망막 혈관 구조에서 당뇨병 유발 부착 백혈구의 정량화

요약

우리는 망막 혈관 구조와 부착 백혈구의 벽을 라벨링하는 방법을 보여줍니다. 그런 다음 이러한 부착 백혈구는 형광 현미경으로 염증의 매개 변수 또는 치료에 대한 염증의 반응으로 계산할 수 있습니다.

초록

백혈구증(Leukostasis)은 혈관 구조의 내강벽(luminal wall)에 백혈구가 부착되는 것을 말합니다. 백혈구와 혈관 벽의 이러한 상호 작용은 염증의 특징이며 당뇨병성 망막병증을 포함한 다양한 조직 및 질병에서 모세혈관 폐색과 인과 관계가 있습니다.

백혈구증은 생명을 위협하는 고백혈구증가증의 합병증으로 수년 동안 보고되어 왔으며 임상적으로만 진단할 수 있습니다. 현상의 중요성을 감안할 때, 그 징후로 이어지는 잠재적 메커니즘을 이해하기 위해 집중적인 연구가 수행되었습니다. 그러나 실험실 환경에는 사건의 심각성을 시각화하고 정량화할 수 있는 황금 표준 기술이 없습니다.

아래에 요약된 방법에서, 혈관 구조는 처음에 혈액을 제거하기 위해 완충액으로 관류된 다음 콘카나발린 A가 혈관 구조로 관류되어 노출된 모든 세포벽에 결합하고 특히 백혈구의 밝은 염색을 유발합니다. 결합되지 않은 모든 혈액 세포를 제거하기 위한 관류가 성공적이면 나머지 형광 표지된 백혈구가 혈관 구조에 결합되고 사용 가능한 형광 현미경을 사용하여 수동으로 정량화할 수 있습니다.

서문

백혈구(백혈구, WBC)는 혈액 유동성 유지 및 혈전 해상도^{조절 1}과 같은 혈관 구조의 최적 기능에 중요한 역할을 합니다. 그들은 또한 혈관 구조의 내강벽에 장기간 부착하여 적어도 일시적으로 혈관 폐색으로 이어지는 것과 같은 일부 병리학적 조건에서 중요한 역할을 하는데, 이는 백혈구 ^2,3로 알려진 현상입니다.

당뇨병성 망막병증은 장기 당뇨병의 가장 흔한 합병증 중 하나이며 미국과 전 세계적으로 20-75세의 개인에게 시력 장애 및 실명의 주요 원인 중 하나입니다⁴. 망막 혈관 구조의 느리고 점진적인 퇴행은 질병의 초기 단계에서 임상적으로 의미 있는 구성 요소이며, 일부 환자에서는 망막 신생혈관형성과 함께 망막 허혈을 유발합니다 ^5,6. 누적된 증거에 따르면 염증은 망막^병증의 발병에 중요한 역할을 하며, 7 백혈구증은 무증상 혈관 내 염증 반응으로 간주된다. 백혈구증은 당뇨병의 초기 단계에서 발생하며, 감지할 수 있는 임상 증상이 나타나기 훨씬 전에 발생합니다 ^8,9,10. 당뇨병에서 수개월에서 수년에 걸쳐 부착된 백혈구에 의한 망막 혈관의 반복적인 막힘(만성 백혈구증)은 모세혈관의 혈관 폐색과 퇴행에 기여할 수 있습니다 11,12,13. 이 백혈구증의 중증도는 병리학적으로 중요하며 질병 진행의 중증도를 모니터링하거나 연구 환경에서 치료의 효능을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

백혈구증에 대한 고혈당 미세환경의 구체적인 효과를 추가로 연구하기 위해 시험관 내 모델이 설계되었습니다. 분리된 망막 미세혈관 내피 세포는 혈관 내피(혈관의 내강을 포장하는 세포 단층)를 복제하기 위해 2D 또는 3D 배양 모델(미세혈관 구조¹⁴)에서 성장 및 배열할 수 있습니다. 그러나 이러한 모델의 실험 간 변형으로 인해 사용이 제한됩니다. 생체 내 인간 망막 혈관 구조에서의 백혈구증에 대한 연구는 여전히 제한적이기 때문에 망막 백혈구증에 대한 현재 지식의 대부분은 당뇨병성 망막병증의 동물 모델에서 파생됩니다^13,15.

이 보고서의 목적은 백혈구의 매개변수로서 망막 혈관 구조에 부착된 백혈구를 정량화하기 위해 다른¹⁶에 설명된 방법을 기반으로 하는 표준 프로토콜을 설명하는 것입니다. 이 분석법은 악성 종양 ^3,17,18,19 및 일부 감염성 및 알레르기성 질환²⁰과 같은 백혈구 질환을 동반하는 다른 혈관 질환을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 특수 장비 없이 모든 기초 연구 실험실에서 구현할 수 있습니다. 아래에 요약된 방법에서, 혈관 구조는 처음에 혈액을 제거하기 위해 완충액으로 관류된 다음, 콘카나발린 A가 혈관 구조로 관류되어 노출된 모든 세포벽에 결합하고 특히 백혈구의 밝은 염색을 유발합니다 21,22,23. 결합되지 않은 모든 혈액 세포를 제거하기 위한 관류가 성공적일 경우, 혈관 구조에 결합된 나머지 형광 표지 백혈구는 손에 있는 형광 현미경을 사용하여 수동으로 정량화할 수 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜은 University of California Irvine의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 검토 및 승인했으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 정부 규정을 준수합니다. 이 프로토콜에는 중지 지점이 없습니다. 마우스당 평균 시간은 30분입니다.

1. 관류 단계 준비

1. 사용하기 전에 0.9% 식염수 백과 콘카나발린 A 용액을 37 ^{°C 수}조에서 20-30분 동안 예열합니다.
   참고: 콘카나발린 A를 빛 노출로부터 보호하십시오(호일로 덮으십시오).
2. 절차가 진행될 표면에 떨어지는 혈액과 액체를 담을 수 있는 트레이를 설정합니다. 트레이 위에 흡수성 벤치 언더패드 또는 흡수성 재료로 덮인 가열 패드를 놓습니다.
   알림: 목표는 냉각으로 인해 관류 중에 혈액을 제거하기가 더 어렵기 때문에 절차 중에 마우스의 몸이 열을 잃는 것을 방지하는 것입니다.

2. 압력 주입기 설정

1. 0.9% 식염수 백, IV 카테터 세트, 4방향 밸브 마개 및 개게이지 바늘을 직렬로 연결합니다.
2. 그물망과 압력 주입기의 공기 주머니 사이에 0.9% 식염수 백을 삽입합니다. 식염수 주머니를 공기 주머니 뒷면에 있는 고리에 걸어두십시오. I.V. 폴 루프를 사용하여 I.V. 폴에 압력 주입기를 걸어둡니다.
3. 시스템을 몇 분 동안 열고(실행) 하여 모든 기포의 라인과 포트를 퍼지하고 유속을 18-20mL/min²⁴로 설정합니다. 압력 주입기 공기 주머니를 팽창시키려면 스톱콕 핸들을 열린 스톱콕 통풍구를 가리키도록 돌린 다음 압력 게이지가 원하는 압력을 나타낼 때까지 팽창 전구를 펌핑합니다. 각 마우스를 관류하기 전에 압력을 다시 조정하십시오. 공기를 빼려면 스톱콕 핸들을 팽창 전구 쪽으로 똑바로 돌립니다.
   알림: 0.9% 식염수 백이 새 제품인 경우 일반적으로 150mmHg 압력이 원하는 유량을 제공합니다. 그러나 압력은 압력 주입기 브랜드의 변화와 0.9% 식염수 백의 사용 기간에 따라 경험적으로 조정해야 합니다.
4. 가열된 콘카나발린 A 용액을 채운 10mL 주사기를 4방향 밸브에 부착합니다.
   알림: 주사기를 빛에 노출되지 않도록 보호하십시오(호일로 덮으십시오).

3. 마취

1. 케타민 : 자일라진의 복강 내 (IP) 주사로 마취를 전달합니다. 마우스 수술/시술에 가장 널리 사용되는 용량은 체중 100:10 mg/kg²⁵입니다. 페달 반사(단단한 발가락 꼬집음)로 마취를 평가합니다.
   참고: 이 용량은 45-60분의 외과적 마취 기간과 함께 4-6분의 시작을 제공합니다. 마취 칵테일은 최대 2주 동안 실온에서 보관할 수 있습니다.

4. 콘카나발린 A를 사용한 경심 관류 및 염색

1. 흉강과 복강이 노출될 수 있도록 누운 자세로 마우스를 관류 스테이지에 놓습니다.
2. 시포이드 돌기를 육안으로 식별하고 주로 사용하는 손의 지혈로 피부를 고정하고 잠급니다. 지혈이 고정되면 주로 사용하지 않는 손으로 옮기고 피부를 들어 올립니다.
3. 주로 사용하는 손에 가위를 사용하여 척추와 90° 각도로 피부 패치를 잘라 바깥쪽 복벽을 드러냅니다.
4. 이제 xiphoid process와 흉곽이 보이면 복벽을 통해 양측으로 절개하고 장기나 주요 혈관이 절단되지 않도록 주의하십시오.
5. 이제 횡격막이 보이면 횡격막을 통해 심장과 폐를 시각화합니다. 가위 끝을 사용하여 척추에 가까운 옆구리 중 하나의 횡격막을 자르고 장기나 주요 혈관을 절단하지 않도록 주의하십시오.
   참고: 횡격막의 이 "구멍"은 음의 흉곽 내압을 대기압과 평형을 이루고 기흉이 발생하여 폐가 무너지고 심장이 수축되어 폐나 심장을 손상시키지 않고 횡격막의 해부를 용이하게 합니다.
6. 갈비뼈를 통해 폐와 평행하게 계속 절개하여 가슴 "플랩"을 만듭니다. 지혈을 풀고 시상면에서 xiphoid process를 자릅니다. xiphoid 프로세스를 수동으로 부드럽게 활짝 엽니다. 심장의 네 방을 관찰하십시오.
7. 주로 사용하지 않는 손과 집게를 사용하여 심장의 정점 근처를 잡습니다. 주로 사용하는 손으로 위장 바늘(IV 카테터에 부착됨)을 잡고 심장 정점에 구멍을 뚫습니다. 좌심실의 완전한 천공이나 폐 혈관 조직에 도달 한 다음 전신 혈관 조직의 관류 불량을 피하려면 심장에서 약간 돌출 된 천공 부위의 가장자리에 있어야하는 간 바늘의 볼 끝 끝의 위치를 확인하십시오. 구부러진 모기집게를 사용하여 개비지 바늘을 제자리에 고정하거나 IV 마개를 조작하는 동안 손으로 잡기만 하면 됩니다.
8. 마개를 0.9% 식염수로 열고 거의 동시에 가위로 우심실을 자릅니다. 2-3분 동안 관류합니다. 관류 시간 동안 바늘을 좌우로, 위아래로 부드럽게 움직여 혈관 구조의 꼬임을 줄이고 심장에서 혈액 배출을 증가시킵니다.
9. 식염수를 관류한 후 스톱콕 핸들을 돌려 식염수의 흐름을 차단하고 주사기에서 개관 바늘로 흐르도록 합니다. 일정한 상태 속도로 concanavalin A 용액을 사용하여 수동으로 관류합니다. 10mL의 콘카나발린 A 용액이 30-35초 안에 분배되는지 확인합니다.
10. 콘카나발린 A로 관류한 후 밸브를 돌려 주사기의 흐름을 차단하고 0.9% 식염수에서 위장 바늘로 다시 흐르도록 합니다. 0.9% 식염수를 추가로 2-3분 동안 관류합니다. 심장에서 간바늘을 제거합니다.
    참고: 이 프로토콜에서 제안된 콘카나발린 A는 플루오레세인(녹색)과 결합됩니다. 그러나 다른 형광 색소에 부착된 콘카나발린 A도 사용할 수 있습니다.

5. 신선한 망막의 적출 및 격리

1. 마우스를 옆으로 돌리고 주로 사용하지 않는 손을 사용하여 검지와 엄지손가락을 각각 위쪽 눈꺼풀과 아래쪽 눈꺼풀에 놓습니다. 손가락으로 눈꺼풀과 피부를 부드럽게 접어 눈구멍을 돌출시켜 눈구멍에서 부분적으로 부풀어 오르게 합니다.
2. 눈이 돌출되어 있는 동안 주로 사용하는 손에 구부러진 가위를 사용하여 눈 아래를 45° 각도로 퍼냅니다. 근육 부착부와 시신경을 잘라냅니다. 주걱과 같은 가위를 사용하여 눈을 작은 용기로 옮기거나 해부 현미경의 단계로 직접 옮깁니다.
   알림: 이 단계에서 눈 뒤쪽을 자르지 않도록 주의하고 눈을 당기지 마십시오.
3. 치과 용 왁스에 눈을 대면 지구본이 열립니다. 해부 현미경 아래에서 주로 사용하지 않는 손을 사용하여 공막 주름이나 뒤쪽 눈 바깥쪽에 붙어 있는 근육 잔여물을 마이크로 집게로 잡고 각막이 옆을 향하도록 눈의 방향을 잡습니다.
   알림: 지구본을 여는 동안 눈이 움직이거나 미끄러지는 것을 방지하기 위해 보푸라기가 없는 젖은 티슈 조각을 치과 왁스 위에 놓을 수 있습니다.
4. 테프론 코팅된 면도날의 날카로운 모서리 중 하나를 사용하여 가장자리(각막-공막 접합부)와 평행하게 1-2mm 뒤로 절개합니다. 마이크로 집게로 공막 주름이나 근육을 잡고 최소한의 아래쪽 힘으로 가장자리를 가로질러 칼날을 당깁니다. 면도기로 계속 절단하여 전안부(각막, 홍채, 수정체, 유리체)와 후안부(안구컵)를 완전히 분리합니다.
   알림: 앞뒤로 톱질하지 마십시오.
5. 이등분된 아이컵을 PBS가 있는 작은 페트리 접시에 옮깁니다.
   참고: 망막이 티슈 페이퍼(5.3단계 참고)와 접촉하면 종이에 단단히 달라붙어 본질적으로 회복할 수 없게 되므로 피하십시오.
6. 공막 주름이나 공막 바깥쪽에 남아 있는 근육을 마이크로 집게로 잡습니다. 마이크로 주걱을 사용하여 눈컵 둘레의 가장자리에서 모든 연결을 끊어 공막에서 망막을 완전히 분리합니다. 마이크로 주걱으로 공막에서 망막을 퍼냅니다. 망막이 여전히 시신경에 의해 공막에 붙어 있으면 망막과 공막 사이에 마이크로 가위를 밀어 넣어 시신경을 절단합니다.
7. 망막 주변부에 있는 유리체 및 섬모 근육의 잔여물을 제거합니다. 즉시 고립된 망막을 PBS가 있는 슬라이드로 옮깁니다.
   참고: 연구자의 선호도에 따라 다른 망막 분리 기술을 사용할 수 있습니다.

6. 망막의 편평한 설치

1. 고정되지 않은 망막을 소량의 PBS가 있는 슬라이드에 배치합니다. 마이크로 주걱을 사용하여 유리체 면이 위로 향하도록 망막의 방향을 부드럽게 잡습니다. 망막이 안쪽으로 접혀 있는 경우, 마이크로 주걱을 사용하여 망막을 펼치는 동안 마이크로 집게를 사용하여 망막의 가장자리를 잡습니다.
2. 망막이 평평하게 놓이도록 4-5 개의 방사형 절단을 만듭니다 (클로버 잎 패턴).
3. 보푸라기가 없는 조직을 사용하여 망막에서 과도한 PBS를 건조시킵니다.
   알림: 조직으로 망막을 만지지 마십시오. 그렇지 않으면 샘플이 손실됩니다. 커버슬립은 망막을 평평하게 유지하는 데 바람직합니다.

7. 현미경 검사

참고: 이 단계에는 GFP/FITC(480/530nm) 채널이 있는 모든 형광 현미경을 사용할 수 있습니다. 이 작업을 위해 우리는 이미지 획득을 위해 488 채널 및 관련 소프트웨어가 있는 참조 현미경을 사용했습니다.

1. 최근에 편평하게 장착된 망막을 100배 배율(10x 대물렌즈)로 현미경으로 관찰하고 전체 조직을 체계적으로(오른쪽에서 왼쪽 또는 위에서 아래로) 체계적으로 스캔하여 형광 표지된 백혈구를 계수(수동으로)합니다.
   참고: 백혈구는 원형 또는 타원형 모양을 표시할 수 있는 단일 형광 점입니다. 직경이 12-15μm이며 망막 모세혈관에서 돌출되지 않습니다(구조는 혈관의 내강에 의해 완전히 제한됨).
2. 원하는 배율로 대표 이미지를 획득하고 선택한 소프트웨어(예: ImageJ[Fiji])로 이미지의 후처리를 수행합니다.
3. 개수를 망막당 백혈구로 표현합니다. 평균 ± 표준 편차로 데이터를 그래프로 표시합니다.

결과

잘 실행된 관류 및 염색 프로토콜은 concanavalin A로 묘사된 완전한 망막 혈관 구조를 보여줍니다(그림 1). 마우스의 관류가 불량하면 전체 혈관 트리의 라벨링과 내강에 부착된 백혈구의 후속 분석을 방해하는 반면(그림 2), 주사기를 빠르게 짜는 과도한 압력(30-35초 미만)은 혈관 투과성과 혈관 파열을 유발할 수 있습니다(

토론

인간의 백혈구증은 고백혈구증가증(총 백혈구(WBC) 수 >100,000/μL)과 관련된 증상 및 임상 소견을 말하며, 응급 의료 상황이다²⁰. 백혈구증을 유발하는 메커니즘은 집중적인 연구가 진행 중입니다. 현재까지 생체 내 인간의 백혈구증에 대한 연구는 아직 불가능하며 연구자들은 이 과정을 이해하기 위해 동물 모델에 의존해야 합니다. 다양한 질병이 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringe
4-way stopcock Luer lock I.V. line valve	Baxter	2C6204
Concanavalin A solution	Vector	FL-1001	Prepare in PBS 1 mg/mL
Dissecting tools set			Includes hemostats, scissors and forceps
FIJI			Software for image processing
Fluorescence microscope	Nikon	Eclipse Ni
Forceps, Dumont #5, Biological grade tip	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72700-D
Gavage Needle 1.25 mm OD barrel tip x 30 mm	Fine Science	18060-20
Halstead Mosquito Forceps	Fisher Scientific	13-812-10
I.V. Catheter set with regulating clamp 70 inches	Baxter	2C5417s
I.V. Pole
Lint free tissue			Kimpwipes is an option
Micro dissecting spring scissors, Vannas, 3 mm straight	ROBOZ	RS-5620
Micro spatula	Fine Science Tools (FST)	10091-12
Nikon		NIS-Elements (AR 5.30.03 64-bit)	Software for image acquisition
Petri dish (100 mmx15 mm)	Corning	351029
Phosphate buffered saline (PBS)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72670
Pressure infuser	Infusurge	4010
Razor blades, GEM single edge stainless steel, Teflon coated	Electron Microscopy Sciences (EMS)	71970
Saline 0.9%, veterinary grade, 1000 mL	Baxter	04925-04-10
Small dissecting scissors, curved blunt end 22 mm	ROBOZ	RS 5983