Quantification des leucocytes adhérents induits par le diabète dans le système vasculaire rétinien

Résumé

Nous démontrons une méthode pour marquer les parois du système vasculaire rétinien et des leucocytes adhérents. Ces leucocytes adhérents peuvent ensuite être comptés au microscope à fluorescence comme un paramètre de l’inflammation ou de la réponse de cette inflammation aux thérapies.

Résumé

La leucostasie fait référence à la fixation des leucocytes à la paroi luminale du système vasculaire. Cette interaction des leucocytes avec la paroi des vaisseaux sanguins est caractéristique de l’inflammation et a été liée de manière causale à l’occlusion capillaire dans une variété de tissus et de maladies, y compris la rétinopathie diabétique.

La leucostase est signalée depuis des années comme une complication potentiellement mortelle de l’hyperleucocytose et ne peut être diagnostiquée que cliniquement. Compte tenu de l’importance du phénomène, des recherches intensives ont été menées pour comprendre le(s) mécanisme(s) potentiel(s) qui conduisent à sa manifestation ; Cependant, il n’existe pas de technique de référence en laboratoire pour visualiser et quantifier la gravité de l’événement.

Dans la méthode résumée ci-dessous, le système vasculaire est d’abord perfusé avec un tampon pour éliminer le sang, puis la concanavaline A est perfusée dans le système vasculaire où elle se lie à toutes les parois cellulaires exposées et provoque une coloration particulièrement brillante des leucocytes. Si la perfusion pour éliminer toutes les cellules sanguines non liées a réussi, les leucocytes restants marqués par fluorescence sont liés au système vasculaire et ils peuvent être quantifiés manuellement à l’aide de n’importe quel microscope à fluorescence disponible.

Introduction

Les leucocytes (globules blancs, GB) jouent un rôle important dans le fonctionnement optimal du système vasculaire, comme le maintien de la fluidité sanguine et la régulation de la résolution du thrombus¹. Ils jouent également un rôle clé dans certaines conditions pathologiques, telles que l’adhérence à la paroi luminale du système vasculaire pendant de longues périodes, entraînant une obstruction des vaisseaux, au moins temporairement, un phénomène connu sous le nom de leucostase ^2,3.

La rétinopathie diabétique est l’une des complications les plus courantes du diabète à long terme et l’une des principales causes de déficience visuelle et de cécité aux États-Unis et dans le monde entier chez les personnes âgées de 20 à 75^{ans 4}. La dégénérescence lente et progressive du système vasculaire rétinien est une composante cliniquement significative des premiers stades de la maladie, qui chez certains patients conduit à une ischémie rétinienne avec la néovascularisation rétinienne qui en résulte ^5,6. Les preuves cumulatives indiquent que l’inflammation joue un rôle important dans le développement de la rétinopathie⁷, et la leucostase est considérée comme une réponse inflammatoire intravasculaire subclinique. La leucostase survient aux premiers stades du diabète, bien avant que des manifestations cliniques détectables^{ne se soient} développées8,9,10. L’obstruction répétée des vaisseaux rétiniens par les leucocytes adhérents pendant des mois ou des années (leucostase chronique) dans le diabète pourrait contribuer à l’occlusion vasculaire et à la dégénérescence des capillaires 11,12,13. La gravité de cette leucostase a une signification pathologique et peut être utilisée pour surveiller la gravité du processus pathologique ou pour évaluer l’efficacité d’un traitement dans le cadre de la recherche.

Pour étudier plus en détail les effets spécifiques du microenvironnement hyperglycémique sur la leucostase, des modèles in vitro ont été conçus. Des cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes isolées peuvent être cultivées et disposées dans des modèles de cultures 2D ou 3D (microvascularisation sur puce¹⁴) pour répliquer l’endothélium vasculaire (la monocouche cellulaire qui pave la lumière des vaisseaux). Cependant, la variation interexpérimentale de ces modèles limite leur utilisation. L’étude de la leucostase dans le système vasculaire rétinien humain in vivo est encore limitée et, par conséquent, la plupart des connaissances actuelles sur la leucostase rétinienne proviennent de modèles animaux de rétinopathie diabétique^13,15.

L’objectif de ce rapport est de décrire un protocole standard basé sur les méthodes décrites ailleurs¹⁶ pour la quantification des leucocytes attachés au système vasculaire rétinien en tant que paramètre de la leucostase. Ce test peut être utilisé pour étudier d’autres maladies vasculaires qui présentent également une leucostase, telles que les tumeurs malignes 3,17,18,19 et certaines affections infectieuses et allergiques²⁰. Ce protocole peut être mis en œuvre dans n’importe quel laboratoire de recherche fondamentale sans avoir besoin d’équipement spécialisé. Dans la méthode résumée ci-dessous, le système vasculaire est d’abord perfusé avec un tampon pour éliminer le sang, puis la concanavaline A est perfusée dans le système vasculaire où elle se lie à toutes les parois cellulaires exposées et provoque une coloration particulièrement brillante des leucocytes 21,22,23. Si la perfusion pour éliminer toutes les cellules sanguines non liées réussit, les leucocytes restants marqués par fluorescence qui sont liés au système vasculaire peuvent être quantifiés manuellement à l’aide de n’importe quel microscope à fluorescence disponible.

Protocole

Le protocole a été examiné et approuvé par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Californie à Irvine et est conforme aux réglementations gouvernementales concernant le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Il n’y a pas de points d’arrêt dans ce protocole. Le temps moyen par souris est de 30 min.

1. Préparation de l’étape de perfusion

1. Réchauffer le sachet de solution saline à 0,9 % et la solution de concanavalin A dans un bain-marie à 37 °C pendant 20 ^à30 minutes avant utilisation.
   REMARQUE : Protégez le concanavalin A de l’exposition à la lumière (couvrez avec une feuille d’aluminium).
2. Installez un plateau pour contenir le sang et les liquides qui coulent sur la surface où la procédure aura lieu. Sur le dessus du plateau, placez un coussin chauffant recouvert d’un sous-coussin absorbant ou de tout autre matériau absorbant.
   REMARQUE : L’objectif est d’éviter que le corps de la souris ne perde de la chaleur pendant la procédure, car le refroidissement rend plus difficile l’élimination du sang pendant la perfusion.

2. Configuration de l’infuseur à pression

1. Connectez en série le sac de solution saline à 0,9 %, le kit de cathéter IV, un robinet d’arrêt de valve à 4 voies et l’aiguille de gavage.
2. Insérez le sac de solution saline à 0,9 % entre le filet et la vessie d’air de l’infuseur de pression. Accrochez le sac salin au crochet situé à l’arrière de la vessie d’air. Utilisez la boucle de la perche IV pour accrocher l’infuseur de pression dans la perche IV.
3. Purgez les conduites et les orifices de toutes les bulles d’air en laissant le système s’ouvrir (fonctionner) pendant quelques minutes et réglez le débit à 18-20 ml/min²⁴. Pour gonfler la vessie d’air de l’infuseur de pression, tournez la poignée du robinet d’arrêt vers l’évent du robinet d’arrêt ouvert, puis pompez la poire de gonflage jusqu’à ce que le manomètre indique la pression souhaitée. Réajustez la pression avant de perfuser chaque souris. Pour dégonfler, tournez la poignée du robinet d’arrêt vers le bas vers l’ampoule de gonflage.
   REMARQUE : Si le sac de solution saline à 0,9 % est neuf, une pression généralement de 150 mmHg fournit le débit souhaité ; Cependant, la pression doit être ajustée empiriquement en raison des variations entre les marques d’infuseurs de pression et sur la période d’utilisation du sac de solution saline à 0,9 %.
4. Fixez une seringue de 10 mL remplie d’une solution de concanavaline A réchauffée à la valve à 4 voies.
   REMARQUE : Protégez la seringue de l’exposition à la lumière (couvrez d’une feuille d’aluminium).

3. Anesthésie

1. Administrer l’anesthésie par injection intrapéritonéale (I.P.) de kétamine :xylazine ; La dose la plus largement utilisée pour la chirurgie/procédure de souris est de 100:10 mg/kg de poids corporel²⁵. Évaluer l’anesthésie par réflexe de pédale (pincement ferme de l’orteil).
   REMARQUE : Cette dose fournit un début de 4 à 6 minutes avec une durée de 45 à 60 minutes d’anesthésie chirurgicale. Le cocktail anesthésique peut être conservé à température ambiante pendant un maximum de 2 semaines.

4. Perfusion transcardique et coloration à la concanavaline A

1. Placez la souris sur la platine de perfusion en position couchée pour permettre l’exposition de la cavité thoracique et abdominale.
2. Identifiez visuellement le processus xiphoïde et, avec l’hémostat dans la main dominante, épinglez la peau et verrouillez-la. Une fois l’hémostat fixé, transférez-le dans la main non dominante et soulevez la peau.
3. Utilisez des ciseaux dans la main dominante et coupez, à un angle de 90° par rapport à la colonne vertébrale, une partie de la peau pour révéler la paroi abdominale externe.
4. Avec l’apophyse xiphoïde et la cage thoracique maintenant visibles, disséquez la paroi abdominale bilatéralement, en prenant soin d’éviter de couper des organes ou des vaisseaux majeurs.
5. Avec le diaphragme maintenant visible, visualisez les ventricules cardiaques et les poumons à travers le diaphragme. À l’aide de la pointe des ciseaux, coupez à travers le diaphragme dans l’un des flancs, près de la colonne vertébrale, en prenant soin d’éviter de couper des organes ou des vaisseaux majeurs.
   REMARQUE : Ce « trou » dans le diaphragme équilibrera la pression intrathoracique négative avec la pression atmosphérique, et un pneumothorax se produira qui effondrera les poumons et rétractera le cœur, facilitant la dissection du diaphragme sans endommager les poumons ou le cœur.
6. Continuez à disséquer à travers les côtes et parallèlement aux poumons pour créer un « lambeau » thoracique. Libérez l’hémostat et coupez le processus xiphoïde dans le plan sagittal. Ouvrez doucement le processus xiphoid manuellement. Observez les quatre cavités du cœur.
7. Avec la main non dominante et à l’aide d’une pince, saisissez le cœur près de son sommet. Avec la main dominante, tenez l’aiguille de gavage (attachée au cathéter IV) et perforez l’apex du cœur. Pour éviter une perforation complète du ventricule gauche ou l’atteinte du système vasculaire pulmonaire puis une mauvaise perfusion du système vasculaire, vérifiez l’emplacement de l’extrémité de l’extrémité de la pointe de la boule de l’aiguille du gavage, qui doit se trouver au bord du site de ponction légèrement en saillie du cœur. Fixez l’aiguille de gavage en place à l’aide d’une pince à moustiques incurvée ou tenez-la simplement à la main tout en manipulant le robinet d’arrêt intraveineux.
8. Ouvrez le robinet d’arrêt à la solution saline à 0,9 % et presque simultanément, ouvrez le ventricule droit avec des ciseaux ; perfuser pendant 2-3 min. Pendant le temps de perfusion, déplacez doucement l’aiguille d’un côté à l’autre et de haut en bas pour réduire le pliage du système vasculaire et augmenter la sortie du sang du cœur.
9. Après avoir perfusé avec du sérum physiologique, tournez la poignée du robinet d’arrêt pour couper l’écoulement de la solution saline et permettre l’écoulement de la seringue vers l’aiguille du gavage. Perfuser à la main avec le concanavalin Une solution à un taux d’équilibre. S’assurer que les 10 mL de solution de concanavalin A sont distribués en 30 à 35 s.
10. Après avoir perfusé avec la concanavaline A, tournez la valve pour couper l’écoulement de la seringue et permettre à nouveau l’écoulement de la solution saline à 0,9 % vers l’aiguille du gavage. Perfuser avec la solution saline à 0,9 % pendant 2 à 3 minutes supplémentaires. Retirez l’aiguille de gavage du cœur.
    REMARQUE : La concanavaline A suggérée dans ce protocole est conjuguée à la fluorescéine (vert) ; cependant, le concanavalin A attaché à d’autres fluorochromes est également disponible.

5. Énucléation et isolement de la rétine fraîche

1. Tournez la souris sur le côté et, à l’aide de la main non dominante, placez l’index et le pouce sur les paupières supérieure et inférieure, respectivement. Rétractez doucement les paupières et la peau avec les doigts et étalez l’œil, le faisant partiellement gonfler hors de l’orbite.
2. Lorsque l’œil est allongé, utilisez des ciseaux incurvés dans la main dominante et ramassez-le sous l’œil à un angle de 45°. Coupez l’attache musculaire et le nerf optique. À l’aide des mêmes ciseaux qu’une spatule, transférez l’œil dans un petit récipient ou directement sur la platine du microscope de dissection.
   REMARQUE : Veillez à ne pas couper l’arrière de l’œil et évitez de tirer l’œil pendant cette étape.
3. Placez l’œil sur une cire dentaire pour ouvrir le globe. Sous le microscope de dissection et à l’aide de la main non dominante, tenez le pli scléral ou les restes musculaires encore attachés à l’extérieur de l’œil postérieur à l’aide d’une micro-pince, et orientez l’œil de manière à ce que la cornée soit tournée vers le côté.
   REMARQUE : Pour empêcher l’œil de bouger/glisser lors de l’ouverture du globe, un morceau de tissu humide non pelucheux peut être placé sur la cire dentaire.
4. Avec l’un des coins tranchants d’une lame de rasoir recouverte de téflon, faites une incision de 1 à 2 mm derrière et parallèlement au limbe (jonction cornée-sclérotique). Tenez le pli scléral ou le muscle à l’aide de la micro-pince et tirez la lame sur le limbe avec une force minimale vers le bas. Continuez à couper avec le rasoir pour séparer totalement le segment antérieur (cornée, iris, cristallin et vitré) du segment postérieur (œilleton).
   REMARQUE : Ne sciez pas d’avant en arrière.
5. Transférez l’œilleton coupé en deux dans une petite boîte de Pétri avec du PBS.
   REMARQUE : Évitez tout contact de la rétine avec le papier de soie (note à l’étape 5.3) car il collera étroitement au papier et deviendra essentiellement impossible à récupérer.
6. Saisissez un pli scléral ou le muscle restant à l’extérieur de la sclérotique à l’aide d’une micro-pince. Détachez complètement la rétine de la sclérotique en brisant toutes les connexions au niveau du limbe autour du périmètre de l’œilleton à l’aide d’une micro-spatule. Prélevez la rétine de la sclérotique à l’aide de la micro-spatule. Si la rétine est toujours attachée à la sclérotique par le nerf optique, glissez les micro-ciseaux entre la rétine et la sclérotique pour couper le nerf optique.
7. Retirez tous les restes de muscle vitré et ciliaire à la périphérie de la rétine. Transférez immédiatement la rétine isolée sur une lame avec un peu de PBS.
   REMARQUE : Toute autre technique d’isolement de la rétine peut être utilisée selon la préférence du chercheur.

6. Montage à plat de la rétine

1. Disposez la rétine non fixée sur une lame avec une petite quantité de PBS. À l’aide de la micro-spatule, orientez doucement la rétine avec le côté vitré vers le haut. Si la rétine est repliée vers l’intérieur, utilisez une micro-pince pour maintenir les bords de la rétine pendant que la rétine est dépliée à l’aide de la micro-spatule.
2. Faites 4 à 5 coupes radiales dans la rétine pour qu’elle soit à plat (motif trèfle).
3. À l’aide d’un mouchoir non pelucheux, séchez l’excès de PBS loin de la rétine.
   REMARQUE : Ne touchez pas la rétine avec le tissu ; Sinon, l’échantillon sera perdu. Le lamelle est souhaitable pour maintenir la rétine plate.

7. Microscopie

REMARQUE : Tout microscope à fluorescence doté d’un canal GFP/FITC (480/530 nm) peut être utilisé pour cette étape. Pour ce travail, nous avons utilisé le microscope référencé à 488 canaux et le logiciel associé pour l’acquisition d’images.

1. Observez la rétine récemment montée à plat au microscope à un grossissement de 100x (objectif 10x) et comptez les leucocytes marqués par fluorescence (manuellement) en balayant méthodiquement l’ensemble du tissu (de droite à gauche ou de haut en bas).
   REMARQUE : Les leucocytes sont des points fluorescents simples qui peuvent afficher une forme ronde ou ovale. Ils ont un diamètre de 12 à 15 m et ne dépassent pas des capillaires rétiniens (la structure est complètement contrainte par la lumière du vaisseau).
2. Acquérez des images représentatives avec le grossissement souhaité et effectuez le post-traitement des images avec le logiciel de votre choix (par exemple, ImageJ [Fidji]).
3. Exprimez le nombre de leucocytes par rétine. Représenter graphiquement les données par moyenne ± écart-type.

Résultats

Un protocole de perfusion et de coloration bien exécuté montrera la vasculature rétinienne complète délimitée par la concanavaline A (Figure 1). Une mauvaise perfusion de la souris empêche le marquage de l’ensemble de l’arbre vasculaire et l’analyse ultérieure des leucocytes adhérents à la lumière (Figure 2), tandis qu’une pression excessive due à une pression rapide d’une seringue (moins de 30-35 s) peut p...

Discussion

La leucostasie chez l’homme fait référence aux symptômes et aux signes cliniques associés à l’hyperleucocytose (nombre total de leucocytes (GB) >100 000/μL) et constitue une urgence médicale²⁰. Le ou les mécanismes qui conduisent à la leucostase font l’objet de recherches intensives. À ce jour, l’étude de la leucostase chez l’homme in vivo n’est pas encore possible et les chercheurs doivent s’appuyer sur des modèles animaux pour ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringe
4-way stopcock Luer lock I.V. line valve	Baxter	2C6204
Concanavalin A solution	Vector	FL-1001	Prepare in PBS 1 mg/mL
Dissecting tools set			Includes hemostats, scissors and forceps
FIJI			Software for image processing
Fluorescence microscope	Nikon	Eclipse Ni
Forceps, Dumont #5, Biological grade tip	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72700-D
Gavage Needle 1.25 mm OD barrel tip x 30 mm	Fine Science	18060-20
Halstead Mosquito Forceps	Fisher Scientific	13-812-10
I.V. Catheter set with regulating clamp 70 inches	Baxter	2C5417s
I.V. Pole
Lint free tissue			Kimpwipes is an option
Micro dissecting spring scissors, Vannas, 3 mm straight	ROBOZ	RS-5620
Micro spatula	Fine Science Tools (FST)	10091-12
Nikon		NIS-Elements (AR 5.30.03 64-bit)	Software for image acquisition
Petri dish (100 mmx15 mm)	Corning	351029
Phosphate buffered saline (PBS)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72670
Pressure infuser	Infusurge	4010
Razor blades, GEM single edge stainless steel, Teflon coated	Electron Microscopy Sciences (EMS)	71970
Saline 0.9%, veterinary grade, 1000 mL	Baxter	04925-04-10
Small dissecting scissors, curved blunt end 22 mm	ROBOZ	RS 5983