כימות של לויקוציטים דבקים המושרים על ידי סוכרת בכלי הדם ברשתית

Summary

אנו מדגימים שיטה לתיוג דפנות כלי הדם ברשתית ולויקוציטים דביקים. לאחר מכן ניתן לספור את הלויקוציטים הדבקים הללו במיקרוסקופ פלואורסצנטי כפרמטר לדלקת או לתגובה של דלקת זו לטיפולים.

Abstract

לוקוסטזיס מתייחס להצמדה של לויקוציטים לדופן הלומינלית של כלי הדם. אינטראקציה זו של לויקוציטים עם דופן כלי הדם אופיינית לדלקת ונקשרה באופן סיבתי לחסימת נימים במגוון רקמות ומחלות, כולל רטינופתיה סוכרתית.

לוקוסטזיס דווח במשך שנים כסיבוך מסכן חיים של היפרלויקוציטוזיס וניתן לאבחן אותו רק באופן קליני. לאור חשיבות התופעה, נעשה מחקר אינטנסיבי כדי להבין את המנגנונים הפוטנציאליים המובילים לביטויה; עם זאת, אין טכניקה סטנדרטית בתנאי מעבדה כדי להמחיש ולכמת את חומרת האירוע.

בשיטה המסוכמת להלן, כלי הדם מוחדרים בתחילה עם חיץ להסרת דם, ולאחר מכן, קונקנבלין A מוחדר לכלי הדם שם הוא נקשר לכל דפנות התאים החשופים וגורם להכתמה בהירה במיוחד של לויקוציטים. אם הזלוף להסרת כל תאי הדם הלא קשורים הצליח, הלויקוציטים הנותרים המסומנים באופן פלואורסצנטי קשורים לכלי הדם, וניתן לכמת אותם באופן ידני באמצעות כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי זמין.

Introduction

לויקוציטים (תאי דם לבנים, WBCs) ממלאים תפקיד חשוב בתפקוד האופטימלי של כלי הדם כגון שמירה על נזילות הדם וויסות רזולוציית הפקקת¹. הם גם ממלאים תפקיד מפתח במצבים פתולוגיים מסוימים, כגון היצמדות לדופן הלומינלית של כלי הדם לפרקי זמן ממושכים המובילים לחסימת כלי דם, לפחות באופן זמני, תופעה המכונה לויקוסטזיס ^2,3.

רטינופתיה סוכרתית היא אחד הסיבוכים השכיחים ביותר של סוכרת ארוכת טווח ואחד הגורמים המובילים ללקות ראייה ועיוורון בארה"ב ובעולם בקרב אנשים^בגילאי 20-75 שנים. ניוון איטי ומתקדם של כלי הדם ברשתית הוא מרכיב בעל משמעות קלינית בשלבים המוקדמים של המחלה, אשר בחלק מהחולים מוביל לאיסכמיה ברשתית עם ניאו-וסקולריזציה של הרשתית כתוצאה מכך ^5,6. עדויות מצטברות מצביעות על כך שדלקת ממלאת תפקיד חשוב בהתפתחות הרטינופתיה⁷, ולויקוסטזיס נחשבת לתגובה דלקתית תוך-וסקולרית תת-קלינית. לוקוסטזיס מתרחש בשלבים המוקדמים של הסוכרת, הרבה לפני שהתפתחו ביטויים קליניים הניתנים לזיהוי ^8,9,10. סתימה חוזרת ונשנית של כלי הרשתית על ידי לויקוציטים דביקים במשך חודשים עד שנים (לויקוסטזיס כרוני) בסוכרת עשויה לתרום לחסימה וניוון של כלי הדם 11,12,13. חומרת הלויקוסטזיס היא בעלת משמעות פתולוגית וניתן להשתמש בה כדי לנטר את חומרת תהליך המחלה או להעריך את יעילות הטיפול במסגרות מחקר.

כדי להמשיך ולחקור את ההשפעות הספציפיות של המיקרו-סביבה ההיפרגליקמית על לויקוסטזיס, תוכננו מודלים במבחנה. ניתן לגדל ולסדר תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים מבודדים ברשתית במודלים של תרביות דו-ממדיות או תלת-ממדיות (microvasculature-on-a-chip¹⁴) כדי לשכפל את האנדותל של כלי הדם (שכבת התא החד-שכבתית המרצפת את לומן הכלים). עם זאת, השונות הבין-ניסויית של מודלים אלה מגבילה את השימוש בהם. המחקר על לויקסטזיס בכלי דם ברשתית האנושית עדיין מוגבל, ולכן רוב הידע הנוכחי על לויקוסטזיס ברשתית נגזר ממודלים של בעלי חיים של רטינופתיה סוכרתית^13,15.

מטרת דוח זה היא לתאר פרוטוקול סטנדרטי המבוסס על שיטות שתוארו במקום אחר¹⁶ לכימות לויקוציטים מחוברים לכלי הדם ברשתית כפרמטר של לויקוסטזיס. ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי לחקור מחלות כלי דם אחרות המציגות גם לויקוסטזיס, כגון ממאירויות 3,17,18,19 וכמה מצבים זיהומיים ואלרגיים 20. ניתן ליישם פרוטוקול זה בכל מעבדת מחקר בסיסית ללא צורך בציוד מיוחד. בשיטה המסוכמת להלן, כלי הדם מוחדרים בתחילה עם בופר להסרת דם, ולאחר מכן, קונקנבלין A מוחדר לכלי הדם שם הוא נקשר לכל דפנות התאים החשופים וגורם להכתמה בהירה במיוחד של לויקוציטים 21,22,23. אם הזלוף להסרת כל תאי הדם הלא קשורים מצליח, ניתן לכמת ידנית את הלויקוציטים הנותרים המסומנים בפלואורסצנט הקשורים לכלי הדם באמצעות כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהישג יד.

Protocol

הפרוטוקול נבדק ואושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת קליפורניה אירווין ותואם את התקנות הממשלתיות בנוגע לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. אין נקודות עצירה בפרוטוקול זה. הזמן הממוצע לעכבר הוא 30 דקות.

1. הכנת שלב הזלוף

1. יש לחמם את שקית המלח 0.9% ואת תמיסת הקונקנבלין A באמבט מים של 37 ^{מעלות צלזיוס}למשך 20-30 דקות לפני השימוש.
   הערה: הגן על concanavalin A מפני חשיפה לאור (מכסים בנייר כסף).
2. הגדר מגש שיכיל דם ונוזלים מטפטוף על פני השטח בו יתבצע ההליך. על גבי המגש, הניחו כרית חימום מכוסה בכרית ספסל סופגת או כל חומר סופג.
   הערה: המטרה היא למנוע מגוף העכבר לאבד חום במהלך ההליך, מכיוון שהקירור מקשה על הוצאת הדם במהלך הזלוף.

2. הגדרת אינפוזר הלחץ

1. חבר בסדרה את השקית של 0.9% מי מלח, סט צנתר IV, פקק שסתום 4 כיווני ומחט הגאווג'.
2. הכנס את שקית המלח 0.9% בין הרשת לשלפוחית האוויר של מחדיר הלחץ. תלו את שקית המלח על הוו הממוקם בגב שלפוחית האוויר. השתמש בלולאת מוט ה-IV כדי לתלות את אינפוזר הלחץ בקוטב ה-IV.
3. נקה את הקווים והיציאות מכל בועות האוויר על ידי מתן אפשרות למערכת להיפתח (לפעול) למשך מספר דקות והגדר את קצב הזרימה ל-18-20 מ"ל/דקה²⁴. כדי לנפח את שלפוחית האוויר של מחדיר הלחץ, סובב את ידית תא העצירה כך שתצביע לכיוון פתח האוורור הפתוח, ולאחר מכן שאב את נורת הניפוח עד שמד הלחץ יציין את הלחץ הרצוי. כוונן מחדש את הלחץ לפני החדרת כל עכבר. כדי להתרוקן, סובב את ידית תא העצירה ישר כלפי מטה לכיוון נורת הניפוח.
   הערה: אם שקית המלח של 0.9% חדשה, בדרך כלל לחץ של 150 מ"מ כספית מספק את קצב הזרימה הרצוי; עם זאת, יש להתאים את הלחץ באופן אמפירי עקב שינויים במותגי חליטת הלחץ ולאורך תקופת השימוש בשקית המלח 0.9%.
4. חבר מזרק של 10 מ"ל מלא בקונקנבלין מחומם תמיסה לשסתום 4 כיוונים.
   הערה: הגן על המזרק מפני חשיפה לאור (כסה בנייר כסף).

3. הרדמה

1. מתן הרדמה על ידי הזרקה תוך-צפקית (IP) של קטמין: קסילזין; המינון הנפוץ ביותר לניתוח/הליך עכבר הוא 100:10 מ"ג/ק"ג משקל גוף²⁵. הערכת הרדמה על ידי רפלקס דוושה (צביטת בוהן מוצקה).
   הערה: מינון זה מספק התחלה של 4-6 דקות עם משך של 45-60 דקות של הרדמה כירורגית. ניתן לאחסן את קוקטייל ההרדמה בטמפרטורת החדר למשך שבועיים לכל היותר.

4. זלוף וצביעה טרנס-קרדיאלית עם קונקנבלין A

1. הנח את העכבר על שלב הזלוף במצב שכיבה כדי לאפשר חשיפה של חלל בית החזה והבטן.
2. זהה חזותית את תהליך ה-xiphoid, ועם ההמוסטט ביד הדומיננטית, הצמד את העור ונעל אותו. לאחר שההמוסטט מאובטח, העבירו אותו ליד הלא דומיננטית והרימו את העור.
3. השתמשו במספריים ביד הדומיננטית וחתכו, בזווית של 90 מעלות לעמוד השדרה, כתם עור כדי לחשוף את דופן הבטן החיצונית.
4. כאשר תהליך ה-xiphoid וכלוב הצלעות נראים כעת, נתחו את דופן הבטן באופן דו-צדדי, והקפידו להימנע מחיתוך איברים או כלי דם עיקריים.
5. כאשר הסרעפת נראית כעת, דמיין את חדרי הלב והריאות דרך הסרעפת. בעזרת קצה המספריים חותכים את הסרעפת באחד האגפים, קרוב לעמוד השדרה, תוך הקפדה להימנע מחיתוך איברים או כלי דם גדולים.
   הערה: "חור" זה בסרעפת יאזן את הלחץ התוך-חזה השלילי עם הלחץ האטמוספרי, ופנאומוטורקס יתרחש שימוטט את הריאות ויחזיר את הלב, מה שיקל על דיסקציה של הסרעפת מבלי לפגוע בריאות או בלב.
6. המשיכו לנתח דרך הצלעות ובמקביל לריאות ליצירת "דש" חזה. שחרר את המוסטט וחתוך את תהליך ה-xiphoid במישור הסגיטלי. פתח בעדינות את תהליך ה-xiphoid באופן ידני. התבוננו בארבעת חדרי הלב.
7. בעזרת היד הלא דומיננטית ובעזרת מלקחיים, אחוז את הלב קרוב לקודקודו. עם היד הדומיננטית, החזק את מחט הגאווג' (המחוברת לצנתר IV) ונקב את קודקוד הלב. כדי למנוע ניקוב מלא של החדר השמאלי או הגעה לכלי הדם הריאתיים ולאחר מכן זלוף לקוי של כלי הדם המערכתיים, בדוק את מיקום קצה קצה הכדור של מחט הגאווג', שאמור להיות בקצה אתר הניקוב הבולט מעט מהלב. מהדק את מחט הגאווג' במקומה באמצעות מלקחיים מעוקלים נגד יתושים או פשוט החזק אותה ביד תוך כדי מניפולציה של תא העצירה IV.
8. פתח את תא העצירה למי מלח של 0.9% וכמעט בו זמנית, חתוך את החדר הימני במספריים; לחלחל למשך 2-3 דקות. במהלך זמן הזלוף, הזיזו בעדינות את המחט מצד לצד ולמעלה ולמטה כדי להפחית את כיווץ כלי הדם ולהגביר את יציאת הדם מהלב.
9. לאחר החדרת מי מלח, סובב את ידית תא העצירה כדי לכבות את הזרימה מהמלח ולאפשר זרימה מהמזרק למחט הגאווג'. לחלחל ביד עם תמיסת הקונקנבלין A בקצב מצב יציב. ודא שתמיסת 10 מ"ל של concanavalin A מחולקת תוך 30-35 שניות.
10. לאחר החדרה עם concanavalin A, סובב את השסתום כדי לכבות את הזרימה מהמזרק ולאפשר זרימה ממי המלח של 0.9% למחט הגוואג'. יש להחדיר את תמיסת המלח 0.9% למשך 2-3 דקות נוספות. הסר את מחט הגאווג' מהלב.
    הערה: הקונקנבלין A המוצע בפרוטוקול זה מצומד לפלואורסצאין (ירוק); עם זאת, קונקנבלין A המחובר לפלואורוכרומים אחרים זמין גם כן.

5. הוצאה ובידוד של רשתית טרייה

1. סובב את העכבר על צידו, ובעזרת היד הלא דומיננטית, הנח את האצבע המורה והאגודל על העפעפיים העליונים והתחתונים, בהתאמה. החזירו בעדינות את העפעפיים והעור בעזרת האצבעות והניחו את העין, מה שגורם לה לבלוט חלקית מהשקע.
2. בזמן שהעין מחוזקת, השתמש במספריים מעוקלים ביד הדומיננטית וגרף מתחת לעין בזווית של 45 מעלות. חתוך את החיבור השרירי ועצב הראייה. בעזרת אותם מספריים כמו מרית, העבירו את העין למיכל קטן או ישירות לשלב המיקרוסקופ המנתח.
   הערה: היזהר לא לחתוך את החלק האחורי של העין והימנע ממשיכת העין במהלך שלב זה.
3. הניחו את העין על שעווה דנטלית כדי לפתוח את הגלובוס. תחת מיקרוסקופ הניתוח ובעזרת היד הלא דומיננטית, החזיקו את הקפל הסקלרלי או את שאריות השרירים שעדיין מחוברים חיצונית לעין האחורית בעזרת מיקרו-מלקחיים, וכוונו את העין כך שהקרנית פונה הצידה.
   הערה: כדי למנוע מהעין לזוז/להחליק בזמן פתיחת הגלובוס, ניתן להניח פיסת רקמה רטובה נטולת מוך על גבי השעווה הדנטלית.
4. בעזרת אחת הפינות החדות של סכין גילוח מצופה טפלון, בצע חתך 1-2 מ"מ מאחורי ומקביל ללימבוס (צומת קרנית-סקלרה). החזק את הקפל או השריר עם המיקרו-מלקחיים, ומשוך את הלהב על פני הלימבוס בכוח מינימלי כלפי מטה. המשך לחתוך עם סכין הגילוח כדי להפריד לחלוטין את החלק הקדמי (הקרנית, הקשתית, העדשה והזגוגית) מהחלק האחורי (העין).
   הערה: אין לנסר קדימה ואחורה.
5. מעבירים את העין החצויה לצלחת פטרי קטנה עם PBS.
   הערה: הימנע ממגע של הרשתית עם נייר הטישו (הערה בשלב 5.3) מכיוון שהוא יידבק בחוזקה לנייר ולמעשה יהיה בלתי אפשרי לשחזר.
6. תפוס קפל סקלרלי או את השריר הנותר בחלק החיצוני של הסקלרה בעזרת מיקרו-מלקחיים. נתק לחלוטין את הרשתית מהסקלרה על ידי שבירת כל החיבורים בלימבוס סביב היקף גביעונית העין באמצעות מיקרו-מרית. הוציאו את הרשתית מהסקלרה בעזרת המיקרו-מרית. אם הרשתית עדיין מחוברת לסקלרה על ידי עצב הראייה, החלק את המספריים המיקרו בין הרשתית לסקלרה כדי לחתוך את עצב הראייה.
7. הסר שאריות של שריר הזגוגית והריסים בפריפריה של הרשתית. העבירו מיד את הרשתית המבודדת לשקופית עם קצת PBS.
   הערה: ניתן להשתמש בכל טכניקה אחרת לבידוד רשתית בהתאם להעדפת החוקר.

6. הרכבה שטוחה של הרשתית

1. הניחו את הרשתית הלא קבועה על שקופית עם כמות קטנה של PBS. בעזרת המיקרו-מרית, כוונו בעדינות את הרשתית כשצד הזגוגית כלפי מעלה. אם הרשתית מקופלת פנימה, השתמש במיקרו-מלקחיים כדי להחזיק את שולי הרשתית בזמן שהרשתית נפרשת באמצעות המיקרו-מרית.
2. בצע 4-5 חתכים רדיאליים לתוך הרשתית כך שהיא תשכב שטוחה (דפוס עלי תלתן).
3. בעזרת טישו נטול מוך, יבש את עודפי PBS הרחק מהרשתית.
   הערה: אל תיגע ברשתית עם הרקמה; אחרת, הדגימה תאבד. החלקת כיסוי רצויה כדי לשמור על הרשתית שטוחה.

7. מיקרוסקופיה

הערה: ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם ערוץ GFP/FITC (480/530 ננומטר) לשלב זה. לצורך עבודה זו, השתמשנו במיקרוסקופ המוזכר עם 488 ערוצים ותוכנה נלווית לרכישת תמונה.

1. התבונן ברשתית שהורכבה לאחרונה מתחת למיקרוסקופ בהגדלה של פי 100 (אובייקטיבי פי 10) וספור לויקוציטים המסומנים באופן פלואורסצנטי (ידנית) על ידי סריקה שיטתית של כל הרקמה (מימין לשמאל או מלמעלה למטה).
   הערה: לויקוציטים הם נקודות פלואורסצנטיות בודדות שיכולות להציג צורה עגולה או אליפסה. קוטרם 12-15 מיקרומטר ואינם בולטים מנימי הרשתית (המבנה מוגבל לחלוטין על ידי לומן הכלי).
2. רכוש תמונות מייצגות עם ההגדלה הרצויה ובצע עיבוד לאחר התמונות עם התוכנה לבחירתך (למשל, ImageJ [פיג'י]).
3. בטא את הספירה כלויקוציטים לכל רשתית. גרף את הנתונים לפי ממוצע ± סטיית תקן.

תוצאות

פרוטוקול זלוף וצביעה מבוצע היטב יראה את כלי הדם השלמים ברשתית המתוחמים עם concanavalin A (איור 1). זלוף לקוי של העכבר מונע תיוג של עץ כלי הדם כולו וניתוח לאחר מכן של הלויקוציטים הנצמדים ללומן (איור 2), בעוד שלחץ מוגזם מלחיצה מהירה של מזרק (פחות מ-30-35 ...

Discussion

לויקוסטזיס בבני אדם מתייחס לתסמינים וממצאים קליניים הקשורים להיפרלויקוציטוזיס (ספירת לויקוציטים כוללת (WBCs) >100,000/μL) והיא מצב חירום רפואי²⁰. המנגנונים המובילים ללויקסטזיס נמצאים במחקר אינטנסיבי. נכון להיום, חקר הלויקוסטזיס בבני אדם in vivo עדיין אינו אפשרי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringe
4-way stopcock Luer lock I.V. line valve	Baxter	2C6204
Concanavalin A solution	Vector	FL-1001	Prepare in PBS 1 mg/mL
Dissecting tools set			Includes hemostats, scissors and forceps
FIJI			Software for image processing
Fluorescence microscope	Nikon	Eclipse Ni
Forceps, Dumont #5, Biological grade tip	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72700-D
Gavage Needle 1.25 mm OD barrel tip x 30 mm	Fine Science	18060-20
Halstead Mosquito Forceps	Fisher Scientific	13-812-10
I.V. Catheter set with regulating clamp 70 inches	Baxter	2C5417s
I.V. Pole
Lint free tissue			Kimpwipes is an option
Micro dissecting spring scissors, Vannas, 3 mm straight	ROBOZ	RS-5620
Micro spatula	Fine Science Tools (FST)	10091-12
Nikon		NIS-Elements (AR 5.30.03 64-bit)	Software for image acquisition
Petri dish (100 mmx15 mm)	Corning	351029
Phosphate buffered saline (PBS)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72670
Pressure infuser	Infusurge	4010
Razor blades, GEM single edge stainless steel, Teflon coated	Electron Microscopy Sciences (EMS)	71970
Saline 0.9%, veterinary grade, 1000 mL	Baxter	04925-04-10
Small dissecting scissors, curved blunt end 22 mm	ROBOZ	RS 5983