Retinal Vaskülatürde Diyabete Bağlı Yapışık Lökositlerin Miktar Tayini

Özet

Retina vaskülatürünün duvarlarını ve yapışık lökositleri etiketlemek için bir yöntem gösteriyoruz. Bu yapışık lökositler daha sonra bir floresan mikroskobu altında bir inflamasyon parametresi veya bu inflamasyonun tedavilere yanıtı olarak sayılabilir.

Özet

Lökostasis, lökositlerin damar sisteminin lümen duvarına bağlanmasını ifade eder. Lökositlerin kan damarları duvarı ile bu etkileşimi, inflamasyonun karakteristiğidir ve diyabetik retinopati de dahil olmak üzere çeşitli doku ve hastalıklarda kılcal damar tıkanıklığı ile nedensel olarak bağlantılıdır.

Lökostasis yıllardır hiperlökositozun hayatı tehdit eden bir komplikasyonu olarak bildirilmiştir ve sadece klinik olarak teşhis edilebilir. Fenomenin önemi göz önüne alındığında, tezahürüne yol açan potansiyel mekanizma(lar)ı anlamak için yoğun araştırmalar yapılmıştır; Bununla birlikte, laboratuvar ortamlarında olayın ciddiyetini görselleştirmek ve ölçmek için altın standart bir teknik yoktur.

Aşağıda özetlenen yöntemde, damar sistemi başlangıçta kanı çıkarmak için bir tampon ile perfüze edilir ve daha sonra concanavalin A, açıkta kalan tüm hücre duvarlarına bağlandığı ve lökositlerin özellikle parlak boyanmasına neden olduğu damar sistemine perfüze edilir. Tüm bağlanmamış kan hücrelerini çıkarmak için perfüzyon başarılı olursa, kalan floresan etiketli lökositler vaskülatüre bağlanır ve mevcut herhangi bir floresan mikroskobu kullanılarak manuel olarak ölçülebilir.

Giriş

Lökositler (beyaz kan hücreleri, WBC'ler), kan akışkanlığının korunması ve trombüs çözünürlüğünün düzenlenmesi gibi vaskülatürün optimal fonksiyonunda önemli bir rol oynar¹. Ayrıca, damar tıkanıklığına yol açan uzun süre damar sisteminin lümen duvarına yapışmak gibi bazı patolojik durumlarda, en azından geçici olarak, lökostasis ^2,3 olarak bilinen bir fenomende kilit bir rol oynarlar.

Diyabetik retinopati, uzun süreli diyabetin en yaygın komplikasyonlarından biridir ve 20-75 yaş arası bireyler için ABD'de ve dünya çapında görme bozukluğu ve körlüğün önde gelen nedenlerinden biridir⁴. Retina vaskülatürünün yavaş ve ilerleyici dejenerasyonu, hastalığın erken evrelerinin klinik olarak anlamlı bir bileşenidir ve bazı hastalarda retinal neovaskülarizasyon ile sonuçlanan retinal iskemiye yol açar ^5,6. Kümülatif kanıtlar, inflamasyonun retinopatinin⁷ gelişiminde önemli bir rol oynadığını ve löstazın subklinik intravasküler inflamatuar yanıt olarak kabul edildiğini göstermektedir. Lökostaz, diyabetin erken evrelerinde, saptanabilir herhangi bir klinik belirti gelişmeden çok önce ortaya çıkar ^8,9,10. Diyabette retina damarlarının aylar ila yıllar boyunca yapışık lökositler tarafından tekrar tekrar tıkanması (kronik lökostasis) kılcal damarların damar tıkanıklığına ve dejenerasyonuna katkıda bulunabilir 11,12,13. Bu lökostasisin şiddeti patolojik öneme sahiptir ve hastalık sürecinin ciddiyetini izlemek veya araştırma ortamlarında bir tedavinin etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir.

Hiperglisemik mikroçevrenin lökostasis üzerindeki spesifik etkilerini daha fazla incelemek için in vitro modeller tasarlanmıştır. İzole retinal mikrovasküler endotel hücreleri, vasküler endotelyumu (damarların lümenini döşeyen hücre tek tabakası) çoğaltmak için 2 veya 3 boyutlu kültür modellerinde (çip üzerinde mikrovaskülatür¹⁴) büyütülebilir ve düzenlenebilir. Bununla birlikte, bu modellerin deneyler arası varyasyonu kullanımlarını sınırlar. İnsan retinal vaskülatüründe in vivo lökostasis çalışması hala sınırlıdır ve bu nedenle, retinal lökostasis hakkındaki mevcut bilgilerin çoğu diyabetik retinopatinin hayvan modellerinden elde edilmiştir^13,15.

Bu raporun amacı, lökostasisin bir parametresi olarak retina vaskülatürüne bağlı lökositlerin miktar tayini için başka bir yerde¹⁶ açıklanan yöntemlere dayanan standart bir protokolü tanımlamaktır. Bu test, maligniteler ^3,17,18,19 ve bazı bulaşıcı ve alerjik durumlar²⁰ gibi lökostasis de sunan diğer vasküler hastalıkları incelemek için kullanılabilir. Bu protokol, herhangi bir temel araştırma laboratuvarında özel ekipmana ihtiyaç duymadan uygulanabilir. Aşağıda özetlenen yöntemde, damar sistemi başlangıçta kanı çıkarmak için tampon ile perfüze edilir ve daha sonra konkanavalin A, açıkta kalan tüm hücre duvarlarına bağlandığı ve özellikle lökositlerin parlak boyanmasına neden olduğu damar sistemine perfüze edilir 21,22,23. Tüm bağlanmamış kan hücrelerini çıkarmak için perfüzyon başarılı olursa, vaskülatüre bağlı kalan floresan etiketli lökositler, eldeki herhangi bir floresan mikroskobu kullanılarak manuel olarak ölçülebilir.

Protokol

Protokol, California Irvine Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı ile ilgili resmi düzenlemelere uygundur. Bu protokolde herhangi bir durma noktası yoktur. Fare başına ortalama süre 30 dakikadır.

1. Perfüzyon aşamasının hazırlanması

1. Kullanmadan önce% 0.9 tuzlu su torbasını ve concanavalin A çözeltisini 37 ^°C'lik bir su banyosunda 20-30 dakika ısıtın.
   NOT: Concanavalin A'yı ışığa maruz kalmaktan koruyun (folyo ile örtün).
2. İşlemin yapılacağı yüzeye kan ve sıvıların damlamasını önlemek için bir tepsi hazırlayın. Tepsinin üzerine, emici bir tezgah alt pedi veya herhangi bir emici malzeme ile kaplı bir ısıtma yastığı yerleştirin.
   NOT: Amaç, işlem sırasında farenin vücudunun ısı kaybetmesini önlemektir, çünkü soğutma, perfüzyon sırasında kanın çıkarılmasını zorlaştırır.

2. Basınçlı demliğin kurulması

1. % 0.9 salin torbasını, IV kateter setini, 4 valf vanasını ve gavaj iğnesini seri olarak bağlayın.
2. %0.9 tuzlu su torbasını, ağ ile basınçlı demliğin hava kesesi arasına yerleştirin. Tuzlu su torbasını hava kesesinin arkasında bulunan kancaya asın. Basınçlı şişliği IV direğine asmak için IV kutup halkasını kullanın.
3. Sistemin birkaç dakika açılmasına (çalışmasına) izin vererek tüm hava kabarcıklarının hatlarını ve portlarını temizleyin ve akış hızını 18-20 mL/dk^24'e ayarlayın. Basınçlı demlik hava kesesini şişirmek için, vana kolunu açık vana havalandırmasına bakacak şekilde çevirin, ardından manometre istenen basıncı gösterene kadar şişirme ampulünü pompalayın. Her fareyi perfüze etmeden önce basıncı yeniden ayarlayın. Söndürmek için musluk kolunu düz bir şekilde şişirme ampulüne doğru çevirin.
   NOT: %0,9 tuzlu su torbası yeniyse, genellikle 150 mmHg basınç istenen akış hızını sağlar; Bununla birlikte, basınçlı demlik markalarındaki farklılıklar ve %0.9 tuzlu su torbasının kullanım süresi boyunca basınç ampirik olarak ayarlanmalıdır.
4. Isıtılmış concanavalin A çözeltisi ile doldurulmuş 10 mL'lik bir şırıngayı 4 vanaya takın.
   NOT: Şırıngayı ışığa maruz kalmaktan koruyun (folyo ile örtün).

3. Anestezi

1. Ketamin intraperitoneal (IP) enjeksiyonu ile anestezi verin: Ksilazin; Fare cerrahisi / prosedürü için en yaygın kullanılan doz 100: 10 mg / kg vücut ağırlığı^25'tir. Anesteziyi pedal refleksi ile değerlendirin (sert ayak parmağı tutam).
   NOT: Bu doz, 45-60 dakikalık bir cerrahi anestezi süresi ile 4-6 dakikalık bir başlangıç sağlar. Anestezik kokteyl oda sıcaklığında en fazla 2 hafta saklanabilir.

4. Transkardiyal perfüzyon ve concanavalin A ile boyama

1. Göğüs ve karın boşluğunun açığa çıkmasına izin vermek için fareyi sırtüstü pozisyonda perfüzyon aşamasına yerleştirin.
2. Ksifoid sürecini görsel olarak tanımlayın ve baskın eldeki hemostat ile cildi sabitleyin ve kilitleyin. Kanama durdurucu sabitlendikten sonra, baskın olmayan elinize aktarın ve cildi kaldırın.
3. Baskın elinizde makas kullanın ve dış karın duvarını ortaya çıkarmak için omurgaya 90°'lik bir açıyla bir deri parçası kesin.
4. Ksifoid süreci ve göğüs kafesi artık görünür durumdayken, herhangi bir organı veya büyük damarı kesmekten kaçınmaya dikkat ederek karın duvarından iki taraflı olarak diseksiyon yapın.
5. Diyafram artık görünür durumdayken, diyaframdan kalp ventriküllerini ve akciğerleri görselleştirin. Makasın ucunu kullanarak, herhangi bir organı veya büyük damarı kesmemeye dikkat ederek, omurgaya yakın yanlardan birinde diyaframı kesin.
   NOT: Diyaframdaki bu "delik", negatif göğüs içi basıncı atmosferik basınçla dengeleyecek ve akciğerleri çökerten ve kalbi geri çeken, akciğerlere veya kalbe zarar vermeden diyaframın diseksiyonunu kolaylaştıran bir pnömotoraks oluşacaktır.
6. Bir göğüs "flebi" oluşturmak için kaburgalardan ve akciğerlere paralel olarak diseksiyona devam edin. Hemostatı serbest bırakın ve sagital düzlemde ksifoid sürecini kesin. Ksifoid işlemini manuel olarak nazikçe açın. Kalbin dört odacığını gözlemleyin.
7. Baskın olmayan el ile ve forseps kullanarak, kalbi tepesine yakın bir yerde kavrayın. Baskın el ile gavaj iğnesini (IV kateterine bağlı) tutun ve kalbin tepesini delin. Sol ventrikülün tam delinmesini veya pulmoner vaskülatüre ulaşmasını ve ardından sistemik vaskülatürün zayıf perfüzyonunu önlemek için, gavaj iğnesinin top ucunun ucunun yerleşimini kontrol edin, bu da kalpten hafifçe çıkıntı yapan delinme bölgesinin kenarında olmalıdır. Gavaj iğnesini kavisli sivrisinek forseps kullanarak yerine sıkıştırın veya IV musluğunu manipüle ederken elinizle tutun.
8. Muslukta% 0.9 saline kadar açın ve neredeyse aynı anda sağ ventrikülü makasla kesin; 2-3 dakika perfüs. Perfüzyon süresi boyunca, damar sisteminin bükülmesini azaltmak ve kalpten kan çıkışını artırmak için iğneyi nazikçe bir yandan diğer yana ve yukarı ve aşağı hareket ettirin.
9. Tuzlu su ile perfüze ettikten sonra, tuzlu sudan gelen akışı kapatmak ve şırıngadan gavaj iğnesine akışa izin vermek için musluk kolunu çevirin. Concanavalin A çözeltisi ile sabit bir durum oranında elle perfüz. 10 mL concanavalin A çözeltisinin 30-35 saniye içinde dağıtıldığından emin olun.
10. Concanavalin A ile perfüze ettikten sonra, şırıngadan gelen akışı kapatmak için valfi çevirin ve% 0.9 salinden tekrar gavaj iğnesine akışa izin verin. % 0.9 tuzlu su çözeltisi ile 2-3 dakika daha perfüz. Gavaj iğnesini kalpten çıkarın.
    NOT: Bu protokolde önerilen konkanavalin A, floresein (yeşil) ile konjuge edilmiştir; bununla birlikte, diğer florokromlara bağlı concanavalin A da mevcuttur.

5. Taze retinanın enükleasyonu ve izolasyonu

1. Fareyi yan çevirin ve baskın olmayan elinizi kullanarak işaret parmağını ve başparmağınızı sırasıyla üst ve alt göz kapaklarının üzerine yerleştirin. Göz kapaklarını ve cildi parmaklarınızla nazikçe geri çekin ve gözü proptote edin, böylece kısmen yuvadan çıkıntılı hale getirin.
2. Göz dikilirken, baskın elinizde kavisli makas kullanın ve göz altına 45°'lik bir açıyla kepçe yapın. Kas ekini ve optik siniri kesin. Spatula ile aynı makası kullanarak, gözü küçük bir kaba veya doğrudan diseksiyon mikroskobunun aşamasına aktarın.
   NOT: Bu adım sırasında gözün arkasını kesmemeye ve gözü çekmemeye dikkat edin.
3. Küreyi açmak için gözü bir diş mumunun üzerine yerleştirin. Diseksiyon mikroskobu altında ve baskın olmayan eli kullanarak, skleral kıvrımı veya hala bağlı olan kas kalıntılarını mikro forseps ile arka göze dışarıdan tutun ve gözü, kornea bir tarafa bakacak şekilde yönlendirin.
   NOT: Küreyi açarken gözün hareket etmesini/kaymasını önlemek için, diş mumunun üzerine bir parça ıslak tüy bırakmayan doku yerleştirilebilir.
4. Teflon kaplı bir tıraş bıçağının keskin köşelerinden biri ile limbusun 1-2 mm arkasında ve ona paralel bir kesi yapın (kornea-sklera bileşkesi). Skleral kıvrımı veya kası mikro forseps ile tutun ve bıçağı minimum aşağı doğru kuvvetle limbus boyunca çekin. Ön segmenti (kornea, iris, lens ve vitreus) arka segmentten (göz kabı) tamamen ayırmak için usturayla kesmeye devam edin.
   NOT: İleri geri testere yapmayın.
5. İkiye bölünmüş göz kabını PBS'li küçük bir Petri kabına aktarın.
   NOT: Retinanın kağıt mendil ile temasından kaçının (adım 5.3'teki not), çünkü kağıda sıkıca yapışacak ve kurtarılması esasen imkansız hale gelecektir.
6. Mikro forseps ile bir skleral kıvrım veya skleranın dışında kalan kası tutun. Bir mikro spatula kullanarak göz kabının çevresindeki limbustaki tüm bağlantıları keserek retinayı skleradan tamamen ayırın. Mikro spatula ile retinayı skleradan çıkarın. Retina hala optik sinir tarafından skleraya bağlıysa, optik siniri kesmek için mikro makası retina ve sklera arasına kaydırın.
7. Retinanın çevresindeki vitreus ve siliyer kas kalıntılarını çıkarın. İzole retinayı hemen bir miktar PBS ile bir slayta aktarın.
   NOT: Araştırmacının tercihine bağlı olarak başka herhangi bir retina izolasyon tekniği kullanılabilir.

6. Retinanın düz montajı

1. Sabitlenmemiş retinayı az miktarda PBS içeren bir slayt üzerine yerleştirin. Mikro spatulayı kullanarak, retinayı vitröz tarafı yukarı bakacak şekilde nazikçe yönlendirin. Retina içe doğru katlanmışsa, mikro spatula kullanılarak retina açılırken retinanın kenarlarını tutmak için mikro forseps kullanın.
2. Retinaya düz durması için 4-5 radyal kesi yapın (yonca yaprağı deseni).
3. Tüy bırakmayan bir doku kullanarak, PBS'nin fazlalığını retinadan kurutun.
   NOT: Retinaya doku ile dokunmayın; aksi takdirde numune kaybolacaktır. Retinayı düz tutmak için lamel kayma arzu edilir.

7. Mikroskopi

NOT: Bu adım için GFP/FITC (480/530 nm) kanallı herhangi bir floresan mikroskobu kullanılabilir. Bu çalışma için, görüntü elde etmek için 488 kanallı referans mikroskop ve ilgili yazılımı kullandık.

1. Yakın zamanda düz monte edilmiş retinayı mikroskop altında 100x büyütmede (10x objektif) gözlemleyin ve tüm dokuyu metodik olarak tarayarak (sağdan sola veya yukarıdan aşağıya) floresan etiketli lökositleri (manuel olarak) sayın.
   NOT: Lökositler, yuvarlak veya oval bir şekil gösterebilen tek floresan noktalardır. 12-15 μm çapındadırlar ve retina kılcal damarlarından çıkıntı yapmazlar (yapı tamamen damarın lümeni tarafından sınırlandırılmıştır).
2. İstenen büyütme oranına sahip temsili görüntüler elde edin ve tercih edilen yazılımla (örneğin, ImageJ [Fiji]) görüntülerin son işlemesini gerçekleştirin.
3. Sayıyı retina başına lökosit olarak ifade edin. Verileri ortalama ± standart sapmaya göre grafiklendirin.

Sonuçlar

İyi uygulanmış bir perfüzyon ve boyama protokolü, konkanavalin A ile tanımlanan tüm retina vaskülatürünü gösterecektir (Şekil 1). Farenin zayıf perfüzyonu, tüm vasküler ağacın etiketlenmesini ve ardından lümene yapışan lökositlerin analizini önler (Şekil 2), oysa bir şırınganın hızlı bir şekilde sıkılmasından (30-35 saniyeden az) kaynaklanan aşırı basınç, vasküler geçirgenliğe ve kan d...

Tartışmalar

İnsanlarda lökostas, hiperlökositoz (toplam lökosit (WBC) sayısı >100.000/μL) ile ilişkili semptom ve klinik bulguları ifade eder ve tıbbi bir acil durumdur²⁰. Lökostasise yol açan mekanizma(lar) yoğun bir şekilde araştırılmaktadır. Bugüne kadar, insanlarda in vivo lökostasis çalışması henüz mümkün değildir ve araştırmacıların bu süreci anlamak için hayvan modellerine güvenmeleri gerekmektedir. Farklı hastalıklar löst...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringe
4-way stopcock Luer lock I.V. line valve	Baxter	2C6204
Concanavalin A solution	Vector	FL-1001	Prepare in PBS 1 mg/mL
Dissecting tools set			Includes hemostats, scissors and forceps
FIJI			Software for image processing
Fluorescence microscope	Nikon	Eclipse Ni
Forceps, Dumont #5, Biological grade tip	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72700-D
Gavage Needle 1.25 mm OD barrel tip x 30 mm	Fine Science	18060-20
Halstead Mosquito Forceps	Fisher Scientific	13-812-10
I.V. Catheter set with regulating clamp 70 inches	Baxter	2C5417s
I.V. Pole
Lint free tissue			Kimpwipes is an option
Micro dissecting spring scissors, Vannas, 3 mm straight	ROBOZ	RS-5620
Micro spatula	Fine Science Tools (FST)	10091-12
Nikon		NIS-Elements (AR 5.30.03 64-bit)	Software for image acquisition
Petri dish (100 mmx15 mm)	Corning	351029
Phosphate buffered saline (PBS)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72670
Pressure infuser	Infusurge	4010
Razor blades, GEM single edge stainless steel, Teflon coated	Electron Microscopy Sciences (EMS)	71970
Saline 0.9%, veterinary grade, 1000 mL	Baxter	04925-04-10
Small dissecting scissors, curved blunt end 22 mm	ROBOZ	RS 5983