视网膜脉管系统中糖尿病诱导的贴壁白细胞的定量

摘要

我们展示了一种标记视网膜脉管系统和贴壁白细胞壁的方法。然后可以在荧光显微镜下将这些贴壁白细胞计数为炎症或炎症对治疗的反应的参数。

摘要

白细胞淤积是指白细胞附着在脉管系统的管腔壁上。白细胞与血管壁的这种相互作用是炎症的特征，并且与各种组织和疾病（包括糖尿病性视网膜病变）的毛细血管阻塞有因果关系。

多年来，白细胞淤积一直被报道为白细胞增多症的一种危及生命的并发症，只能通过临床诊断。鉴于这种现象的重要性，已经进行了深入的研究以了解导致其表现的潜在机制;然而，在实验室环境中没有金标准技术来可视化和量化事件的严重程度。

在下面总结的方法中，最初用缓冲液灌注脉管系统以去除血液，然后将伴刀豆球蛋白 A 灌注到脉管系统中，在那里它与所有暴露的细胞壁结合并导致白细胞特别亮的染色。如果灌注去除所有未结合的血细胞成功，则剩余的荧光标记的白细胞将与脉管系统结合，并且可以使用任何可用的荧光显微镜手动定量它们。

引言

白细胞（白细胞，WBC）在脉管系统的最佳功能中起着重要作用，例如维持血液流动性和调节血栓消退¹。它们在某些病理状况中也起着关键作用，例如长时间粘附在脉管系统的管腔壁上，至少是暂时的，这种现象被称为白细胞淤滞 ^2,3。

糖尿病视网膜病变是长期糖尿病最常见的并发症之一，也是美国和全球 20-75 岁人群视力障碍和失明的主要原因之一⁴。视网膜脉管系统的缓慢和进行性变性是疾病早期阶段具有临床意义的组成部分，在一些患者中导致视网膜缺血，从而导致视网膜新生血管形成 ^5,6。累积证据表明，炎症在视网膜病变⁷ 的发展中起着重要作用，白细胞淤滞被认为是一种亚临床血管内炎症反应。白血病发生在糖尿病的早期阶段，远早于任何可检测的临床表现发展 ^8,9,10。糖尿病中粘附的白细胞在数月至数年内反复堵塞视网膜血管（慢性白细胞淤滞）可能导致毛细血管的血管阻塞和变性 11,12,13。这种白细胞淤滞的严重程度具有病理意义，可用于监测疾病过程的严重程度或评估研究环境中的治疗效果。

为了进一步研究高血糖微环境对白细胞淤滞的具体影响，已经设计了体外模型。分离的视网膜微血管内皮细胞可以在 2 维或 3 维培养模型（微脉管芯片¹⁴）中生长和排列，以复制血管内皮（铺路血管腔的细胞单层）。然而，这些模型的实验间变化限制了它们的使用。体内人视网膜脉管系统白细胞淤滞的研究仍然有限，因此，目前关于视网膜白细胞淤滞的大部分知识都来自糖尿病视网膜病变的动物模型^13,15。

本报告的目的是描述一种基于其他地方描述的方法^{的标准方案 16}，用于量化附着在视网膜脉管系统上的白细胞作为白细胞淤滞的参数。该测定可用于研究其他也表现为白细胞淤滞的血管疾病，例如恶性肿瘤^{3、17、18、19} 和一些感染性和过敏性疾病²⁰。该协议可以在任何基础研究实验室中实施，而无需专用设备。在下面总结的方法中，最初用缓冲液灌注脉管系统以去除血液，然后将伴刀豆球蛋白 A 灌注到脉管系统中，在那里它与所有暴露的细胞壁结合并导致白细胞特别亮的染色 21,22,23。如果灌注成功去除所有未结合的血细胞，则可以使用手头的任何荧光显微镜手动定量与脉管系统结合的剩余荧光标记的白细胞。

研究方案

该方案已由加州大学尔湾分校机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 审查和批准，并符合政府关于实验室动物护理和使用的规定。该协议中没有停止点。每只鼠标的平均时间为 30 分钟。

1. 准备灌注阶段

1. 使用前，将 0.9% 盐水袋和伴刀豆球蛋白 A 溶液在 37 ^°C 水浴中加热 20-30 分钟。
   注意：保护伴刀豆球蛋白 A 免受光照（用铝箔覆盖）。
2. 设置一个托盘，以容纳血液和液体滴落在将要进行手术的表面上。在托盘顶部，放置一个加热垫，上面覆盖着吸水板底垫或任何吸收材料。
   注意：目标是避免小鼠的身体在手术过程中失去热量，因为冷却使灌注过程中更难去除血液。

2. 设置压力注入器

1. 串联 0.9% 盐水袋、静脉导管组、4 通阀旋塞阀和管饲针。
2. 将 0.9% 盐水袋插入压力注入器的网和气囊之间。将生理盐水袋挂在气囊背面的挂钩上。使用 I.V. 杆环将压力注入器悬挂在 I.V. 杆中。
3. 让系统打开（运行）几分钟，并将流速设置为 18-20 mL/min²⁴，以清除所有气泡的管路和端口。要给压力注入器气囊充气，转动旋塞阀手柄指向打开的旋塞阀通风口，然后泵送充气球，直到压力表指示所需的压力。在灌注每个鼠标之前重新调整压力。要放气，请将旋塞阀手柄笔直向下转动，朝向充气球。
   注意：如果 0.9% 盐水袋是新的，通常 150 mmHg 的压力可提供所需的流速;然而，由于压力注入器品牌和 0.9% 盐水袋的使用期间的变化，应根据经验调整压力。
4. 将装满温热伴刀豆球蛋白 A 溶液的 10 mL 注射器连接到 4 通阀上。
   注意：保护注射器免受光照（用铝箔覆盖）。

3. 麻醉

1. 通过腹膜内 （IP） 注射氯胺酮：甲苯噻嗪进行麻醉;小鼠手术/程序最广泛使用的剂量是 100：10 mg/kg 体重²⁵。通过踏板反射（用力捏住脚趾）评估麻醉。
   注意：该剂量提供 4-6 分钟的起效时间和 45-60 分钟的手术麻醉持续时间。麻醉剂混合物可在室温下储存最多 2 周。

4. 经心灌注和伴刀豆球蛋白 A 染色

1. 将鼠标仰卧位放在灌注台上，以允许暴露胸腔和腹腔。
2. 目视识别剑突，并使用惯用手的止血钳固定皮肤并锁定它。固定止血剂后，将其转移到非惯用手并提起皮肤。
3. 用惯用手用剪刀，与脊柱成 90° 角剪下一块皮肤，露出外腹壁。
4. 现在可以看到剑突和肋骨，通过双侧腹壁解剖，注意避免割伤任何器官或主要血管。
5. 现在可以看到横膈膜，通过横膈膜观察心室和肺。使用剪刀的尖端，切开靠近脊柱的其中一个侧面的横膈膜，注意避免割伤任何器官或主要血管。
   注意：隔膜上的这个“孔”将使胸腔内负压与大气压保持平衡，并且会发生气胸，使肺部塌陷并回缩心脏，从而促进隔膜的解剖而不会损坏肺或心脏。
6. 继续通过肋骨解剖并平行于肺部，以创建胸部“皮瓣”。释放止血剂并切开矢状面上的剑突。手动轻轻地打开剑突。观察心脏的四个腔室。
7. 用非惯用手并使用镊子抓住心尖附近的心脏。用惯用手握住管饲针（连接到 IV 导管）并刺穿心脏心尖。为避免左心室完全穿孔或到达肺血管系统，然后全身脉管系统灌注不良，请检查管饲针球尖末端的位置，该位置应位于穿刺部位的边缘，略微突出心脏。使用弯曲的蚊子镊子将管饲针夹在适当的位置，或者在作静脉注射旋塞阀时简单地用手握住它。
8. 将旋塞阀打开至 0.9% 盐水，几乎同时用剪刀切开右心室;灌注 2-3 分钟。在灌注期间，轻轻地将针头从一侧移动到另一侧和上下移动，以减少脉管系统的扭结并增加血液从心脏流出。
9. 用生理盐水灌注后，转动旋塞阀手柄以关闭生理盐水的流动，并允许液体从注射器流向管饲针。用伴刀豆球蛋白 A 溶液以稳态速率手动灌注。确保在 30-35 秒内分配 10 mL 伴刀豆球蛋白 A 溶液。
10. 用伴刀豆球蛋白 A 灌注后，转动阀门以关闭注射器的流出，并允许从 0.9% 生理盐水再次流向管饲针。用 0.9% 盐水溶液灌注 2-3 分钟。从心脏中取出管饲针。
    注意：本方案中建议的伴刀豆球蛋白 A 与荧光素（绿色）偶联;然而，连接到其他荧光染料的伴刀豆球蛋白 A 也是可用的。

5. 新鲜视网膜的摘除和分离

1. 将鼠标侧向转动，用非惯用手将食指和拇指分别放在上眼睑和下眼睑上。用手指轻轻缩回眼睑和皮肤，使眼睛部分凸出眼窝。
2. 当眼睛突出时，用惯用手使用弯曲的剪刀，并以 45° 角舀在眼睛下方。切断肌肉附件和视神经。使用与刮刀相同的剪刀，将眼睛转移到一个小容器或直接转移到解剖显微镜的载物台上。
   注意：在此步骤中，请注意不要切掉眼睛后部，并避免拉扯眼睛。
3. 将眼睛放在牙蜡上以打开地球仪。在解剖显微镜下，使用非惯用手，用微镊子握住巩膜皱襞或仍附着在后眼外部的肌肉残余物，并调整眼睛的方向，使角膜面向一侧。
   注意：为防止眼睛在打开眼球时移动/滑动，可以在牙蜡上放一块湿的无绒纸巾。
4. 用涂有特氟龙的剃须刀刀片的尖角之一，在角膜缘（角膜-巩膜交界处）向后 1-2 毫米处做一个切口。用微型镊子握住巩膜皱襞或肌肉，并以最小的向下力将刀片拉过角膜缘。继续用剃刀切割，将眼前段（角膜、虹膜、晶状体和玻璃体）与眼后节（眼罩）完全分离。
   注意：不要来回锯。
5. 将一分为二的眼罩转移到装有 PBS 的小培养皿中。
   注意：避免视网膜与薄纸接触（注意步骤 5.3），因为它会紧紧地粘在纸上，基本上不可能恢复。
6. 用微型镊子抓住巩膜皱襞或巩膜外侧的剩余肌肉。通过使用微型刮刀打破眼罩周边角膜缘的所有连接，将视网膜与巩膜完全分离。用微刮刀从锁膜中舀出视网膜。如果视网膜仍然通过视神经附着在巩膜上，请将微剪刀滑到视网膜和巩膜之间以切断视神经。
7. 去除视网膜周边玻璃体和睫状肌的任何残留物。立即将分离的视网膜转移到含有一些 PBS 的载玻片上。
   注意：根据研究人员的偏好，可以使用任何其他视网膜隔离技术。

6. 视网膜的平面安装

1. 将未固定的视网膜铺在载玻片上，加入少量 PBS。使用微型刮刀，轻轻地确定视网膜的方向，使玻璃体面朝上。如果视网膜向内折叠，请使用微型镊子固定视网膜的边缘，同时使用微型刮刀展开视网膜。
2. 在视网膜上做 4-5 个径向切口，使其平躺（三叶草图案）。
3. 使用无绒纸巾，将多余的 PBS 从视网膜上擦干。
   注意：不要用组织接触视网膜;否则，样本将丢失。盖玻片是可取的，以保持视网膜平坦。

7. 显微镜

注：任何具有 GFP/FITC （480/530 nm） 通道的荧光显微镜都可用于此步骤。在这项工作中，我们使用了具有 488 通道的参考显微镜和相关软件进行图像采集。

1. 在显微镜下以 100 倍放大倍率（10 倍物镜）观察最近平装的视网膜，并通过系统地扫描整个组织（从右到左或从上到下）来计数荧光标记的白细胞（手动）。
   注：白细胞是单个荧光点，可显示圆形或椭圆形。它们的直径为 12-15 μm，不会从视网膜毛细血管中突出（该结构完全受血管腔的限制）。
2. 以所需的放大倍率获取代表性图像，并使用所选软件（例如 ImageJ [斐济]）对图像进行后处理。
3. 将计数表示为每个视网膜的白细胞数。按平均值±标准差绘制数据。

结果

执行良好的灌注和染色方案将显示用伴刀豆球蛋白 A 描绘的完整视网膜脉管系统（图 1）。小鼠灌注不良会阻止标记整个血管树和随后分析粘附在管腔上的白细胞（图 2），而快速挤压注射器（小于 30-35 秒）产生的过大压力会导致血管通透性和血管破裂（图 3）。外渗的伴刀豆球蛋白 A 可导致外部结构标?...

讨论

人类白细胞淤积是指与白细胞增多症（总白细胞 （WBC） 计数 >100,000/μL））相关的症状和临床表现，是一种医疗紧急情况²⁰。导致白细胞淤滞的机制正在深入研究中。迄今为止，尚不可能 在体内 研究人类白细胞淤滞，研究人员需要依靠动物模型来了解这一过程。不同的疾病表现为白细胞淤滞，并且有一个详细的方案来在 体外 可视化这种现...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringe
4-way stopcock Luer lock I.V. line valve	Baxter	2C6204
Concanavalin A solution	Vector	FL-1001	Prepare in PBS 1 mg/mL
Dissecting tools set			Includes hemostats, scissors and forceps
FIJI			Software for image processing
Fluorescence microscope	Nikon	Eclipse Ni
Forceps, Dumont #5, Biological grade tip	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72700-D
Gavage Needle 1.25 mm OD barrel tip x 30 mm	Fine Science	18060-20
Halstead Mosquito Forceps	Fisher Scientific	13-812-10
I.V. Catheter set with regulating clamp 70 inches	Baxter	2C5417s
I.V. Pole
Lint free tissue			Kimpwipes is an option
Micro dissecting spring scissors, Vannas, 3 mm straight	ROBOZ	RS-5620
Micro spatula	Fine Science Tools (FST)	10091-12
Nikon		NIS-Elements (AR 5.30.03 64-bit)	Software for image acquisition
Petri dish (100 mmx15 mm)	Corning	351029
Phosphate buffered saline (PBS)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72670
Pressure infuser	Infusurge	4010
Razor blades, GEM single edge stainless steel, Teflon coated	Electron Microscopy Sciences (EMS)	71970
Saline 0.9%, veterinary grade, 1000 mL	Baxter	04925-04-10
Small dissecting scissors, curved blunt end 22 mm	ROBOZ	RS 5983