Quantifizierung von Diabetes-induzierten adhärenten Leukozyten im retinalen Gefäßsystem

Zusammenfassung

Wir demonstrieren eine Methode, um die Wände des retinalen Gefäßsystems und der adhärenten Leukozyten zu markieren. Diese adhärenten Leukozyten können dann unter einem Fluoreszenzmikroskop als Parameter der Entzündung oder der Reaktion dieser Entzündung auf Therapien gezählt werden.

Zusammenfassung

Unter Leukostase versteht man die Anheftung von Leukozyten an die luminale Wand des Gefäßsystems. Diese Wechselwirkung von Leukozyten mit der Wand der Blutgefäße ist charakteristisch für Entzündungen und wurde ursächlich mit dem Kapillarverschluss in einer Vielzahl von Geweben und Krankheiten, einschließlich der diabetischen Retinopathie, in Verbindung gebracht.

Die Leukostase wird seit Jahren als lebensbedrohliche Komplikation der Hyperleukozytose berichtet und kann nur klinisch diagnostiziert werden. Angesichts der Bedeutung des Phänomens wurden intensive Forschungen durchgeführt, um die möglichen Mechanismen zu verstehen, die zu seiner Manifestation führen. Es gibt jedoch keine Goldstandard-Technik im Labor, um die Schwere des Ereignisses zu visualisieren und zu quantifizieren.

Bei der unten zusammengefassten Methode wird das Gefäßsystem zunächst mit einem Puffer zur Blutentnahme perfundiert, und dann wird Concanavalin A in das Gefäßsystem perfundiert, wo es an alle freiliegenden Zellwände bindet und eine besonders helle Färbung der Leukozyten verursacht. Wenn die Perfusion zur Entfernung aller ungebundenen Blutzellen erfolgreich war, werden die verbleibenden fluoreszenzmarkierten Leukozyten an das Gefäßsystem gebunden und können mit jedem verfügbaren Fluoreszenzmikroskop manuell quantifiziert werden.

Einleitung

Leukozyten (weiße Blutkörperchen, Leukozyten) spielen eine wichtige Rolle bei der optimalen Funktion des Gefäßsystems, wie z. B. der Aufrechterhaltung der Blutfluidität und der Regulierung der Thrombusauflösung¹. Sie spielen auch eine Schlüsselrolle bei einigen pathologischen Zuständen, wie z. B. dem Anhaften an der luminalen Wand des Gefäßsystems über längere Zeiträume, was zumindest vorübergehend zu einer Gefäßobstruktion führt, ein Phänomen, das als Leukostase bekannt ist ^2,3.

Die diabetische Retinopathie ist eine der häufigsten Komplikationen bei Langzeitdiabetes und eine der Hauptursachen für Sehbehinderung und Blindheit in den USA und weltweit bei Personen im Alter von 20 bis 75 Jahren⁴. Die langsame und fortschreitende Degeneration der retinalen Gefäße ist ein klinisch bedeutsamer Bestandteil der Frühstadien der Erkrankung, der bei einigen Patienten zu einer retinalen Ischämie mit der daraus resultierenden retinalen Neovaskularisation führt ^5,6. Kumulative Beweise deuten darauf hin, dass Entzündungen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der Retinopathie spielen⁷, und Leukostase wird als subklinische intravaskuläre Entzündungsreaktion angesehen. Leukostase tritt in den frühen Stadien des Diabetes auf, lange bevor sich nachweisbare klinische Manifestationen entwickelt haben ^8,9,10. Das wiederholte Verstopfen der retinalen Gefäße durch adhärente Leukozyten über Monate bis Jahre (chronische Leukostase) bei Diabetes könnte zum Gefäßverschluss und zur Degeneration der Kapillaren beitragen 11,12,13. Der Schweregrad dieser Leukostase ist von pathologischer Bedeutung und kann zur Überwachung der Schwere des Krankheitsprozesses oder zur Bewertung der Wirksamkeit einer Therapie in Forschungsumgebungen verwendet werden.

Um die spezifischen Auswirkungen der hyperglykämischen Mikroumgebung auf die Leukostase weiter zu untersuchen, wurden in vitro Modelle entwickelt. Isolierte retinale mikrovaskuläre Endothelzellen können gezüchtet und entweder in 2- oder 3-D-Kulturmodellen (Mikrovaskulatur-on-a-Chip¹⁴) angeordnet werden, um das vaskuläre Endothel (die Zellmonoschicht, die das Lumen der Gefäße pflastert) zu replizieren. Die interexperimentelle Variation dieser Modelle schränkt jedoch ihre Verwendung ein. Die Untersuchung der Leukostase im menschlichen retinalen Gefäßsystem in vivo ist noch begrenzt, und daher stammt der größte Teil des aktuellen Wissens über die retinale Leukostase aus Tiermodellen der diabetischen Retinopathie^13,15.

Das Ziel dieses Berichts ist es, ein Standardprotokoll zu beschreiben, das auf Methoden basiert, die an anderer Stelle¹⁶ beschrieben sind, zur Quantifizierung von an das retinale Gefäßsystem gebundenen Leukozyten als Parameter der Leukostase. Dieser Assay kann verwendet werden, um andere Gefäßerkrankungen zu untersuchen, die ebenfalls Leukostase aufweisen, wie z. B. Malignome 3,17,18,19 und einige infektiöse und allergische Erkrankungen ²⁰. Dieses Protokoll kann in jedem Grundlagenforschungslabor implementiert werden, ohne dass spezielle Geräte erforderlich sind. Bei der unten zusammengefassten Methode wird das Gefäßsystem zunächst mit Puffer durchblutet, um Blut zu entfernen, und dann wird Concanavalin A in das Gefäßsystem perfundiert, wo es an alle freiliegenden Zellwände bindet und eine besonders helle Färbung der Leukozyten bewirkt 21,22,23. Gelingt die Perfusion, um alle ungebundenen Blutzellen zu entfernen, können die verbleibenden fluoreszenzmarkierten Leukozyten, die an das Gefäßsystem gebunden sind, mit jedem vorhandenen Fluoreszenzmikroskop manuell quantifiziert werden.

Protokoll

Das Protokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of California Irvine geprüft und genehmigt und entspricht den staatlichen Vorschriften bezüglich der Pflege und Verwendung von Labortieren. In diesem Protokoll gibt es keine Stopppunkte. Die durchschnittliche Zeit pro Maus beträgt 30 Minuten.

1. Vorbereitung der Perfusionsphase

1. Erwärmen Sie den 0,9%igen Kochsalzbeutel und die Concanavallin A-Lösung in einem 37 ^°C warmen Wasserbad für 20-30 Minuten, bevor Sie es verwenden.
   HINWEIS: Concanavalin A vor Lichteinwirkung schützen (mit Folie abdecken).
2. Stellen Sie eine Schale auf, in der Blut und Flüssigkeiten nicht auf die Oberfläche tropfen, an der der Eingriff stattfinden soll. Legen Sie ein Heizkissen auf das Tablett, das mit einer saugfähigen Bankunterlage oder einem anderen saugfähigen Material bedeckt ist.
   HINWEIS: Ziel ist es, zu vermeiden, dass der Körper der Maus während des Eingriffs Wärme verliert, da die Kühlung die Blutentfernung während der Perfusion erschwert.

2. Einrichten des Drucksiebs

1. Verbinden Sie den Beutel mit 0,9 % Kochsalzlösung, das IV-Katheterset, einen 4-Wege-Ventilhahn und die Sondennadel in Reihe.
2. Führen Sie den 0,9%igen Kochsalzbeutel zwischen das Netz und die Luftblase des Drucksiebs ein. Hängen Sie den Kochsalzbeutel an den Haken auf der Rückseite der Luftblase. Verwenden Sie die I.V.-Polschlaufe, um den Druckinfuser in den IV-Pol einzuhängen.
3. Spülen Sie die Leitungen und Anschlüsse von allen Luftblasen, indem Sie das System einige Minuten lang öffnen (laufen) lassen und die Durchflussrate auf 18-20 ml/min²⁴ einstellen. Um die Druckluftblase des Druckhahns aufzublasen, drehen Sie den Absperrhahngriff in Richtung der geöffneten Absperrhahnentlüftung und pumpen Sie dann den Aufblaskolben, bis das Manometer den gewünschten Druck anzeigt. Stellen Sie den Druck vor der Perfusion jeder Maus neu ein. Drehen Sie zum Entleeren den Absperrhahngriff gerade nach unten in Richtung der Aufblasbirne.
   HINWEIS: Wenn der 0,9%ige Kochsalzbeutel neu ist, liefert normalerweise ein Druck von 150 mmHg die gewünschte Durchflussrate; Der Druck sollte jedoch aufgrund von Schwankungen bei den Marken des Drucksiebs und über die Nutzungsdauer des 0,9%igen Kochsalzbeutels empirisch angepasst werden.
4. Setzen Sie eine 10-ml-Spritze, die mit erwärmter Concanavalin A-Lösung gefüllt ist, auf das 4-Wege-Ventil.
   HINWEIS: Schützen Sie die Spritze vor Lichteinwirkung (Abdeckung mit Folie).

3. Anästhesie

1. Verabreichen Sie die Anästhesie durch intraperitoneale (I.P.) Injektion von Ketamin:Xylazin; Die am weitesten verbreitete Dosis für Mausoperationen/-verfahren beträgt 100:10 mg/kg Körpergewicht²⁵. Beurteilung der Anästhesie durch Pedalreflex (festes Einklemmen der Zehen).
   HINWEIS: Diese Dosis bietet einen Wirkungseintritt von 4-6 Minuten mit einer Dauer von 45-60 Minuten für die chirurgische Anästhesie. Der Narkosecocktail kann maximal 2 Wochen bei Raumtemperatur gelagert werden.

4. Transkardiale Perfusion und Färbung mit Concanavalin A

1. Platzieren Sie die Maus in Rückenlage auf der Perfusionsbühne, um die Freilegung der Brust- und Bauchhöhle zu ermöglichen.
2. Identifizieren Sie visuell den Xiphoid-Prozess und stecken Sie mit dem Hämostaten in der dominanten Hand die Haut fest und verriegeln Sie sie. Sobald das Blutstillungsmittel befestigt ist, übertragen Sie es auf die nicht dominante Hand und heben Sie die Haut an.
3. Verwenden Sie eine Schere in der dominanten Hand und schneiden Sie in einem 90°-Winkel zur Wirbelsäule ein Stück Haut ab, um die äußere Bauchdecke freizulegen.
4. Wenn der Xiphoid-Prozess und der Brustkorb nun sichtbar sind, präparieren Sie die Bauchdecke beidseitig und achten Sie darauf, dass keine Organe oder großen Gefäße durchtrennt werden.
5. Wenn das Zwerchfell nun sichtbar ist, visualisieren Sie die Herzventrikel und die Lunge durch das Zwerchfell. Schneiden Sie mit der Spitze der Schere das Zwerchfell in einer der Flanken in der Nähe der Wirbelsäule durch und achten Sie darauf, dass keine Organe oder großen Gefäße geschnitten werden.
   HINWEIS: Dieses "Loch" im Zwerchfell gleicht den negativen intrathorakalen Druck mit dem atmosphärischen Druck aus, und es tritt ein Pneumothorax auf, der die Lunge kollabiert und das Herz zurückzieht, wodurch die Dissektion des Zwerchfells erleichtert wird, ohne die Lunge oder das Herz zu schädigen.
6. Fahren Sie mit dem Präparieren durch die Rippen und parallel zur Lunge fort, um einen Brustlappen zu erzeugen. Lösen Sie das Blutstillungsmittel und unterbrechen Sie den Xiphoid-Prozess in der Sagittalebene. Öffnen Sie den Xiphoid-Prozess manuell vorsichtig weit. Beobachte die vier Kammern des Herzens.
7. Fassen Sie mit der nicht-dominanten Hand und mit einer Pinzette das Herz in der Nähe seiner Spitze. Halten Sie mit der dominanten Hand die Sondennadel (die am IV-Katheter befestigt ist) und punktieren Sie die Spitze des Herzens. Um eine vollständige Perforation des linken Ventrikels oder das Erreichen des Lungengefäßsystems und eine schlechte Durchblutung des systemischen Gefäßsystems zu vermeiden, überprüfen Sie die Platzierung des Endes der Kugelspitze der Sondennadel, die sich am Rand der Einstichstelle befinden sollte, die leicht aus dem Herzen herausragt. Klemmen Sie die Sondennadel mit einer gebogenen Mückenzange fest oder halten Sie sie einfach mit der Hand, während Sie den IV-Absperrhahn manipulieren.
8. Öffnen Sie den Absperrhahn für die 0,9%ige Kochsalzlösung und schneiden Sie fast gleichzeitig den rechten Ventrikel mit einer Schere auf; Perfuse für 2-3 min. Bewegen Sie die Nadel während der Perfusionszeit vorsichtig von einer Seite zur anderen und auf und ab, um das Abknicken des Gefäßsystems zu verringern und den Blutaustritt aus dem Herzen zu erhöhen.
9. Drehen Sie nach der Perfusion mit Kochsalzlösung den Absperrhahngriff, um den Fluss aus der Kochsalzlösung zu unterbrechen und den Fluss von der Spritze zur Sondennadel zu ermöglichen. Perfundierte von Hand mit der Concanavallin A-Lösung mit stationärer Geschwindigkeit. Stellen Sie sicher, dass die 10 ml Concanavallin A-Lösung in 30-35 s abgegeben werden.
10. Drehen Sie nach der Perfusion mit Concanavalin A das Ventil, um den Fluss aus der Spritze zu unterbrechen und den Fluss von der 0,9%igen Kochsalzlösung zur Sondennadel wieder zuzulassen. Mit der 0,9%igen Kochsalzlösung für weitere 2-3 min perfundieren. Entfernen Sie die Sondennadel aus dem Herzen.
    HINWEIS: Das in diesem Protokoll vorgeschlagene Concanavalin A ist an Fluorescein konjugiert (grün); Es ist jedoch auch Concanavalin A verfügbar, das an andere Fluorochrome gebunden ist.

5. Enukleation und Isolierung frischer Netzhaut

1. Drehen Sie die Maus auf die Seite und legen Sie mit der nicht dominanten Hand den Zeigefinger und den Daumen auf das obere bzw. untere Augenlid. Ziehen Sie die Augenlider und die Haut vorsichtig mit den Fingern zurück und stützen Sie das Auge, so dass es sich teilweise aus der Augenhöhle wölbt.
2. Während das Auge gestreckt ist, verwenden Sie eine gebogene Schere in der dominanten Hand und schöpfen Sie im 45°-Winkel unter das Auge. Den Muskelansatz und den Sehnerv durchtrennen. Übertragen Sie das Auge mit der gleichen Schere wie einen Spatel in ein kleines Gefäß oder direkt auf den Tisch des Präpariermikroskops.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, den Augenhintergrund nicht abzuschneiden, und vermeiden Sie es, während dieses Schritts an der Öse zu ziehen.
3. Legen Sie das Auge auf ein Zahnwachs, um die Kugel zu öffnen. Halten Sie unter dem Präpariermikroskop und mit der nichtdominanten Hand die Skleralfalte oder die Muskelreste, die noch extern am hinteren Auge befestigt sind, mit einer Mikrozange und richten Sie das Auge so aus, dass die Hornhaut zur Seite zeigt.
   HINWEIS: Um zu verhindern, dass sich das Auge beim Öffnen des Globus bewegt/verrutscht, kann ein Stück nasses, fusselfreies Gewebe auf das Zahnwachs gelegt werden.
4. Machen Sie mit einer der scharfen Ecken einer teflonbeschichteten Rasierklinge einen Schnitt 1-2 mm hinter und parallel zum Limbus (Hornhaut-Sklera-Verbindung). Halten Sie die Skleralfalte oder den Muskel mit der Mikrozange fest und ziehen Sie die Klinge mit minimaler Kraft nach unten über den Limbus. Schneide weiter mit dem Rasierer, um den vorderen Augenabschnitt (Hornhaut, Iris, Linse und Glaskörper) vollständig vom hinteren Augenabschnitt (Augenmuschel) zu trennen.
   HINWEIS: Sägen Sie nicht hin und her.
5. Übertragen Sie die halbierte Augenmuschel mit PBS in eine kleine Petrischale.
   HINWEIS: Vermeiden Sie den Kontakt der Netzhaut mit dem Seidenpapier (Hinweis in Schritt 5.3), da es fest am Papier haftet und praktisch unmöglich wiederhergestellt werden kann.
6. Fassen Sie eine Sklerallete oder den verbleibenden Muskel an der Außenseite der Sklera mit einer Mikrozange. Löse die Netzhaut vollständig von der Sklera, indem du mit einem Mikrospatel alle Verbindungen am Limbus um den Umfang der Augenmuschel löst. Schöpfen Sie die Netzhaut mit dem Mikrospatel aus der Sklera heraus. Wenn die Netzhaut noch durch den Sehnerv mit der Sklera verbunden ist, schieben Sie die Mikroschere zwischen Netzhaut und Sklera, um den Sehnerv zu durchtrennen.
7. Entfernen Sie alle Reste des Glaskörpers und der Ziliarmuskulatur in der Peripherie der Netzhaut. Übertragen Sie die isolierte Netzhaut sofort auf einen Objektträger mit etwas PBS.
   HINWEIS: Jede andere Netzhautisolationstechnik kann je nach Vorliebe des Forschers verwendet werden.

6. Flache Befestigung der Netzhaut

1. Lege die nicht fixierte Netzhaut mit einer kleinen Menge PBS auf einen Objektträger. Richten Sie die Netzhaut mit dem Mikrospatel vorsichtig mit der Glaskörperseite nach oben aus. Wenn die Netzhaut nach innen gefaltet ist, halten Sie die Ränder der Netzhaut mit einer Mikrozange fest, während die Netzhaut mit dem Mikrospatel entfaltet wird.
2. Machen Sie 4-5 radiale Schnitte in die Netzhaut, so dass sie flach liegt (Kleeblattmuster).
3. Trocknen Sie mit einem fusselfreien Tuch den Überschuss an PBS von der Netzhaut weg.
   HINWEIS: Berühren Sie die Netzhaut nicht mit dem Gewebe; Andernfalls geht die Probe verloren. Deckglas ist wünschenswert, um die Netzhaut flach zu halten.

7. Mikroskopie

HINWEIS: Für diesen Schritt kann jedes Fluoreszenzmikroskop mit einem GFP/FITC-Kanal (480/530 nm) verwendet werden. Für diese Arbeit haben wir das referenzierte Mikroskop mit 488-Kanal und die zugehörige Software zur Bildaufnahme verwendet.

1. Betrachten Sie die kürzlich flach montierte Netzhaut unter dem Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung (10-faches Objektiv) und zählen Sie fluoreszenzmarkierte Leukozyten (manuell), indem Sie das gesamte Gewebe methodisch scannen (von rechts nach links oder von oben nach unten).
   HINWEIS: Leukozyten sind einzelne fluoreszierende Punkte, die eine runde oder ovale Form aufweisen können. Sie haben einen Durchmesser von 12-15 μm und ragen nicht aus den Netzhautkapillaren heraus (die Struktur wird vollständig durch das Lumen des Gefäßes begrenzt).
2. Erfassen Sie repräsentative Bilder mit der gewünschten Vergrößerung und führen Sie eine Nachbearbeitung der Bilder mit der Software Ihrer Wahl durch (z. B. ImageJ [Fidschi]).
3. Geben Sie die Anzahl als Leukozyten pro Netzhaut an. Stellen Sie die Daten anhand des Mittelwerts ± Standardabweichung grafisch dar.

Ergebnisse

Ein gut ausgeführtes Perfusions- und Färbeprotokoll zeigt das gesamte retinale Gefäßsystem, das mit Concanavalin A abgegrenzt ist (Abbildung 1). Eine schlechte Perfusion der Maus verhindert die Markierung des gesamten Gefäßbaums und die anschließende Analyse der am Lumen haftenden Leukozyten (Abbildung 2), während ein übermäßiger Druck durch einen schnellen Druck einer Spritze (weniger als 30-35 s) zu einer Gefäßper...

Diskussion

Leukostase beim Menschen bezieht sich auf Symptome und klinische Befunde im Zusammenhang mit Hyperleukozytose (Gesamtzahl der Leukozyten (WBCs) >100.000/μl) und ist ein medizinischer Notfall²⁰. Der/die Mechanismus/die Mechanismen, die zur Leukostase führen, werden intensiv erforscht. Bisher ist es noch nicht möglich, die Leukostase beim Menschen in vivo zu untersuchen, und die Forscher müssen sich auf Tiermodelle verlassen, um diesen Prozess zu verste...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringe
4-way stopcock Luer lock I.V. line valve	Baxter	2C6204
Concanavalin A solution	Vector	FL-1001	Prepare in PBS 1 mg/mL
Dissecting tools set			Includes hemostats, scissors and forceps
FIJI			Software for image processing
Fluorescence microscope	Nikon	Eclipse Ni
Forceps, Dumont #5, Biological grade tip	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72700-D
Gavage Needle 1.25 mm OD barrel tip x 30 mm	Fine Science	18060-20
Halstead Mosquito Forceps	Fisher Scientific	13-812-10
I.V. Catheter set with regulating clamp 70 inches	Baxter	2C5417s
I.V. Pole
Lint free tissue			Kimpwipes is an option
Micro dissecting spring scissors, Vannas, 3 mm straight	ROBOZ	RS-5620
Micro spatula	Fine Science Tools (FST)	10091-12
Nikon		NIS-Elements (AR 5.30.03 64-bit)	Software for image acquisition
Petri dish (100 mmx15 mm)	Corning	351029
Phosphate buffered saline (PBS)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72670
Pressure infuser	Infusurge	4010
Razor blades, GEM single edge stainless steel, Teflon coated	Electron Microscopy Sciences (EMS)	71970
Saline 0.9%, veterinary grade, 1000 mL	Baxter	04925-04-10
Small dissecting scissors, curved blunt end 22 mm	ROBOZ	RS 5983