Preparação de um modelo modificado para reperfusão de oclusão da artéria cerebral média

Resumo

Este protocolo descreve o processo de preparação para a reperfusão da oclusão da artéria cerebral média através da artéria carótida comum.

Resumo

O modelo de reperfusão de oclusão da artéria cerebral média (MCAO/R) é crucial para a compreensão dos mecanismos patológicos do AVC e para o desenvolvimento de medicamentos. No entanto, entre os métodos de modelagem comumente usados, o método de Koizumi frequentemente enfrenta escrutínio devido à sua ligadura da artéria carótida comum (CCA) e sua incapacidade de alcançar reperfusão adequada. Da mesma forma, o método de Longa tem sido criticado por desconectar e ligar a artéria carótida externa (ECA). Este estudo tem como objetivo apresentar um método de preparo de modelo modificado que preserve a integridade da ECA, envolva a inserção de uma sutura de náilon monofilamentar através da CCA, reparando a incisão ligada da CCA e mantendo a reperfusão da CCA. A reperfusão do fluxo sanguíneo foi confirmada por meio de imagens de fluxo de manchas a laser. Métodos de avaliação como a escala de Longa, Modified Neurological Severity Score, coloração com cloreto de trifeniltetrazólio (TTC) e marcação de imunofluorescência de neurônios demonstraram que essa abordagem poderia induzir danos estáveis ao nervo isquêmico. Este protocolo de modelo MCAO/R modificado é simples e estável, fornecendo orientação valiosa para os profissionais no campo da isquemia cerebral.

Introdução

De acordo com a Organização Mundial da Saúde, o AVC permaneceu como a segunda principal causa de morte em todo o mundo na última década, com alta taxa de incidência, alta mortalidade e alta taxa de incapacidade ^1,2. À medida que a população global envelhece, espera-se que a incidência de AVC aumente nos países em desenvolvimento, tornando-se potencialmente a principal causa de morte prematura e incapacidade em adultos. Além disso, há uma tendência de ocorrência de acidentes vasculares cerebrais em uma idade mais jovem³. A perda da força de trabalho após um AVC também sobrecarrega as famílias e a sociedade⁴. Portanto, o desenvolvimento de tratamentos seguros e eficazes representa um grande desafio na pesquisa do AVC.

Os modelos animais servem como ferramentas cruciais para estudar a prevenção e o tratamento de doenças humanas. A tradução bem-sucedida das estratégias de tratamento do AVC depende da reprodutibilidade e confiabilidade dos modelos animais de AVC ^5,6. A artéria cerebral média (ACM) é um local comum para AVC clínico, tornando o modelo MCAO o modelo mais próximo do AVC isquêmico humano. O modelo MCAO, elaborado pelo método de sutura, tem sido favorecido pelos pesquisadores devido a vantagens como a ausência de craniotomia e o fácil controle do tempo isquêmico. Tem sido utilizado em mais de 40% dos experimentos neuroprotetores⁷. No entanto, apesar de suas inúmeras vantagens, os detalhes operacionais desse modelo permanecem um tópico controverso para muitos pesquisadores.

Para o modelo de oclusão da artéria cerebral média induzida por sutura (MCAO), a reperfusão ocorre pela retirada da sutura. Atualmente, dois métodos principais são usados para a inserção da sutura: o método de Koizumi⁸ e o método de Longa⁹. No método de Koizumi, a sutura entra na artéria carótida interna (ACI) principalmente através da incisão da artéria carótida comum (ACC), enquanto no método de Longa, passa pela artéria carótida externa (ACE) cortada para a ACI. Durante a reperfusão, o método de Koizumi requer a ligação permanente da incisão da ACC e depende do círculo de Willis para a reperfusão¹⁰. No entanto, alguns estudos sugerem que a reperfusão efetiva não pode ser alcançada apenas por meio do suprimento compensatório do círculo de Willis após a perda do suprimento de CCA. Além disso, o círculo de Willis exibe alta variabilidade anatômica, especialmente em camundongos C57Bl/6, aumentando a variabilidade do infarto e reduzindo a confiabilidade dos dados experimentais. Consequentemente, esse método tem sido cada vez mais questionado por pesquisadores¹¹.

O método de Longa envolve a inserção de uma sutura através da ACE cortada e, em seguida, a ligação permanente da artéria carótida interna (ACI) assim que a sutura é retirada. Isso preserva a permeabilidade da CCA, permitindo a perfusão sanguínea de até 100% dos valores basais. No entanto, esse método requer a separação da artéria carótida externa e pequenos ramos arteriais, cortando-os ou eletrocoagulando-os, tornando o procedimento desafiador. Também interrompe a estrutura completa do fluxo sanguíneo do cérebro, que difere do estado clínico^{do paciente 12}. É importante ressaltar que estudos indicam que o corte ou ligadura da ECA pode causar lesões isquêmicas nos músculos que controlam a mastigação e a deglutição, afetando a dieta animal e levando à morte pós-operatória do animal e danos sensoriais e motores graves em ratos^13,14.

Portanto, um método de preparação de modelo modificado é urgentemente necessário para resolver esses problemas. Este estudo apresenta um método de modelagem MCAO modificado que repara a incisão de inserção do CCA e alcança uma reperfusão eficaz. O procedimento é simples, prático e viável, induzindo danos neurológicos significativos e lesões replicáveis de infarto e fornecendo orientações valiosas para pesquisadores de AVC.

Protocolo

O protocolo experimental foi conduzido em conformidade com as diretrizes do Comitê de Uso e Uso de Animais de Laboratório e Cuidados Institucionais com Animais da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (número de registro: 2019-DL-002). Todos os dados de pesquisa com animais foram documentados seguindo as diretrizes ARRIVE (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments). Ratos machos da raça Sprague Dawley (SD) pesando 250 g ± 20 g e com idade entre 6 e 8 semanas foram utilizados para este estudo. As especificidades sobre os animais, reagentes e equipamentos empregados estão listadas na Tabela de Materiais.

1. Preparação animal

1. Induzir e manter anestesia profunda em ratos usando Zoletil 50 (50mg/kg, IM) e Cloridrato de Xilazina (40mg/kg, IP). Certifique-se de que a temperatura corporal seja mantida em 37 ± 0.5 °C usando uma sonda retal conectada a uma almofada de aquecimento durante todo o procedimento cirúrgico. Aplique pomada veterinária nos olhos do rato para evitar que sequem.
2. Raspe o cabelo da cabeça e pescoço dos ratos. Use creme depilatório para remover o pelo da cabeça e pescoço e, em seguida, lave o creme com soro fisiológico. Desinfetar a pele no local da cirurgia aplicando etanol e iodopovidona três vezes com bolas de algodão estéreis.
3. Faça uma incisão de 2 cm no meio da cabeça do rato ao longo da direção da sutura sagital usando um bisturi e remova cuidadosamente os músculos que cobrem o crânio.
4. Afine o crânio no lado isquêmico do rato usando uma broca de crânio. Use solução salina normal para resfriar e remover detritos durante o processo de moagem. Registre o fluxo sanguíneo basal dos ratos usando imagens de contraste de manchas a laser (LSCI).
5. Aplique etanol e iodopovidona três vezes na pele do pescoço usando bolas de algodão estéreis. Faça uma incisão de 2 cm ao longo da linha média do pescoço usando uma lâmina cirúrgica. Use afastadores para puxar lateralmente a pele e as glândulas salivares, expondo os músculos esternocleidomastóideo e cervical.
6. Separe os músculos esternocleidomastóideo e cervical para expor o território carotídeo. Identifique a anatomia vascular da artéria carótida comum (ACC), da artéria carótida interna (ACI) e da artéria carótida externa (ACE). Com base na anatomia vascular, separe a ACC, bem como a ECA derivada da CCA e a ICA¹⁵.
   NOTA: A estrutura anatômica do rato indica que a região CCA é coberta principalmente pelos músculos esternocleidomastóideo e cervical, com a ACI e a ECA derivadas da CCA. Depois que a separação expõe o CCA, um garfo em forma de Y pode ser visto ao longo do CCA, representando o ICA e o ECA. Tenha cuidado para não danificar o nervo vago, que corre paralelo ao CCA.

2. Oclusão do MCA

1. Dê um nó facilmente desembaraçado sobre a artéria carótida externa (ECA) e a artéria carótida comum (CCA) usando um fio de seda 3-0 para bloquear temporariamente o fluxo sanguíneo. Posicione um clipe de vaso no CCA a aproximadamente 0.5 cm do primeiro nó.
   1. Pinte a agulha de uma seringa de 5 mL de preto. Faça um pequeno furo no CCA usando a agulha tingida de preto e marque os orifícios em preto.
2. Insira a sutura de náilon monofilamento no CCA através da marca preta. Abra o clipe vascular e guie o fio de náilon na Artéria Carótida Interna (ACI) até que ele pare com leve resistência. Aperte o segundo nó com segurança para manter a sutura de náilon monofilamento no lugar dentro da artéria, evitando o deslocamento da posição de bloqueio.
3. Observe o tempo de isquemia neste ponto e meça o valor do fluxo sanguíneo no lado isquêmico usando LSCI. Administre gotas de bupivacaína na ferida do pescoço para analgesia e fechamento da ferida. Remova a máscara de anestesia e permita que o rato se recupere.
   NOTA: Se a sutura de náilon monofilamentar tiver dificuldade em entrar na ACI, retraia-a ligeiramente e tente inserir novamente.

3. Reperfusão de MCAO

1. Após 90 min de isquemia, reanestesiar os ratos com isoflurano. Meça o fluxo sanguíneo cerebral do lado isquêmico usando LSCI e certifique-se de que a sutura de náilon monofilamentar não tenha se deslocado.
2. Desatar os nós na artéria carótida externa (ECA) para permitir a reperfusão sanguínea. Solte o nó na artéria carótida comum (CCA), prenda a sutura do monofilamento e retire a sutura. Aplique um clipe vascular antes da sutura de monofilamento fixa para evitar sangramento.
3. Substitua o primeiro nó CCA por um clipe vascular. Use uma pinça para girar a incisão do vaso lateralmente (Figura 1). Prenda a incisão com uma pinça e ligue-a com fio 6-0 para reparar a incisão. Remova o clipe vascular, verifique se há vazamentos e confirme a reperfusão completa (Vídeo 1).
   NOTA: Realize a ligadura para reparar a incisão para evitar o pinçamento excessivo do vaso, o que pode levar à estenose CCA.
4. Registre os valores do fluxo sanguíneo cortical cerebral usando LSCI após a ligadura da incisão para confirmar a reperfusão bem-sucedida. Feche a incisão cervical com suturas e administre 1,00,000 unidades de penicilina e 2 mL de solução salina para prevenir infecção e desidratação.
5. Mantenha o calor até que os ratos recuperem a consciência. Ofereça alimentos macios pós-operatórios e monitore os sinais vitais dos animais.

4. Avaliação da função nervosa e lesão isquêmica cerebral

1. Uma vez que os ratos tenham despertado completamente, sua função neural será avaliada por pesquisadores que desconhecem o agrupamento de animais. Utilize a escala de pontuação de Longa (Tabela 1) e a escala de pontuação de gravidade neurológica modificada (mNSS) (Tabela 2) para avaliar a função neurológica de todos os ratos.
2. Após 24 h pós-operatório, eutanasiar os ratos sob anestesia induzida por isoflurano (isoflurano a 4% a 4 L/min de oxigênio) via luxação cervical¹⁶ (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Enxágue o cérebro com água gelada para remover o sangue restante.
3. Divida o tecido cerebral em 5 seções e core-as com TTC. Capture imagens de ambos os lados das fatias de tecido cerebral, meça a área isquêmica da frente e de trás usando o software Image J e calcule a taxa de infarto usando a seguinte fórmula:
   
   NOTA: S₁ e S₂ representam a área do infarto dos lados proximal do prosencéfalo e do tronco encefálico proximal das fatias cerebrais, respectivamente. A área do infarto de cada fatia do cérebro é corrigida usando a fórmula de Swanson, onde h representa a espessura da fatia do cérebro. Essa fórmula, previamente delineada pelo autor em pesquisas anteriores¹⁷, permite um cálculo mais preciso do tamanho da lesão do infarto.
4. Analise os dados usando software estatístico e gráfico para avaliar a taxa de sucesso e a estabilidade do modelo.
5. Empregue o método de imunofluorescência para marcar neurônios corticais em ratos, validando ainda mais o dano neuronal causado por este método. Após 24 h de isquemia-reperfusão em ratos, foi realizada perfusão cardíaca com PBS pré-resfriado para obtenção de tecido cerebral.
6. Incorpore e congele o tecido cerebral em seções. Use anticorpos neuronais, como o marcador neuronal imaturo Doublecortin (DCX)¹⁸, o marcador de núcleo neuronal Neuronal Nuclei (NeuN)¹⁸ e o marcador dendrítico de neurônios Microtubule-associated protein-2 (MAP-2)¹⁹. Observe a expressão de neurônios isquêmicos usando microscopia confocal a laser.

Resultados

A imagem de fluxo de manchas a laser demonstrou que, antes da oclusão da sutura de náilon monofilamentar, havia fluxo sanguíneo abundante na área da artéria cerebral média (ACM), e os valores basais de fluxo sanguíneo dos ratos foram registrados. Após a oclusão da ACM, o valor do fluxo sanguíneo no lado isquêmico do cérebro diminuiu rapidamente. Antes de retirar a sutura, os valores do fluxo sanguíneo no lado isquêmico foram verificados novamente para confirmar se a sutura estava ocluindo a ACM. Os resultad...

Discussão

O modelo de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) induzido por uma sutura de náilon monofilamentar é o método mais comum usado para a preparação de modelos MCAO. Essa abordagem é amplamente adotada em estudos pré-clínicos e ganhou reconhecimento de muitos profissionais devido à sua simplicidade, falta de necessidade de craniotomia, trauma cirúrgico mínimo e capacidade de obter reperfusão.

Existem duas técnicas cirúrgicas clássicas para o filamento intraluminal MCAO: o mét...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal anesthesia system	Rayward Life Technology Co., Ltd	R500IE
Animal temperature maintainer	Rayward Life Technology Co., Ltd	69020
Cy3 secondary antibody	Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd	GB21303
DAP1 antibody	Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd	G1012
DCX antibody	Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd	GB13434
Goat serum	Beyotime Biotechnology Co., LTD	C0265
GraphPad Prism	GraphPad Software	GraphPad Prism 8.0
ImageJ	National Institutes of Health	ImageJ software
Isofluran	Rayward Life Technology Co., Ltd	R510-22
Laser speckle blood flow imaging system	Rayward Life Technology Co., Ltd	PeriCam PSI NR
MAP-2 antibody	Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd	GB11128
Miniature hand-held skull drill	Rayward Life Technology Co., Ltd	87001
monofilament suture	Rayward Life Technology Co., Ltd	250-280g
NeuN antibody	Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd	GB11138
OCT embedding agent	BIOSHARP	BL557A
Penicillin sodium	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	17121709-2
Quick Antigen Retrieval Solution for Frozen Sections	Beyotime Biotechnology Co., LTD	P0090
SD rats	SPF ( Beijing ) Biotechnology Co.,Ltd.	250-280g
Triton X-100	Beyotime Biotechnology Co., LTD	ST795
TTC	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	2019030101