Quantificação de leucócitos aderentes induzidos por diabetes na vasculatura retiniana

Resumo

Demonstramos um método para marcar as paredes da vasculatura retiniana e leucócitos aderentes. Esses leucócitos aderentes podem então ser contados em um microscópio de fluorescência como um parâmetro de inflamação ou a resposta dessa inflamação às terapias.

Resumo

A leucostase refere-se à fixação de leucócitos à parede luminal da vasculatura. Essa interação dos leucócitos com a parede dos vasos sanguíneos é característica da inflamação e tem sido causalmente ligada à oclusão capilar em uma variedade de tecidos e doenças, incluindo a retinopatia diabética.

A leucostase tem sido relatada há anos como uma complicação da hiperleucocitose com risco de vida e só pode ser diagnosticada clinicamente. Dada a importância do fenômeno, pesquisas intensivas foram feitas para entender o(s) mecanismo(s) potencial(is) que levam à sua manifestação; no entanto, não existe uma técnica padrão-ouro em ambientes laboratoriais para visualizar e quantificar a gravidade do evento.

No método resumido abaixo, a vasculatura é inicialmente perfundida com um tampão para remover o sangue e, em seguida, a concanavalina A é perfundida na vasculatura, onde se liga a todas as paredes celulares expostas e causa coloração especialmente brilhante dos leucócitos. Se a perfusão para remover todas as células sanguíneas não ligadas for bem-sucedida, os leucócitos marcados com fluorescência restantes são ligados à vasculatura e podem ser quantificados manualmente usando qualquer microscópio de fluorescência disponível.

Introdução

Os leucócitos (glóbulos brancos, leucócitos) desempenham um papel importante na função ideal da vasculatura, como manutenção da fluidez sanguínea e regulação da resolução do trombo¹. Eles também desempenham um papel fundamental em algumas condições patológicas, como a adesão à parede luminal da vasculatura por períodos prolongados de tempo, levando à obstrução do vaso, pelo menos temporariamente, fenômeno conhecido como leucostase ^2,3.

A retinopatia diabética é uma das complicações mais comuns do diabetes de longo prazo e uma das principais causas de deficiência visual e cegueira nos EUA e no mundo para indivíduos de 20 a 75 anos de idade⁴. A degeneração lenta e progressiva da vasculatura retiniana é um componente clinicamente significativo dos estágios iniciais da doença, que em alguns pacientes leva à isquemia retiniana com a neovascularização retiniana resultante ^5,6. Evidências cumulativas indicam que a inflamação desempenha um papel importante no desenvolvimento da retinopatia⁷, e a leucostase é considerada uma resposta inflamatória intravascular subclínica. A leucostase ocorre nos estágios iniciais do diabetes, bem antes de qualquer manifestação clínica detectável ter se desenvolvido ^8,9,10. O tamponamento repetido dos vasos retinianos por leucócitos aderentes ao longo de meses a anos (leucostase crônica) no diabetes pode contribuir para a oclusão vascular e degeneração dos capilares 11,12,13. A gravidade dessa leucostase é de significado patológico e pode ser usada para monitorar a gravidade do processo da doença ou para avaliar a eficácia de uma terapia em ambientes de pesquisa.

Para estudar mais os efeitos específicos do microambiente hiperglicêmico na leucostase, modelos in vitro foram projetados. Células endoteliais microvasculares retinianas isoladas podem ser cultivadas e organizadas em modelos de culturas 2 ou 3-D (microvasculatura em um chip¹⁴) para replicar o endotélio vascular (a monocamada celular que pavimenta o lúmen dos vasos). No entanto, a variação interexperimental desses modelos limita seu uso. O estudo da leucostase na vasculatura retiniana humana in vivo ainda é limitado e, portanto, a maior parte do conhecimento atual sobre a leucostase retiniana é derivada de modelos animais de retinopatia diabética^13,15.

O objetivo deste relato é descrever um protocolo padrão baseado em métodos descritos em outro artigo¹⁶ para a quantificação de leucócitos aderidos à vasculatura retiniana como parâmetro de leucostase. Este ensaio pode ser usado para estudar outras doenças vasculares que também apresentam leucostase, como malignidades 3,17,18,19 e algumas condições infecciosas e alérgicas 20. Este protocolo pode ser implementado em qualquer laboratório de pesquisa básica sem a necessidade de equipamentos especializados. No método resumido abaixo, a vasculatura é inicialmente perfundida com tampão para remover o sangue e, em seguida, a concanavalina A é perfundida na vasculatura, onde se liga a todas as paredes celulares expostas e causa coloração especialmente brilhante dos leucócitos^{21 , 22 , 23} . Se a perfusão para remover todas as células sanguíneas não ligadas for bem-sucedida, os leucócitos marcados com fluorescência restantes que estão ligados à vasculatura podem ser quantificados manualmente usando qualquer microscópio de fluorescência disponível.

Protocolo

O protocolo foi revisado e aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Califórnia em Irvine e está em conformidade com os regulamentos governamentais relativos ao cuidado e uso de animais de laboratório. Não há pontos de parada neste protocolo. O tempo médio por mouse é de 30 min.

1. Preparando o estágio de perfusão

1. Aqueça a bolsa salina a 0,9% e a solução de concanavalina A em banho-maria a 37 ^oC por 20-30 min antes de usar.
   NOTA: Proteja a concanavalina A da exposição à luz (cubra com papel alumínio).
2. Configure uma bandeja para conter sangue e líquidos pingando na superfície onde o procedimento será realizado. Em cima da bandeja, coloque uma almofada de aquecimento coberta com uma almofada de bancada absorvente ou qualquer material absorvente.
   NOTA: O objetivo é evitar que o corpo do camundongo perca calor durante o procedimento, pois o resfriamento dificulta a remoção do sangue durante a perfusão.

2. Configurando o infusor de pressão

1. Conecte em série a bolsa de solução salina a 0,9%, o conjunto de cateteres intravenosos, uma torneira de válvula de 4 vias e a agulha de gavagem.
2. Insira a bolsa salina a 0,9% entre a rede e a bexiga de ar do infusor de pressão. Pendure a bolsa salina no gancho localizado na parte de trás da câmara de ar. Use o loop do poste IV para pendurar o infusor de pressão no poste IV.
3. Purgue as linhas e portas de todas as bolhas de ar, deixando o sistema aberto (funcionando) por alguns minutos e defina a taxa de fluxo para 18-20 mL / min²⁴. Para inflar a bexiga de ar do infusor de pressão, gire a alavanca da torneira para apontar para a ventilação aberta da torneira e, em seguida, bombeie o bulbo de inflação até que o manômetro indique a pressão desejada. Reajuste a pressão antes de perfundir cada mouse. Para esvaziar, gire a alavanca da torneira diretamente para baixo em direção ao bulbo de inflação.
   NOTA: Se a bolsa salina a 0.9% for nova, geralmente a pressão de 150 mmHg fornece a vazão desejada; no entanto, a pressão deve ser ajustada empiricamente devido às variações nas marcas dos infusores de pressão e durante o período de uso da bolsa salina a 0,9%.
4. Conecte uma seringa de 10 mL cheia de solução de concanavalina A aquecida à válvula de 4 vias.
   NOTA: Proteja a seringa da exposição à luz (cubra com papel alumínio).

3. Anestesia

1. Administrar anestesia por injeção intraperitoneal (IP) de cetamina: xilazina; A dose mais amplamente utilizada para cirurgia/procedimento em camundongos é de 100:10 mg/kg de peso corporal²⁵. Avalie a anestesia por reflexo pedal (pinça firme do dedo do pé).
   NOTA: Esta dose fornece um início de 4-6 min com uma duração de 45-60 min de anestesia cirúrgica. O coquetel anestésico pode ser armazenado em temperatura ambiente por no máximo 2 semanas.

4. Perfusão transcárdica e coloração com concanavalina A

1. Coloque o camundongo no estágio de perfusão em decúbito dorsal para permitir a exposição da cavidade torácica e abdominal.
2. Identifique visualmente o processo xifóide e, com o hemostático na mão dominante, prenda a pele e trave-a. Assim que o hemostático estiver seguro, transfira-o para a mão não dominante e levante a pele.
3. Use uma tesoura na mão dominante e corte, em um ângulo de 90° em relação à coluna, um pedaço de pele para revelar a parede abdominal externa.
4. Com o processo xifóide e a caixa torácica agora visíveis, disseque através da parede abdominal bilateralmente, tomando cuidado para evitar cortar quaisquer órgãos ou vasos importantes.
5. Com o diafragma agora visível, visualize os ventrículos cardíacos e os pulmões através do diafragma. Usando a ponta da tesoura, corte o diafragma em um dos flancos, próximo à coluna, tomando cuidado para não cortar órgãos ou vasos importantes.
   NOTA: Este "orifício" no diafragma equilibrará a pressão intratorácica negativa com a pressão atmosférica, e ocorrerá um pneumotórax colapsando os pulmões e retraindo o coração, facilitando a dissecção do diafragma sem danificar os pulmões ou o coração.
6. Continue dissecando através das costelas e paralelamente aos pulmões para criar um "flap" no peito. Libere o hemostático e corte o processo xifóide no plano sagital. Abra suavemente o processo xifóide manualmente. Observe as quatro câmaras do coração.
7. Com a mão não dominante e usando uma pinça, segure o coração perto de seu ápice. Com a mão dominante, segure a agulha de gavagem (presa ao cateter intravenoso) e perfure o ápice do coração. Para evitar a perfuração total do ventrículo esquerdo ou atingir a vasculatura pulmonar e, em seguida, má perfusão da vasculatura sistêmica, verifique a colocação da extremidade da ponta esférica da agulha de gavagem, que deve estar na borda do local da punção ligeiramente saliente do coração. Prenda a agulha de gavagem no lugar usando uma pinça de mosquito curva ou simplesmente segure-a com a mão enquanto manipula a torneira intravenosa.
8. Abra a torneira para o soro fisiológico a 0,9% e, quase simultaneamente, abra o ventrículo direito com uma tesoura; perfundir por 2-3 min. Durante o tempo de perfusão, mova suavemente a agulha de um lado para o outro e para cima e para baixo para reduzir a torção da vasculatura e aumentar a saída de sangue do coração.
9. Depois de perfundir com solução salina, gire a alça da torneira para interromper o fluxo da solução salina e permitir o fluxo da seringa para a agulha de gavagem. Perfundir manualmente com a solução de concanavalina A a uma taxa de estado estacionário. Certifique-se de que os 10 mL de solução de concanavalina A sejam dispensados em 30-35 s.
10. Após a perfusão com concanavalina A, gire a válvula para interromper o fluxo da seringa e permita o fluxo do soro fisiológico a 0,9% para a agulha de gavagem novamente. Perfunda com a solução salina a 0,9% por mais 2-3 min. Remova a agulha de gavagem do coração.
    NOTA: A concanavalina A sugerida neste protocolo é conjugada à fluoresceína (verde); no entanto, a concanavalina A ligada a outros fluorocromos também está disponível.

5. Enucleação e isolamento da retina fresca

1. Vire o mouse de lado e, usando a mão não dominante, coloque o dedo indicador e o polegar nas pálpebras superior e inferior, respectivamente. Retraia suavemente as pálpebras e a pele com os dedos e proptose o olho, fazendo-o ficar parcialmente saliente para fora da órbita.
2. Enquanto o olho é proposto, use uma tesoura curva na mão dominante e coloque sob o olho em um ângulo de 45°. Corte a fixação muscular e o nervo óptico. Usando a mesma tesoura de uma espátula, transfira o olho para um pequeno recipiente ou diretamente para o estágio do microscópio de dissecação.
   NOTA: Tenha cuidado para não cortar a parte de trás do olho e evite puxar o olho durante esta etapa.
3. Coloque o olho em uma cera dental para abrir o globo. Sob o microscópio de dissecação e usando a mão não dominante, segure a prega escleral ou os restos musculares ainda presos externamente ao olho posterior com uma micropinça e oriente o olho de forma que a córnea fique voltada para o lado.
   NOTA: Para evitar que o olho se mova/deslize ao abrir o globo, um pedaço de tecido úmido sem fiapos pode ser colocado em cima da cera dental.
4. Com um dos cantos afiados de uma lâmina de barbear revestida de Teflon, faça uma incisão 1-2 mm atrás e paralela ao limbo (junção córnea-esclera). Segure a dobra escleral ou músculo com a micropinça e puxe a lâmina pelo limbo com o mínimo de força para baixo. Continue a cortar com a navalha para separar totalmente o segmento anterior (córnea, íris, cristalino e vítreo) do segmento posterior (ocular).
   NOTA: Não serre para frente e para trás.
5. Transfira a ocular dividida para uma pequena placa de Petri com PBS.
   NOTA: Evite o contato da retina com o lenço de papel (observe na etapa 5.3), pois ele grudará firmemente no papel e se tornará essencialmente impossível de recuperar.
6. Pegue uma dobra escleral ou o músculo restante do lado de fora da esclera com uma micropinça. Separe completamente a retina da esclera, quebrando todas as conexões no limbo ao redor do perímetro da ocular usando uma microespátula. Retire a retina da esclera com a microespátula. Se a retina ainda estiver presa à esclera pelo nervo óptico, deslize a microtesoura entre a retina e a esclera para cortar o nervo óptico.
7. Remova quaisquer remanescentes de músculo vítreo e ciliar na periferia da retina. Transfira imediatamente a retina isolada para uma lâmina com um pouco de PBS.
   NOTA: Qualquer outra técnica de isolamento de retina pode ser usada dependendo da preferência do pesquisador.

6. Montagem plana da retina

1. Disponha a retina não fixada em uma lâmina com uma pequena quantidade de PBS. Usando a microespátula, oriente suavemente a retina com o lado vítreo para cima. Se a retina estiver dobrada para dentro, use microfórceps para segurar as bordas da retina enquanto a retina é desdobrada usando a microespátula.
2. Faça 4-5 cortes radiais na retina para que ela fique plana (padrão de trevo).
3. Usando um tecido sem fiapos, seque o excesso de PBS da retina.
   NOTA: Não toque a retina com o tecido; caso contrário, a amostra será perdida. A lamínula é desejável para manter a retina plana.

7. Microscopia

NOTA: Qualquer microscópio de fluorescência com um canal GFP/FITC (480/530 nm) pode ser usado para esta etapa. Para este trabalho, utilizamos o microscópio referenciado com 488 canais e software associado para aquisição de imagens.

1. Observe a retina recentemente plana sob o microscópio com ampliação de 100x (objetiva de 10x) e conte os leucócitos marcados com fluorescência (manualmente) escaneando metodicamente todo o tecido (da direita para a esquerda ou de cima para baixo).
   NOTA: Os leucócitos são pontos fluorescentes únicos que podem exibir uma forma redonda ou oval. Eles têm 12-15 μm de diâmetro e não se projetam dos capilares retinianos (a estrutura é completamente restringida pelo lúmen do vaso).
2. Adquira imagens representativas com a ampliação desejada e execute o pós-processamento das imagens com o software de sua escolha (por exemplo, ImageJ [Fiji]).
3. Expresse a contagem como leucócitos por retina. Represente graficamente os dados por média ± desvio padrão.

Resultados

Um protocolo de perfusão e coloração bem executado mostrará a vasculatura retiniana completa delineada com concanavalina A (Figura 1). A má perfusão do camundongo impede a marcação de toda a árvore vascular e a subsequente análise dos leucócitos aderentes ao lúmen (Figura 2), enquanto a pressão excessiva de um aperto rápido de uma seringa (menos de 30-35 s) pode causar permeabilidade vascular e ruptura dos vasos sa...

Discussão

A leucostase em humanos refere-se aos sintomas e achados clínicos associados à hiperleucocitose (contagem de leucócitos totais (leucócitos) >100.000/μL) e é uma emergência médica²⁰. O(s) mecanismo(s) que conduz(em) à leucostase estão a ser objeto de investigação intensiva. Até o momento, o estudo da leucostase em humanos in vivo ainda não é possível e os pesquisadores precisam se basear em modelos animais para entender esse processo. Difer...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringe
4-way stopcock Luer lock I.V. line valve	Baxter	2C6204
Concanavalin A solution	Vector	FL-1001	Prepare in PBS 1 mg/mL
Dissecting tools set			Includes hemostats, scissors and forceps
FIJI			Software for image processing
Fluorescence microscope	Nikon	Eclipse Ni
Forceps, Dumont #5, Biological grade tip	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72700-D
Gavage Needle 1.25 mm OD barrel tip x 30 mm	Fine Science	18060-20
Halstead Mosquito Forceps	Fisher Scientific	13-812-10
I.V. Catheter set with regulating clamp 70 inches	Baxter	2C5417s
I.V. Pole
Lint free tissue			Kimpwipes is an option
Micro dissecting spring scissors, Vannas, 3 mm straight	ROBOZ	RS-5620
Micro spatula	Fine Science Tools (FST)	10091-12
Nikon		NIS-Elements (AR 5.30.03 64-bit)	Software for image acquisition
Petri dish (100 mmx15 mm)	Corning	351029
Phosphate buffered saline (PBS)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72670
Pressure infuser	Infusurge	4010
Razor blades, GEM single edge stainless steel, Teflon coated	Electron Microscopy Sciences (EMS)	71970
Saline 0.9%, veterinary grade, 1000 mL	Baxter	04925-04-10
Small dissecting scissors, curved blunt end 22 mm	ROBOZ	RS 5983