大脑中动脉闭塞再灌注的改良模型制备

摘要

该协议描述了准备通过颈总动脉进行大脑中动脉闭塞再灌注的过程。

摘要

大脑中动脉闭塞再灌注 （MCAO/R） 模型对于理解卒中的病理机制和药物开发至关重要。然而，在常用的建模方法中，小泉法由于结扎颈总动脉 （CCA） 且无法实现足够的再灌注而经常面临审查。同样，Longa 方法因断开和结扎颈外动脉 （ECA） 而受到批评。本研究旨在介绍一种改进的模型制备方法，该方法保留了 ECA 的完整性，包括通过 CCA 插入单丝尼龙缝合线，修复结扎的 CCA 切口，并维持 CCA 的再灌注。使用激光斑点流成像确认血流再灌注。Longa 量表、改良神经严重程度评分、氯化三苯基四唑 （TTC） 染色和神经元免疫荧光标记等评估方法表明，这种方法可以诱导稳定的缺血性神经损伤。这种改进的 MCAO/R 模型方案简单稳定，为脑缺血领域的从业者提供了有价值的指导。

引言

根据世界卫生组织的数据，在过去十年中，中风一直是全球第二大死因，发病率高、死亡率高、残疾率高 ^1,2。随着全球人口老龄化，预计发展中国家的中风发病率将增加，可能成为成人过早死亡和残疾的主要原因。此外，中风有发生在年轻年龄的趋势³。中风后劳动力的流失也给家庭和社会带来了沉重的负担⁴。因此，开发安全有效的治疗方法对中风研究构成了重大挑战。

动物模型是研究人类疾病预防和治疗的重要工具。卒中治疗策略的成功转化取决于卒中动物模型的可重复性和可靠性 ^5,6。大脑中动脉 （MCA） 是临床卒中的常见部位，使 MCAO 模型成为最接近人类缺血性卒中的模型。使用缝合法制备的 MCAO 模型因其无需开颅手术和易于控制缺血时间等优点而受到研究人员的青睐。它已被用于超过 40% 的神经保护实验⁷。然而，尽管它有许多优点，但该模型的操作细节对许多研究人员来说仍然是一个有争议的话题。

对于缝合诱导的大脑中动脉闭塞 （MCAO） 模型，通过撤回缝合线进行再灌注。目前，缝合插入主....

研究方案

实验方案是按照成都中医药大学实验动物使用和机构动物护理和使用委员会指南（记录编号：2019-DL-002）进行的。所有动物研究数据均按照 ARRIVE（动物研究 ：体内实验 报告）指南进行记录。本研究使用体重 250 g ± 20 g 且年龄为 6-8 周龄的雄性 Sprague Dawley （SD） 大鼠。有关所用动物、试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 动物准备

1. 使用 Zoletil 50 （50mg/kg， IM） 和盐酸甲苯噻嗪 （40mg/kg， IP） 诱导并维持大鼠的深度麻醉。确保在整个手术过程中使用连接到加热垫的直肠探针将体温保持在 37 ± 0.5 °C。在大鼠的眼睛上涂抹兽药膏，以防止它们干燥。
2. 剃掉大鼠头部和颈部的毛发。使用脱毛膏去除头部和颈部的皮毛，然后用生理盐水洗掉乳霜。使用无菌棉球涂抹乙醇和聚维酮碘 3 次，对手术部位的皮肤进行消毒。
3. 用手术刀沿矢状缝合线的方向在大鼠头部中间切开 2 厘米，小心地去除覆盖颅骨的肌肉。
4. 使用颅骨钻头将大鼠缺血侧的颅骨变薄。在研磨过程中使用生理盐水冷却并清除碎屑。使用激光散斑对比成像 （LSCI） 记录大鼠的基线血流。
5. 使用无菌棉球将乙醇和聚维酮碘涂抹在颈部皮肤上 3 次。使用手术刀片沿颈部中线切开 2 厘米。使用牵开器横向拉....

结果

激光斑点血流成像显示，在单丝尼龙缝合线闭塞前，大脑中动脉 （MCA） 区血流充沛，记录大鼠基线血流值。MCA 闭塞后，大脑缺血侧的血流值迅速下降。在撤回缝线之前，重新检查缺血侧的血流值，以确认缝线是否阻塞了 MCA。结果表明血流仅发生轻微变化。撤回缝合线后，血流灌注迅速恢复（图2）。 视频 1 还显示了颈总动脉的强劲充盈脉搏，表明该方法可以?.......

讨论

由单丝尼龙缝合线诱导的大脑中动脉闭塞 （MCAO） 模型是制备 MCAO 模型的最常用方法。这种方法在临床前研究中被广泛采用，并因其简单、无需开颅手术、手术创伤最小以及能够实现再灌注而获得许多从业者的认可。

腔内细丝 MCAO 有两种经典的手术技术：小泉法⁸ 和 Longa 法⁹。这些方法之间的主要区别在于如何引入缝合线以闭塞 MCA。在 Koizu.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal anesthesia system	Rayward Life Technology Co., Ltd	R500IE
Animal temperature maintainer	Rayward Life Technology Co., Ltd	69020
Cy3 secondary antibody	Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd	GB21303
DAP1 antibody	Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd	G1012
DCX antibody	Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd	GB13434
Goat serum	Beyotime Biotechnology Co., LTD	C0265
GraphPad Prism	GraphPad Software	GraphPad Prism 8.0
ImageJ	National Institutes of Health	ImageJ software
Isofluran	Rayward Life Technology Co., Ltd	R510-22
Laser speckle blood flow imaging system	Rayward Life Technology Co., Ltd	PeriCam PSI NR
MAP-2 antibody	Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd	GB11128
Miniature hand-held skull drill	Rayward Life Technology Co., Ltd	87001
monofilament suture	Rayward Life Technology Co., Ltd	250-280g
NeuN antibody	Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd	GB11138
OCT embedding agent	BIOSHARP	BL557A
Penicillin sodium	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	17121709-2
Quick Antigen Retrieval Solution for Frozen Sections	Beyotime Biotechnology Co., LTD	P0090
SD rats	SPF ( Beijing ) Biotechnology Co.,Ltd.	250-280g
Triton X-100	Beyotime Biotechnology Co., LTD	ST795
TTC	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	2019030101