutical drug
Laringoscope	-	-	Surgical instrument
Maxicam 2%	Ourofino SA	MAPA registration: SP0000051-69	Pharmaceutical drug
Micropore adhesive 5 cm x 10 cm	generic	1530	Surgical material
Midazolam	Hipolabor	ANVISA registration: 1134301430035	Anesthetic
Multi-Way IV Infusion Set	Descarpack	413201	Fluid therapy
Needle 40 mm x 1.2 mm	Descarpack	353601	Sterile needle for applying medicines and anesthetics.
Needle 40 mm x 1.6 mm	Wiltex	ANVISA registration: 10150470664	Sterile needle for applying medicines and anesthetics.
Needle holder	generic	-	Surgical instrument
Nylon 2 suture trhead	Shalon Medical	N502CTI40	Surgical material
Ordinary pen	generic	-	Regular pen for taking notes
Physiological solution 0.9% 500 mL bag	JP Farma	MS:1.0491.0070	Fluid therapy
Polyglycolic acid 2 suture thread	Atramat	G4099-75H	Surgical material
Potassium chloride	Samtec	ANVISA registration: 1559200010139	Parenteral drug
Procedure gloves	Descarpack	122401	Personal Protective Equipment (PPE)
Propofol (Provive)	União Química	ANVISA registration: 1049714490057	Anesthetic
Ringer lactate solution 500 mL bag	JP Farma	MS:1.0491.0061	Fluid therapy
Riohex 0.5% clorexidine alcohol solution	Rioquimica	218690356	Surgical asepsis
Riohex 2% clorexidine solution with surfactant	Rioquimica	218690356	Surgical asepsis
Scalp 21 G	Descarpack	421201	Surgical material
Shoe covers	generic	-	Personal Protective Equipment (PPE)
Sterile compresses	Cremer	ANVISA registration: 10071150065	Surgical material
Sterile gauze pad	Procitex	ANVISA registration: 80245210083	Surgical material
Sterile surgical drapes 140 cm x 90 cm	Venkuri	7010003	Surgical material
Sterile surgical drapes 150 cm x 190 cm	PolarFix	F00208	Surgical material
Sterile surgical gloves	Mucambo	CA: 39.317	Personal Protective Equipment (PPE)
Stethoscope	generic	-	Surgical equipment
Surgical cap	Descarpack	93201	Personal Protective Equipment (PPE)
Surgical gown	Descarpack	231101	Personal Protective Equipment (PPE)
Surgical mask	Descarpack	110701	Personal Protective Equipment (PPE)
Surgical scissors blunt-blunt	generic	-	Surgical instrument
Surgical scissors sharp-sharp	generic	-	Surgical instrument
Surgical stapler	Tradevet	-	Surgical material
Tekbond super glue	Tek Bond	78072720030	Surgical material
Thermometer	generic	-	Surgical equipment
Three Way Stopcock	Solidor	374	Surgical material
Tramadol hydrocloride	Agener União	MAPA registration: SP-000292-5.000002	Anesthetic
Transparent film dressing	Skinupper	ANVISA registration: 82307460014	Surgical material
Waterproof adhesive 10 cm x 4.5 cm	generic	364828	Surgical material