Quantificazione dei leucociti aderenti indotti dal diabete nella vascolarizzazione retinica

Riepilogo

Dimostriamo un metodo per marcare le pareti del sistema vascolare retinico e i leucociti aderenti. Questi leucociti aderenti possono quindi essere contati al microscopio a fluorescenza come parametro dell'infiammazione o della risposta di tale infiammazione alle terapie.

Abstract

La leucostasi si riferisce all'attaccamento dei leucociti alla parete luminale del sistema vascolare. Questa interazione dei leucociti con la parete dei vasi sanguigni è caratteristica dell'infiammazione ed è stata causalmente collegata all'occlusione capillare in una varietà di tessuti e malattie, tra cui la retinopatia diabetica.

La leucostasi è stata segnalata per anni come una complicanza pericolosa per la vita dell'iperleucocitosi e può essere diagnosticata solo clinicamente. Data l'importanza del fenomeno, è stata condotta un'intensa ricerca per comprendere i potenziali meccanismi che portano alla sua manifestazione; Tuttavia, non esiste una tecnica gold standard in laboratorio per visualizzare e quantificare la gravità dell'evento.

Nel metodo riassunto di seguito, il sistema vascolare viene inizialmente perfuso con un tampone per rimuovere il sangue, quindi la concanavalina A viene perfusa nel sistema vascolare dove si lega a tutte le pareti cellulari esposte e provoca una colorazione particolarmente brillante dei leucociti. Se la perfusione per rimuovere tutte le cellule del sangue non legate ha avuto successo, i restanti leucociti marcati in fluorescenza vengono legati al sistema vascolare e possono essere quantificati manualmente utilizzando qualsiasi microscopio a fluorescenza disponibile.

Introduzione

I leucociti (globuli bianchi, globuli bianchi) svolgono un ruolo importante nella funzione ottimale del sistema vascolare, come il mantenimento della fluidità del sangue e la regolazione della risoluzione del trombo¹. Svolgono anche un ruolo chiave in alcune condizioni patologiche, come l'adesione alla parete luminale del sistema vascolare per periodi di tempo prolungati che portano all'ostruzione dei vasi, almeno temporaneamente, fenomeno noto come leucostasi ^2,3.

La retinopatia diabetica è una delle complicanze più comuni del diabete a lungo termine e una delle principali cause di disabilità visiva e cecità negli Stati Uniti e nel mondo per gli individui^{di età compresa} tra 20 e 75 anni. La degenerazione lenta e progressiva del sistema vascolare retinico è una componente clinicamente significativa delle prime fasi della malattia, che in alcuni pazienti porta all'ischemia retinica con la conseguente neovascolarizzazione retinica ^5,6. L'evidenza cumulativa indica che l'infiammazione svolge un ruolo importante nello sviluppo della retinopatia⁷ e la leucostasi è considerata una risposta infiammatoria intravascolare subclinica. La leucostasi si verifica nelle prime fasi del diabete, ben prima che si siano sviluppate manifestazioni cliniche rilevabili ^8,9,10. L'ostruzione ripetuta dei vasi retinici da parte di leucociti aderenti per mesi o anni (leucostasi cronica) nel diabete potrebbe contribuire all'occlusione vascolare e alla degenerazione dei capillari 11,12,13. La gravità di questa leucostasi è di importanza patologica e può essere utilizzata per monitorare la gravità del processo patologico o per valutare l'efficacia di una terapia in contesti di ricerca.

Per studiare ulteriormente gli effetti specifici del microambiente iperglicemico sulla leucostasi, sono stati progettati modelli in vitro. Le cellule endoteliali microvascolari retiniche isolate possono essere coltivate e disposte in modelli di colture 2 o 3D (microvascolarizzazione su chip¹⁴) per replicare l'endotelio vascolare (il monostrato cellulare che pavimenta il lume dei vasi). Tuttavia, la variazione intersperimentale di questi modelli ne limita l'uso. Lo studio della leucostasi nel sistema vascolare retinico umano in vivo è ancora limitato e, pertanto, la maggior parte delle attuali conoscenze sulla leucostasi retinica deriva da modelli animali di retinopatia diabetica^13,15.

Lo scopo di questo rapporto è quello di descrivere un protocollo standard basato su metodi descritti altrove¹⁶ per la quantificazione dei leucociti attaccati al sistema vascolare retinico come parametro della leucostasi. Questo test può essere utilizzato per studiare altre malattie vascolari che presentano anche leucostasi, come i tumori maligni 3,17,18,19 e alcune condizioni infettive e allergiche²⁰. Questo protocollo può essere implementato in qualsiasi laboratorio di ricerca di base senza la necessità di attrezzature specializzate. Nel metodo riassunto di seguito, il sistema vascolare viene inizialmente perfuso con tampone per rimuovere il sangue, quindi la concanavalina A viene perfusa nel sistema vascolare dove si lega a tutte le pareti cellulari esposte e provoca una colorazione particolarmente brillante dei leucociti 21,22,23. Se la perfusione per rimuovere tutte le cellule del sangue non legate ha successo, i restanti leucociti marcati in fluorescenza che sono legati al sistema vascolare possono essere quantificati manualmente utilizzando qualsiasi microscopio a fluorescenza a portata di mano.

Protocollo

Il protocollo è stato esaminato e approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della California di Irvine ed è conforme alle normative governative relative alla cura e all'uso degli animali da laboratorio. Non ci sono punti di arresto in questo protocollo. Il tempo medio per mouse è di 30 minuti.

1. Preparazione della fase di perfusione

1. Riscaldare la sacca salina allo 0,9% e la soluzione di concanavalina A in un bagno d'acqua a 37 ^oC per 20-30 minuti prima dell'uso.
   NOTA: Proteggere la concanavalina A dall'esposizione alla luce (coprire con un foglio).
2. Predisporre un vassoio per contenere il sangue e i liquidi che non gocciolano sulla superficie dove si svolgerà la procedura. Sopra il vassoio, posizionare un termoforo coperto con un sottoforo assorbente o qualsiasi materiale assorbente.
   NOTA: L'obiettivo è evitare che il corpo del topo perda calore durante la procedura, perché il raffreddamento rende più difficile la rimozione del sangue durante la perfusione.

2. Impostazione dell'infusore a pressione

1. Collegare in serie la sacca di soluzione fisiologica allo 0,9%, il set di cateteri per flebo, un rubinetto di arresto della valvola a 4 vie e l'ago per la sonda magnetica.
2. Inserire la sacca di soluzione fisiologica allo 0,9% tra la rete e la camera d'aria dell'infusore a pressione. Appendere la sacca salina al gancio situato sul retro della camera d'aria. Utilizzare l'anello per asta per flebo per appendere l'infusore di pressione all'asta per flebo.
3. Spurgare le linee e le porte da tutte le bolle d'aria lasciando il sistema aperto (in funzione) per un paio di minuti e impostare la portata a 18-20 mL/min²⁴. Per gonfiare la camera d'aria dell'infusore di pressione, ruotare la maniglia del rubinetto in modo che punti verso lo sfiato del rubinetto aperto, quindi pompare il bulbo di gonfiaggio fino a quando il manometro indica la pressione desiderata. Regolare nuovamente la pressione prima di perfondere ciascun mouse. Per sgonfiare, ruotare la maniglia del rubinetto verso il basso verso il bulbo di gonfiaggio.
   NOTA: Se la sacca salina allo 0,9% è nuova, di solito una pressione di 150 mmHg fornisce la portata desiderata; Tuttavia, la pressione deve essere regolata empiricamente a causa delle variazioni nelle marche di infusori a pressione e durante il periodo di utilizzo della sacca salina allo 0,9%.
4. Collegare una siringa da 10 ml riempita con una soluzione riscaldata di concanavalina A alla valvola a 4 vie.
   NOTA: Proteggere la siringa dall'esposizione alla luce (coprire con un foglio).

3. Anestesia

1. Erogare l'anestesia mediante iniezione intraperitoneale (I.P.) di Ketamina: Xilazina; La dose più utilizzata per la chirurgia/procedura sui topi è 100:10 mg/kg di peso corporeo²⁵. Valutare l'anestesia con il riflesso del pedale (pizzicamento deciso delle dita).
   NOTA: Questa dose fornisce un inizio di 4-6 minuti con una durata di 45-60 minuti di anestesia chirurgica. Il cocktail anestetico può essere conservato a temperatura ambiente per un massimo di 2 settimane.

4. Perfusione transcardica e colorazione con concanavalina A

1. Posizionare il mouse sul tavolino di perfusione in posizione supina per consentire l'esposizione della cavità toracica e addominale.
2. Identifica visivamente il processo xifoideo e, con l'emostatico nella mano dominante, appunta la pelle e bloccala. Una volta fissato l'emostato, trasferirlo sulla mano non dominante e sollevare la pelle.
3. Usa le forbici nella mano dominante e taglia, con un angolo di 90° rispetto alla colonna vertebrale, una macchia di pelle per rivelare la parete addominale esterna.
4. Con il processo xifoideo e la gabbia toracica ora visibili, sezionare bilateralmente la parete addominale, facendo attenzione a evitare di tagliare organi o vasi principali.
5. Con il diaframma ora visibile, visualizza i ventricoli cardiaci e i polmoni attraverso il diaframma. Con la punta delle forbici, tagliare il diaframma in uno dei fianchi, vicino alla colonna vertebrale, facendo attenzione a non tagliare organi o vasi principali.
   NOTA: Questo "foro" nel diaframma bilancerà la pressione intratoracica negativa con la pressione atmosferica e si verificherà uno pneumotorace che farà collassare i polmoni e ritrarrà il cuore, facilitando la dissezione del diaframma senza danneggiare i polmoni o il cuore.
6. Continua a sezionare attraverso le costole e parallelamente ai polmoni per creare un "lembo" toracico. Rilasciare l'emostatico e tagliare il processo xifoideo nel piano sagittale. Spalancare delicatamente il processo xifoideo manualmente. Osservate le quattro camere del cuore.
7. Con la mano non dominante e usando il forcipe, afferra il cuore vicino al suo apice. Con la mano dominante, tenere l'ago della sonda gastrica (attaccato al catetere endovenoso) e perforare l'apice del cuore. Per evitare la perforazione completa del ventricolo sinistro o il raggiungimento della vascolarizzazione polmonare e quindi la scarsa perfusione della vascolarizzazione sistemica, controllare il posizionamento dell'estremità della punta sferica dell'ago della sonda gastrica, che dovrebbe trovarsi sul bordo del sito di puntura leggermente sporgente dal cuore. Bloccare l'ago della sonda in posizione utilizzando una pinza per zanzare curva o semplicemente tenerlo a mano mentre si manipola il rubinetto per flebo.
8. Aprire il rubinetto allo 0,9% di soluzione salina e, quasi contemporaneamente, tagliare il ventricolo destro con le forbici; perfondere per 2-3 min. Durante il tempo di perfusione, muovere delicatamente l'ago da un lato all'altro e su e giù per ridurre l'attorcigliamento del sistema vascolare e aumentare l'uscita del sangue dal cuore.
9. Dopo la perfusione con soluzione fisiologica, ruotare la maniglia del rubinetto per interrompere il flusso dalla soluzione fisiologica e consentire il flusso dalla siringa all'ago della sonda magnetica. Perfondere a mano con la soluzione di concanavalina A a una velocità di stato stazionario. Assicurarsi che i 10 mL di soluzione di concanavalina A vengano erogati in 30-35 s.
10. Dopo la perfusione con concanavalina A, ruotare la valvola per interrompere il flusso dalla siringa e consentire nuovamente il flusso dalla soluzione fisiologica allo 0,9% all'ago della sonda gastrica. Versare con la soluzione salina allo 0,9% per altri 2-3 minuti. Rimuovere l'ago della sonda gastrica dal cuore.
    NOTA: La concanavalina A suggerita in questo protocollo è coniugata alla fluoresceina (verde); tuttavia, è disponibile anche la concanavalina A attaccata ad altri fluorocromi.

5. Enucleazione e isolamento della retina fresca

1. Gira il mouse su un lato e, usando la mano non dominante, posiziona l'indice e il pollice rispettivamente sulle palpebre superiori e inferiori. Ritrarre delicatamente le palpebre e la pelle con le dita e proptodare l'occhio, facendolo sporgere parzialmente dall'orbita.
2. Mentre l'occhio è inclinato, usa le forbici curve nella mano dominante e raccogli sotto l'occhio con un angolo di 45°. Taglia l'attacco muscolare e il nervo ottico. Usando le stesse forbici di una spatola, trasferire l'occhio in un piccolo contenitore o direttamente sul tavolino del microscopio da dissezione.
   NOTA: Fare attenzione a non tagliare la parte posteriore dell'occhio ed evitare di tirare l'occhio durante questo passaggio.
3. Posiziona l'occhio su una cera dentale per aprire il globo. Al microscopio da dissezione e utilizzando la mano non dominante, tenere la piega sclerale o i resti muscolari ancora attaccati esternamente all'occhio posteriore con una micro-pinza e orientare l'occhio in modo che la cornea sia rivolta di lato.
   NOTA: Per evitare che l'occhio si muova/scivoli durante l'apertura del globo, è possibile posizionare un pezzo di tessuto bagnato e privo di lanugine sopra la cera dentale.
4. Con uno degli angoli acuti di una lametta rivestita in teflon, praticare un'incisione 1-2 mm dietro e parallela al limbus (giunzione cornea-sclera). Tenere la piega sclerale o il muscolo con le micro-pinze e tirare la lama attraverso il limbus con una forza minima verso il basso. Continua a tagliare con il rasoio per separare totalmente il segmento anteriore (cornea, iride, cristallino e vitreo) dal segmento posteriore (conchiglia oculare).
   NOTA: Non segare avanti e indietro.
5. Trasferire l'oculare diviso in due in una piccola capsula di Petri con PBS.
   NOTA: Evitare il contatto della retina con la carta velina (nota al punto 5.3) poiché si attaccherà saldamente alla carta e diventerà essenzialmente impossibile da recuperare.
6. Afferra una piega sclerale o il muscolo rimanente all'esterno della sclera con una micro-pinza. Staccare completamente la retina dalla sclera rompendo tutte le connessioni al limbus attorno al perimetro della conchiglia oculare utilizzando una microspatola. Estrarre la retina dalla sclera con la microspatola. Se la retina è ancora attaccata alla sclera dal nervo ottico, infilare le microforbici tra la retina e la sclera per tagliare il nervo ottico.
7. Rimuovere eventuali residui di muscolo vitreo e ciliare nella periferia della retina. Trasferire immediatamente la retina isolata su un vetrino con un po' di PBS.
   NOTA: Qualsiasi altra tecnica di isolamento della retina può essere utilizzata a seconda delle preferenze del ricercatore.

6. Montaggio piatto della retina

1. Stendere la retina non fissata su un vetrino con una piccola quantità di PBS. Utilizzando la microspatola, orientare delicatamente la retina con il lato vitreo rivolto verso l'alto. Se la retina è piegata verso l'interno, usa una micro-pinza per tenere i bordi della retina mentre la retina viene aperta usando la micro-spatola.
2. Fai 4-5 tagli radiali nella retina in modo che sia piatta (motivo a quadrifoglio).
3. Utilizzando un fazzoletto privo di lanugine, asciugare l'eccesso di PBS lontano dalla retina.
   NOTA: Non toccare la retina con il tessuto; In caso contrario, il campione andrà perso. Il vetrino coprioggetto è auspicabile per mantenere la retina piatta.

7. Microscopia

NOTA: Per questo passaggio è possibile utilizzare qualsiasi microscopio a fluorescenza con canale GFP/FITC (480/530 nm). Per questo lavoro, abbiamo utilizzato il microscopio di riferimento con 488 canali e il relativo software per l'acquisizione delle immagini.

1. Osservare la retina montata di recente al microscopio con un ingrandimento di 100x (obiettivo 10x) e contare i leucociti marcati in fluorescenza (manualmente) scansionando metodicamente l'intero tessuto (da destra a sinistra o dall'alto verso il basso).
   NOTA: I leucociti sono singoli punti fluorescenti che possono mostrare una forma rotonda o ovale. Hanno un diametro di 12-15 μm e non sporgono dai capillari retinici (la struttura è completamente vincolata dal lume del vaso).
2. Acquisire immagini rappresentative con l'ingrandimento desiderato ed eseguire la post-elaborazione delle immagini con il software scelto (ad esempio, ImageJ [Fiji]).
3. Esprimere la conta in leucociti per retina. Rappresentare graficamente i dati in base alla media ± alla deviazione standard.

Risultati

Un protocollo di perfusione e colorazione ben eseguito mostrerà la vascolarizzazione retinica completa delineata con la concanavalina A (Figura 1). La scarsa perfusione del topo impedisce la marcatura dell'intero albero vascolare e la successiva analisi dei leucociti aderenti al lume (Figura 2), mentre un'eccessiva pressione dovuta a una rapida compressione di una siringa (inferiore a 30-35 s) può causare permeabilità vascola...

Discussione

La leucostasi nell'uomo si riferisce ai sintomi e ai risultati clinici associati all'iperleucocitosi (conta totale dei leucociti (WBC) >100.000/μL) ed è un'emergenza medica²⁰. I meccanismi che portano alla leucostasi sono oggetto di intensa ricerca. Ad oggi, lo studio della leucostasi nell'uomo in vivo non è ancora possibile e i ricercatori devono fare affidamento su modelli animali per comprendere questo processo. Diverse malattie presentano leucostas...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringe
4-way stopcock Luer lock I.V. line valve	Baxter	2C6204
Concanavalin A solution	Vector	FL-1001	Prepare in PBS 1 mg/mL
Dissecting tools set			Includes hemostats, scissors and forceps
FIJI			Software for image processing
Fluorescence microscope	Nikon	Eclipse Ni
Forceps, Dumont #5, Biological grade tip	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72700-D
Gavage Needle 1.25 mm OD barrel tip x 30 mm	Fine Science	18060-20
Halstead Mosquito Forceps	Fisher Scientific	13-812-10
I.V. Catheter set with regulating clamp 70 inches	Baxter	2C5417s
I.V. Pole
Lint free tissue			Kimpwipes is an option
Micro dissecting spring scissors, Vannas, 3 mm straight	ROBOZ	RS-5620
Micro spatula	Fine Science Tools (FST)	10091-12
Nikon		NIS-Elements (AR 5.30.03 64-bit)	Software for image acquisition
Petri dish (100 mmx15 mm)	Corning	351029
Phosphate buffered saline (PBS)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72670
Pressure infuser	Infusurge	4010
Razor blades, GEM single edge stainless steel, Teflon coated	Electron Microscopy Sciences (EMS)	71970
Saline 0.9%, veterinary grade, 1000 mL	Baxter	04925-04-10
Small dissecting scissors, curved blunt end 22 mm	ROBOZ	RS 5983