Cuantificación de leucocitos adherentes inducidos por diabetes en la vasculatura de la retina

Resumen

Demostramos un método para etiquetar las paredes de la vasculatura de la retina y los leucocitos adherentes. Estos leucocitos adherentes se pueden contar bajo un microscopio de fluorescencia como un parámetro de inflamación o la respuesta de esa inflamación a las terapias.

Resumen

La leucostasis se refiere a la unión de los leucocitos a la pared luminal de la vasculatura. Esta interacción de los leucocitos con la pared de los vasos sanguíneos es característica de la inflamación y se ha relacionado causalmente con la oclusión capilar en una variedad de tejidos y enfermedades, incluida la retinopatía diabética.

La leucotasia se ha reportado durante años como una complicación potencialmente mortal de la hiperleucocitosis y solo se puede diagnosticar clínicamente. Dada la importancia del fenómeno, se han realizado investigaciones intensivas para comprender los posibles mecanismos que conducen a su manifestación; Sin embargo, no existe una técnica estándar de oro en entornos de laboratorio para visualizar y cuantificar la gravedad del evento.

En el método que se resume a continuación, la vasculatura se perfunde inicialmente con un tampón para extraer sangre y, a continuación, la concanavalina A se perfunde en la vasculatura, donde se une a todas las paredes celulares expuestas y provoca una tinción especialmente brillante de los leucocitos. Si la perfusión para eliminar todas las células sanguíneas no unidas fue exitosa, los leucocitos marcados con fluorescencia restantes se unen a la vasculatura y se pueden cuantificar manualmente utilizando cualquier microscopio de fluorescencia disponible.

Introducción

Los leucocitos (glóbulos blancos, leucocitos) desempeñan un papel importante en la función óptima de la vasculatura, como el mantenimiento de la fluidez sanguínea y la regulación de la resolución del trombo¹. También juegan un papel clave en algunas condiciones patológicas, como la adherencia a la pared luminal de la vasculatura durante períodos prolongados de tiempo que conducen a la obstrucción de los vasos, al menos temporalmente, un fenómeno conocido como leucotasia ^2,3.

La retinopatía diabética es una de las complicaciones más comunes de la diabetes a largo plazo y una de las principales causas de discapacidad visual y ceguera en los Estados Unidos y en todo el mundo para las personas de 20 a 75^{años de} edad. La degeneración lenta y progresiva de la vasculatura retiniana es un componente clínicamente significativo de las etapas tempranas de la enfermedad, que en algunos pacientes conduce a isquemia retiniana con la consiguiente neovascularización retiniana ^5,6. La evidencia acumulada indica que la inflamación juega un papel importante en el desarrollo de la retinopatía⁷, y la leucotasia se considera una respuesta inflamatoria intravascular subclínica. La leucotasia ocurre en las primeras etapas de la diabetes, mucho antes de que se desarrollen las manifestaciones clínicas detectables ^8,9,10. El taponamiento repetido de los vasos retinianos por parte de los leucocitos adheridos durante meses o años (leucotasia crónica) en la diabetes podría contribuir a la oclusión vascular y a la degeneración de los capilares 11,12,13. La gravedad de esta leucotasia es de importancia patológica y puede utilizarse para controlar la gravedad del proceso de la enfermedad o para evaluar la eficacia de una terapia en entornos de investigación.

Para profundizar en el estudio de los efectos específicos del microambiente hiperglucémico sobre la leucotasia, se han diseñado modelos in vitro. Las células endoteliales microvasculares aisladas de la retina pueden cultivarse y organizarse en modelos de cultivo 2 o 3D (microvasculatura en un chip¹⁴) para replicar el endotelio vascular (la monocapa celular que pavimenta la luz de los vasos). Sin embargo, la variación interexperimental de estos modelos limita su uso. El estudio de la leucotasia en la vasculatura de la retina humana in vivo es aún limitado y, por lo tanto, la mayor parte del conocimiento actual sobre la leuchatasia de la retina se deriva de modelos animales de retinopatía diabética^13,15.

El objetivo de este reporte es describir un protocolo estándar basado en los métodos descritos en otros¹⁶ para la cuantificación de los leucocitos adheridos a la vasculatura retiniana como parámetro de la leucostasis. Este ensayo puede ser utilizado para estudiar otras enfermedades vasculares que también presentan leucostasis, como neoplasias malignas 3,17,18,19 y algunas afecciones infecciosas y alérgicas 20. Este protocolo puede ser implementado en cualquier laboratorio de investigación básica sin necesidad de equipos especializados. En el método resumido a continuación, la vasculatura se perfunde inicialmente con tampón para extraer la sangre y, a continuación, la concanavalina A se perfunde en la vasculatura, donde se une a todas las paredes celulares expuestas y provoca una tinción especialmente brillante de los leucocitos 21,22,23. Si la perfusión para eliminar todas las células sanguíneas no unidas tiene éxito, los leucocitos marcados con fluorescencia restantes que están unidos a la vasculatura se pueden cuantificar manualmente utilizando cualquier microscopio de fluorescencia que tenga a mano.

Protocolo

El protocolo ha sido revisado y aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de California en Irvine, y cumple con las regulaciones gubernamentales sobre el cuidado y uso de animales de laboratorio. No hay puntos de parada en este protocolo. El tiempo medio por ratón es de 30 min.

1. Preparación de la etapa de perfusión

1. Calentar la bolsa de solución salina al 0,9% y la solución de concanavalina A en un baño de agua a 37 ^oC durante 20-30 min antes de usar.
   NOTA: Proteja la concanavalina A de la exposición a la luz (cúbrala con papel de aluminio).
2. Coloque una bandeja para contener la sangre y los líquidos que gotean en la superficie donde se llevará a cabo el procedimiento. En la parte superior de la bandeja, coloque una almohadilla térmica cubierta con una almohadilla absorbente o cualquier material absorbente.
   NOTA: El objetivo es evitar que el cuerpo del ratón pierda calor durante el procedimiento, ya que el enfriamiento dificulta la extracción de sangre durante la perfusión.

2. Configuración del infusor de presión

1. Conecte en serie la bolsa de solución salina al 0,9%, el juego de catéteres intravenosos, una llave de paso de válvula de 4 vías y la aguja de sonda nasogástrica.
2. Inserte la bolsa de solución salina al 0,9% entre la red y la cámara de aire del infusor de presión. Cuelgue la bolsa de solución salina en el gancho ubicado en la parte posterior de la cámara de aire. Utilice el lazo del polo intravenoso para colgar el infusor de presión en el polo intravenoso.
3. Purgue las líneas y los puertos de todas las burbujas de aire dejando que el sistema se abra (funcione) durante un par de minutos y ajuste el caudal a 18-20 mL/min²⁴. Para inflar la cámara de aire del infusor de presión, gire la manija de la llave de paso para que apunte hacia la ventilación de la llave de paso abierta, luego bombee la bombilla de inflado hasta que el manómetro indique la presión deseada. Vuelva a ajustar la presión antes de fusionar cada mouse. Para desinflar, gire la manija de la llave de paso hacia abajo, hacia la bombilla de inflado.
   NOTA: Si la bolsa de solución salina al 0,9% es nueva, generalmente una presión de 150 mmHg proporciona el caudal deseado; Sin embargo, la presión debe ajustarse empíricamente debido a las variaciones en las marcas de infusores de presión y durante el período de uso de la bolsa de solución salina al 0,9%.
4. Conecte una jeringa de 10 ml llena de solución de concanavalina A calentada a la válvula de 4 vías.
   NOTA: Proteja la jeringa de la exposición a la luz (cúbrala con papel de aluminio).

3. Anestesia

1. Administrar anestesia mediante inyección intraperitoneal (I.P.) de ketamina:xilacina; La dosis más utilizada para la cirugía/procedimiento con ratones es de 100:10 mg/kg de peso corporal²⁵. Evalúe la anestesia mediante el reflejo del pedal (pellizco firme del dedo del pie).
   NOTA: Esta dosis proporciona un inicio de 4-6 min con una duración de 45-60 min de anestesia quirúrgica. El cóctel anestésico se puede almacenar a temperatura ambiente durante un máximo de 2 semanas.

4. Perfusión transcárdica y tinción con concanavalina A

1. Coloque el ratón en la etapa de perfusión en posición supina para permitir la exposición de la cavidad torácica y abdominal.
2. Identifique visualmente la apófisis xifoides y, con el hemostático en la mano dominante, sujete la piel con alfileres y fíjela. Una vez que el hemostático esté asegurado, transfiéralo a la mano no dominante y levante la piel.
3. Utilice unas tijeras en la mano dominante y corte, en un ángulo de 90° con respecto a la columna vertebral, un parche de piel para revelar la pared abdominal externa.
4. Con la apófisis xifoides y la caja torácica ahora visibles, diseccione a través de la pared abdominal bilateralmente, teniendo cuidado de evitar cortar cualquier órgano o vaso principal.
5. Con el diafragma ahora visible, visualice el corazón, los ventrículos y los pulmones a través del diafragma. Con la punta de las tijeras, corte el diafragma en uno de los flancos, cerca de la columna vertebral, teniendo cuidado de evitar cortar cualquier órgano o vaso principal.
   NOTA: Este "orificio" en el diafragma equilibrará la presión intratorácica negativa con la presión atmosférica, y se producirá un neumotórax colapsando los pulmones y retrayendo el corazón, facilitando la disección del diafragma sin dañar los pulmones ni el corazón.
6. Continúa diseccionando a través de las costillas y en paralelo a los pulmones para crear un "colgajo" en el pecho. Libera el hemostático y corta la apófisis xifoides en el plano sagital. Abra suavemente el proceso de xifoides manualmente. Observa las cuatro cámaras del corazón.
7. Con la mano no dominante y usando fórceps, agarre el corazón cerca de su ápice. Con la mano dominante, sostenga la aguja de sonda nasogástrica (conectada al catéter intravenoso) y perfore el vértice del corazón. Para evitar la perforación completa del ventrículo izquierdo o el alcance de la vasculatura pulmonar y luego una mala perfusión de la vasculatura sistémica, verifique la colocación del extremo de la punta esférica de la aguja de sonda nasogástrica, que debe estar en el borde del sitio de punción que sobresalga ligeramente del corazón. Sujete la aguja de sonda nasogástrica en su lugar con pinzas antimosquitos curvas o simplemente sujétela con la mano mientras manipula la llave de paso intravenosa.
8. Abra la llave de paso a la solución salina al 0,9% y casi simultáneamente, abra el ventrículo derecho con unas tijeras; perfundir durante 2-3 min. Durante el tiempo de perfusión, mueva suavemente la aguja de un lado a otro y de arriba a abajo para reducir la torcedura de la vasculatura y aumentar la salida de sangre del corazón.
9. Después de perfundir con solución salina, gire la manija de la llave de paso para cortar el flujo de la solución salina y permitir el flujo de la jeringa a la aguja de sonda nasogástrica. Perfundir a mano con la solución de concanavalina A a una velocidad de estado estacionario. Asegúrese de que los 10 ml de solución de concanavalina A se dispensen en 30-35 s.
10. Después de la perfusión con concanavalina A, gire la válvula para cerrar el flujo de la jeringa y permitir el flujo desde la solución salina al 0,9% hasta la aguja de sonda nasogástrica nuevamente. Perfundir con la solución salina al 0,9% durante 2-3 minutos más. Retire la aguja de sonda nasogástrica del corazón.
    NOTA: La concanavalina A sugerida en este protocolo se conjuga con fluoresceína (verde); sin embargo, también está disponible la concanavalina A unida a otros fluorocromos.

5. Enucleación y aislamiento de retina fresca

1. Gire el ratón de lado y, con la mano no dominante, coloque el dedo índice y el pulgar en los párpados superior e inferior, respectivamente. Retraiga suavemente los párpados y la piel con los dedos y sostenga el ojo, haciendo que sobresalga parcialmente de la cuenca.
2. Mientras el ojo está apoyado, use tijeras curvas en la mano dominante y coloque debajo del ojo en un ángulo de 45°. Corta la inserción muscular y el nervio óptico. Usando las mismas tijeras que una espátula, transfiera el ojo a un recipiente pequeño o directamente a la etapa del microscopio de disección.
   NOTA: Tenga cuidado de no cortar la parte posterior del ojo y evite jalar el ojo durante este paso.
3. Coloque el ojo sobre una cera dental para abrir el globo. Bajo el microscopio de disección y con la mano no dominante, sostenga el pliegue escleral o los restos musculares aún unidos externamente al ojo posterior con micropinzas, y oriente el ojo de modo que la córnea mire hacia un lado.
   NOTA: Para evitar que el ojo se mueva o deslice al abrir el globo, se puede colocar un trozo de pañuelo húmedo sin pelusa encima de la cera dental.
4. Con una de las esquinas afiladas de una hoja de afeitar recubierta de teflón, haga una incisión de 1 a 2 mm detrás y paralela al limbo (unión córnea-esclerótica). Sostenga el pliegue escleral o el músculo con las micropinzas y pase la hoja por el limbo con una fuerza mínima hacia abajo. Continúe cortando con la navaja para separar totalmente el segmento anterior (córnea, iris, cristalino y vítreo) del segmento posterior (copa del ojo).
   NOTA: No corte de un lado a otro.
5. Transfiera el ocular dividido en dos a una placa de Petri pequeña con PBS.
   NOTA: Evite el contacto de la retina con el papel de seda (nota en el paso 5.3) ya que se adherirá firmemente al papel y será prácticamente imposible de recuperar.
6. Agarre un pliegue escleral o el músculo restante en la parte exterior de la esclerótica con micropinzas. Separe completamente la retina de la esclerótica rompiendo todas las conexiones en el limbo alrededor del perímetro de la copa del ojo con una microespátula. Saque la retina de la esclerótica con la microespátula. Si la retina todavía está unida a la esclerótica por el nervio óptico, deslice las microtijeras entre la retina y la esclerótica para cortar el nervio óptico.
7. Eliminar cualquier resto de músculo vítreo y ciliar en la periferia de la retina. Transfiera inmediatamente la retina aislada a un portaobjetos con algo de PBS.
   NOTA: Se puede utilizar cualquier otra técnica de aislamiento de retina dependiendo de la preferencia del investigador.

6. Montaje plano de la retina

1. Coloque la retina no fijada en un portaobjetos con una pequeña cantidad de PBS. Con la microespátula, oriente suavemente la retina con el lado vítreo hacia arriba. Si la retina está doblada hacia adentro, use micropinzas para sostener los bordes de la retina mientras la retina se despliega con la microespátula.
2. Haga 4-5 cortes radiales en la retina para que quede plana (patrón de trébol).
3. Con un pañuelo sin pelusa, seque el exceso de PBS lejos de la retina.
   NOTA: No toque la retina con el tejido; de lo contrario, la muestra se perderá. El deslizamiento es deseable para mantener la retina plana.

7. Microscopía

NOTA: Para este paso se puede utilizar cualquier microscopio de fluorescencia con un canal GFP/FITC (480/530 nm). Para este trabajo se utilizó el microscopio referenciado de 488 canales y el software asociado para la adquisición de imágenes.

1. Observe la retina recientemente montada plana bajo el microscopio con un aumento de 100x (objetivo de 10x) y cuente los leucocitos marcados con fluorescencia (manualmente) escaneando metódicamente todo el tejido (de derecha a izquierda o de arriba a abajo).
   NOTA: Los leucocitos son puntos fluorescentes individuales que pueden mostrar una forma redonda u ovalada. Tienen un diámetro de 12-15 μm y no sobresalen de los capilares de la retina (la estructura está completamente constreñida por la luz del vaso).
2. Adquiera imágenes representativas con la ampliación deseada y realice el posprocesamiento de las imágenes con el software de su elección (por ejemplo, ImageJ [Fiji]).
3. Expresa el recuento como leucocitos por retina. Grafica los datos por media ± desviación estándar.

Resultados

Un protocolo de perfusión y tinción bien ejecutado mostrará la vasculatura retiniana completa delineada con concanavalina A (Figura 1). Una mala perfusión del ratón impide el marcaje de todo el árbol vascular y el posterior análisis de los leucocitos adheridos a la luz (Figura 2), mientras que la presión excesiva de un apretón rápido de una jeringa (menos de 30-35 s) puede provocar permeabilidad vascular y rotura de lo...

Discusión

La leucotasia en humanos se refiere a los síntomas y hallazgos clínicos asociados con la hiperleucocitosis (recuento total de leucocitos (leucocitos) >100.000/μL) y es una emergencia médica²⁰. Los mecanismos que conducen a la leucotasia están bajo una investigación intensiva. Hasta la fecha, el estudio de la leucotasia en humanos in vivo aún no es posible y los investigadores deben basarse en modelos animales para comprender este proceso. Diferente...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringe
4-way stopcock Luer lock I.V. line valve	Baxter	2C6204
Concanavalin A solution	Vector	FL-1001	Prepare in PBS 1 mg/mL
Dissecting tools set			Includes hemostats, scissors and forceps
FIJI			Software for image processing
Fluorescence microscope	Nikon	Eclipse Ni
Forceps, Dumont #5, Biological grade tip	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72700-D
Gavage Needle 1.25 mm OD barrel tip x 30 mm	Fine Science	18060-20
Halstead Mosquito Forceps	Fisher Scientific	13-812-10
I.V. Catheter set with regulating clamp 70 inches	Baxter	2C5417s
I.V. Pole
Lint free tissue			Kimpwipes is an option
Micro dissecting spring scissors, Vannas, 3 mm straight	ROBOZ	RS-5620
Micro spatula	Fine Science Tools (FST)	10091-12
Nikon		NIS-Elements (AR 5.30.03 64-bit)	Software for image acquisition
Petri dish (100 mmx15 mm)	Corning	351029
Phosphate buffered saline (PBS)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72670
Pressure infuser	Infusurge	4010
Razor blades, GEM single edge stainless steel, Teflon coated	Electron Microscopy Sciences (EMS)	71970
Saline 0.9%, veterinary grade, 1000 mL	Baxter	04925-04-10
Small dissecting scissors, curved blunt end 22 mm	ROBOZ	RS 5983