Количественная оценка индуцированных сахарным диабетом адгезивных лейкоцитов в сосудистой сети сетчатки

Резюме

Мы демонстрируем метод маркировки стенок сосудистой сети сетчатки и адгезивных лейкоцитов. Эти адгезивные лейкоциты затем могут быть подсчитаны под флуоресцентным микроскопом как параметр воспаления или реакции этого воспаления на терапию.

Аннотация

Лейкостаз относится к прикреплению лейкоцитов к просветной стенке сосудистой системы. Это взаимодействие лейкоцитов со стенкой кровеносных сосудов характерно для воспаления и причинно связано с окклюзией капилляров в различных тканях и заболеваниях, включая диабетическую ретинопатию.

Лейкостаз в течение многих лет сообщалось как опасное для жизни осложнение гиперлейкоцитоза и может быть диагностирован только клинически. Учитывая важность этого явления, были проведены интенсивные исследования, чтобы понять потенциальный механизм (механизмы), которые приводят к его проявлению; Тем не менее, в лабораторных условиях не существует золотого стандарта для визуализации и количественной оценки серьезности события.

В методе, кратко изложенном ниже, сосудистая сеть сначала перфузируется буфером для удаления крови, а затем конканавалин А перфузируется в сосудистую сеть, где он связывается со всеми открытыми клеточными стенками и вызывает особенно яркое окрашивание лейкоцитов. Если перфузия для удаления всех несвязанных клеток крови прошла успешно, оставшиеся флуоресцентно меченые лейкоциты связываются с сосудистой сетью, и их можно вручную количественно определить с помощью любого доступного флуоресцентного микроскопа.

Введение

Лейкоциты (лейкоциты, лейкоциты) играют важную роль в оптимальном функционировании сосудистой сети, таком как поддержание текучести крови и регуляция разрешения тромбов¹. Они также играют ключевую роль при некоторых патологических состояниях, таких как прилипание к просветной стенке сосудистой сети в течение длительных периодов времени, приводящее к обструкции сосудов, по крайней мере, временно, явление, известное как лейкостаз ^2,3.

Диабетическая ретинопатия является одним из наиболее распространенных осложнений долгосрочного диабета и одной из ведущих причин нарушения зрения и слепоты в США и во всем мире у лиц^{в возрасте} 20-75 лет. Медленная и прогрессирующая дегенерация сосудистой сети сетчатки является клинически значимым компонентом ранних стадий заболевания, что у некоторых пациентов приводит к ишемии сетчатки с последующей неоваскуляризацией сетчатки ^5,6. Совокупные данные указывают на то, что воспаление играет важную роль в развитии ретинопатии⁷, а лейкостаз считается субклинической внутрисосудистой воспалительной реакцией. Лейкостаз возникает на ранних стадиях сахарного диабета, задолго до того, как развились какие-либо обнаруживаемые клинические проявления ^8,9,10. Повторное закупоривание сосудов сетчатки адгезивными лейкоцитами в течение нескольких месяцев или лет (хронический лейкостаз) при сахарном диабете может способствовать окклюзии сосудов и дегенерации капилляров 11,12,13. Тяжесть этого лейкостаза имеет патологическое значение и может быть использована для мониторинга тяжести патологического процесса или для оценки эффективности терапии в исследовательских условиях.

Для дальнейшего изучения специфического влияния гипергликемического микроокружения на лейкостаз были разработаны модели in vitro. Изолированные микрососудистые эндотелиальные клетки сетчатки могут быть выращены и расположены в двух- или трехмерных моделях культур (микроциркуляторное русло на чипе¹⁴) для репликации сосудистого эндотелия (монослоя клеток, который прокладывает просвет сосудов). Однако межэкспериментальная вариация этих моделей ограничивает их использование. Изучение лейкостаза в сосудистой сети сетчатки человека in vivo все еще ограничено, и поэтому большая часть современных знаний о лейкостазе сетчатки получена из животных моделей диабетической ретинопатии^13,15.

Целью данного отчета является описание стандартного протокола, основанного на методах, описанных в другом месте¹⁶, для количественного определения присоединенных лейкоцитов к сосудистой сети сетчатки в качестве параметра лейкостаза. Этот анализ может быть использован для изучения других сосудистых заболеваний, которые также проявляются лейкостазом, таких как злокачественные новообразования 3,17,18,19 и некоторые инфекционные и аллергические состояния ²⁰. Этот протокол может быть реализован в любой базовой исследовательской лаборатории без необходимости использования специализированного оборудования. В методе, кратко описанном ниже, сосудистая сеть сначала перфузируется буфером для удаления крови, а затем конканавалин А перфузируется в сосудистую сеть, где он связывается со всеми открытыми клеточными стенками и вызывает особенно яркое окрашивание лейкоцитов 21,22,23. Если перфузия для удаления всех несвязанных клеток крови прошла успешно, оставшиеся флуоресцентно меченые лейкоциты, которые связаны с сосудистой сетью, могут быть вручную количественно определены с помощью любого флуоресцентного микроскопа, имеющегося под рукой.

протокол

Протокол был рассмотрен и одобрен Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Калифорнийского университета в Ирвайне и соответствует правительственным постановлениям, касающимся ухода за лабораторными животными и их использования. В этом протоколе нет точек остановки. Среднее время работы на одной мыши составляет 30 минут.

1. Подготовка к стадии перфузии

1. Перед использованием прогрейте 0,9% солевой мешочек и раствор конканавалина А на водяной бане при температуре 37 ^°C в течение 20-30 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Беречь конканавалин А от воздействия света (накрыть пленкой).
2. Установите лоток так, чтобы кровь и жидкости капали на поверхность, где будет проходить процедура. Сверху на поднос положите грелку, накрытую впитывающей скамейкой, пеленкой или любым абсорбирующим материалом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы избежать потери тепла телом мыши во время процедуры, потому что охлаждение затрудняет удаление крови во время перфузии.

2. Настройка напорного заварочного устройства

1. Соедините последовательно мешок с 0,9% физиологическим раствором, набор внутривенных катетеров, 4-ходовой клапанный запорный кран и иглу для зондажа.
2. Вставьте мешок с 0,9% солевым раствором между сеткой и воздушным пузырем напорного заварочного устройства. Повесьте мешочек с солевым раствором на крючок, расположенный на задней стенке воздушного пузыря. Используйте петлю для внутривенного полюса, чтобы повесить напорный насос на внутривенный полюс.
3. Очистите трубопроводы и порты от всех пузырьков воздуха, дав системе открыться (поработать) в течение пары минут и установите расход 18-20 мл/мин²⁴. Чтобы накачать воздушный пузырь нагнетателя давления, поверните ручку запорного крана так, чтобы она была направлена в сторону открытого вентиляционного отверстия запорного крана, затем накачивайте колбу до тех пор, пока манометр не покажет желаемое давление. Повторно отрегулируйте давление перед перфузией каждой мыши. Чтобы сдуть, поверните ручку запорного крана прямо вниз по направлению к лампе надувания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если мешок с 0,9% солевым раствором новый, обычно давление 150 мм рт.ст. обеспечивает желаемый расход; Тем не менее, давление следует корректировать опытным путем из-за различий в марках заварочных устройств под давлением и в течение периода использования мешка с 0,9% солевым раствором.
4. Подсоедините шприц объемом 10 мл, наполненный подогретым раствором конканавалина А, к 4-ходовому клапану.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Защищайте шприц от воздействия света (накройте пленкой).

3. Анестезия

1. Введение анестезии путем внутрибрюшинного (в/в) введения кетамина:ксилазина; Наиболее широко используемая доза для хирургии/процедуры на мышах составляет 100:10 мг/кг массы тела²⁵. Оценивайте анестезию по педальному рефлексу (твердое защемление пальцев ног).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта доза обеспечивает начало хирургической анестезии в течение 4-6 минут при длительности хирургической анестезии 45-60 минут. Обезболивающий коктейль можно хранить при комнатной температуре не более 2 недель.

4. Транскардиальная перфузия и окрашивание конканавалином А

1. Поместите мышь на перфузионную ступень в положении лежа на спине, чтобы обеспечить обнажение грудной и брюшной полости.
2. Визуально определите мечевидный отросток, и с помощью кровоостанавливателя в доминирующей руке приколите кожу и зафиксируйте ее. Как только гемостат будет закреплен, перенесите его на недоминантную руку и подтяните кожу.
3. Используйте ножницы в доминирующей руке и разрежьте под углом 90° к позвоночнику участок кожи, чтобы открыть внешнюю брюшную стенку.
4. Теперь, когда виден мечевидный отросток и грудная клетка, рассекайте брюшную стенку с обеих сторон, стараясь не обрезать какие-либо органы или крупные сосуды.
5. Теперь, когда диафрагма видна, визуализируйте сердце, желудочки и легкие через диафрагму. С помощью кончика ножниц прорежьте диафрагму на одном из флангов, ближе к позвоночнику, стараясь не повредить какие-либо органы или крупные сосуды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это «отверстие» в диафрагме уравновешивает отрицательное внутригрудное давление с атмосферным давлением, и возникает пневмоторакс, который коллапсирует легкие и втягивает сердце, облегчая рассечение диафрагмы без повреждения легких или сердца.
6. Продолжайте рассекание через ребра и параллельно легким для создания грудного «лоскута». Освободите кровоостанавливатель и разрежьте мечевидный отросток в сагиттальной плоскости. Аккуратно широко раскройте мечевидный отросток вручную. Наблюдайте за четырьмя камерами сердца.
7. Недоминантной рукой и с помощью щипцов обхватите сердце возле его верхушки. Доминирующей рукой возьмитесь за иглу зондажа (прикрепленную к внутривенному катетеру) и проколите верхушку сердца. Чтобы избежать полной перфорации левого желудочка или достижения легочной сосудистой сети и последующей плохой перфузии системной сосудистой сети, проверьте расположение конца шарикового наконечника газональной иглы, который должен находиться на краю места прокола, слегка выступающего из сердца. Зажмите иглу зондажа на месте с помощью изогнутых москитных щипцов или просто держите ее рукой, манипулируя запорным краном внутривенного введения.
8. Откройте запорный кран до 0,9% физиологического раствора и почти одновременно разрежьте правый желудочек ножницами; перфузировать в течение 2-3 мин. Во время перфузии осторожно перемещайте иглу из стороны в сторону и вверх и вниз, чтобы уменьшить перегиб сосудистой сети и увеличить выход крови из сердца.
9. После перфузии физиологическим раствором поверните ручку запорного крана, чтобы перекрыть поток из физиологического раствора и позволить потоку от шприца к игле для зондажа. Выполняйте перфузию вручную с помощью раствора конканавалина А с постоянной скоростью. Убедитесь, что 10 мл раствора конканавалина А дозированы в течение 30-35 с.
10. После перфузии конканавалином А поверните клапан, чтобы перекрыть поток из шприца и снова пропустить поток от 0,9% физиологического раствора к игле для зондажа. Перфузируйте 0,9% физиологическим раствором еще 2-3 мин. Извлеките иглу зонда из сердца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конканавалин А, предложенный в данном протоколе, конъюгирован с флуоресцеином (зеленым); однако также доступен конканавалин А, присоединенный к другим флуорохромам.

5. Энуклеация и выделение свежей сетчатки

1. Поверните мышь на бок и, используя недоминантную руку, поместите указательный и большой пальцы на верхнее и нижнее веко соответственно. Аккуратно втяните веки и кожу пальцами и проптозайте глаз, делая его частично выпуклым из глазницы.
2. Пока глаз находится в вертикальном положении, используйте изогнутые ножницы в доминирующей руке и зачерпните под глазом под углом 45°. Разрежьте мышечное крепление и зрительный нерв. Используя те же ножницы в качестве шпателя, перенесите глаз в небольшую емкость или непосредственно на столик препарирующего микроскопа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не отрезать заднюю часть глаза и не тяните глаз во время этого шага.
3. Поместите глаз на зубной воск, чтобы открыть глобус. Под рассекающим микроскопом и с помощью недоминантной руки держите склеральную складку или остатки мышц, все еще прикрепленные снаружи к заднему глазу, с помощью микрощипцов и ориентируйте глаз так, чтобы роговица была обращена в сторону.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить смещение глаза при открытии глазного яблока, поверх зубного воска можно положить кусок влажной безворсовой ткани.
4. Одним из острых углов бритвенного лезвия с тефлоновым покрытием сделайте надрез на 1-2 мм позади и параллельно лимбу (соединение роговицы и склеры). Удерживайте склеральную складку или мышцу с помощью микрощипцов и проведите лезвием по лимбу с минимальным усилием вниз. Продолжайте резать бритвой, чтобы полностью отделить передний сегмент (роговицу, радужную оболочку, хрусталик и стекловидное тело) от заднего сегмента (наглазника).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не пилите вперед и назад.
5. Перенесите разрезанный пополам наглазник в маленькую чашку Петри с PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте контакта сетчатки с папиросной бумагой (примечание в шаге 5.3), так как она плотно прилипнет к бумаге и ее практически невозможно восстановить.
6. Захватите склеральную складку или оставшуюся мышцу на внешней стороне склеры с помощью микрощипцов. Полностью отделите сетчатку от склеры, разорвав все соединения в лимбе по периметру наглазника с помощью микрошпателя. Вычерпните сетчатку из склеры с помощью микрошпателя. Если сетчатка все еще прикреплена к склере зрительным нервом, вставьте микроножницы между сетчаткой и склерой, чтобы перерезать зрительный нерв.
7. Удалите остатки стекловидного тела и цилиарной мышцы на периферии сетчатки. Немедленно перенесите изолированную сетчатку на предметное стекло с помощью PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от предпочтений исследователя может быть использован любой другой метод изоляции сетчатки.

6. Плоское крепление сетчатки

1. Разложите незафиксированную сетчатку на предметном стекле с небольшим количеством PBS. С помощью микрошпателя аккуратно ориентируйте сетчатку стекловидным телом вверх. Если сетчатка загнута внутрь, используйте микрощипцы, чтобы удерживать края сетчатки, пока сетчатка разворачивается с помощью микрошпателя.
2. Сделайте 4-5 радиальных надрезов в сетчатке так, чтобы она лежала ровно (узор клеверного листа).
3. Используя безворсовую ткань, высушите избыток PBS вдали от сетчатки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к сетчатке тканями; В противном случае проба будет утеряна. Покровное скольжение желательно для того, чтобы сетчатка оставалась плоской.

7. Микроскопия

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого шага можно использовать любой флуоресцентный микроскоп с каналом GFP/FITC (480/530 нм). Для этой работы мы использовали референсный микроскоп с 488 каналами и соответствующее программное обеспечение для получения изображений.

1. Наблюдайте за недавно установленной плоской сетчаткой под микроскопом при 100-кратном увеличении (10-кратном объективе) и подсчитывайте флуоресцентно меченые лейкоциты (вручную), методично сканируя всю ткань (справа налево или сверху вниз).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Лейкоциты представляют собой одиночные флуоресцентные точки, которые могут иметь круглую или овальную форму. Они имеют диаметр 12-15 мкм и не выступают из капилляров сетчатки (структура полностью ограничена просветом сосуда).
2. Получите репрезентативные изображения с желаемым увеличением и выполните постобработку изображений с помощью выбранного программного обеспечения (например, ImageJ [Fiji]).
3. Выразите количество лейкоцитов на сетчатку. Построите график данных по среднему значению ± стандартному отклонению.

Результаты

Хорошо выполненный протокол перфузии и окрашивания покажет полную сосудистую сеть сетчатки, очерченную конканавалином А (Рисунок 1). Плохая перфузия мыши препятствует мечению всего сосудистого дерева и последующему анализу лейкоцитов, адгезивных к п...

Обсуждение

Лейкостаз у людей относится к симптомам и клиническим признакам, связанным с гиперлейкоцитозом (общее количество лейкоцитов (WBCs) >100 000/мкл) и является неотложной медицинской^{помощью20}. Механизм(ы), приводящие к лейкостазу, интенсивно исследуются. На сегодня...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringe
4-way stopcock Luer lock I.V. line valve	Baxter	2C6204
Concanavalin A solution	Vector	FL-1001	Prepare in PBS 1 mg/mL
Dissecting tools set			Includes hemostats, scissors and forceps
FIJI			Software for image processing
Fluorescence microscope	Nikon	Eclipse Ni
Forceps, Dumont #5, Biological grade tip	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72700-D
Gavage Needle 1.25 mm OD barrel tip x 30 mm	Fine Science	18060-20
Halstead Mosquito Forceps	Fisher Scientific	13-812-10
I.V. Catheter set with regulating clamp 70 inches	Baxter	2C5417s
I.V. Pole
Lint free tissue			Kimpwipes is an option
Micro dissecting spring scissors, Vannas, 3 mm straight	ROBOZ	RS-5620
Micro spatula	Fine Science Tools (FST)	10091-12
Nikon		NIS-Elements (AR 5.30.03 64-bit)	Software for image acquisition
Petri dish (100 mmx15 mm)	Corning	351029
Phosphate buffered saline (PBS)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72670
Pressure infuser	Infusurge	4010
Razor blades, GEM single edge stainless steel, Teflon coated	Electron Microscopy Sciences (EMS)	71970
Saline 0.9%, veterinary grade, 1000 mL	Baxter	04925-04-10
Small dissecting scissors, curved blunt end 22 mm	ROBOZ	RS 5983