在热应激下使用多核糖体谱进行翻译效率测试

摘要

这里介绍的方案涉及多核糖体分析，以通过蔗糖密度梯度离心从 拟南芥 中分离转组，与核糖体相关的 mRNA 到非多核糖体和多核糖体 RNA 中。该方法证明了热应激 拟南芥的翻译效率。

摘要

热胁迫下不同基因的翻译控制是植物适应环境的关键步骤。评估各种基因的翻译活性可以帮助我们了解植物恢复力的分子机制，有助于在面对全球气候变化时培育出具有更强抗逆性的作物。本文提出了一种通过暴露于热应激的植物中的多核糖体分析来评估翻译效率的详细方法。该程序分为三个部分： 拟南芥的热应激处理，使用多核糖体谱的翻译效率测试，以及通过根据谱分离非多核糖体和多核糖体 RNA 来计算翻译效率。在第一部分中， 拟南芥 植物受到受控的热应激条件以模拟环境挑战。处理包括将植物暴露在高温下指定时间，确保一致且可重复的应力诱导。这一步对于研究植物对热应激的生理和分子反应至关重要。第二部分涉及使用多核糖体分析的翻译效率测试。通过蔗糖梯度离心提取多核糖体，该离心法根据核糖体负载分离 mRNA。这允许检查核糖体对 mRNA 的占有率，从而深入了解应激条件下的翻译控制机制。在第三部分中，从多核糖体和非多核糖体组分中分离 RNA。加标 RNA 用于准确测量每个组分中的 RNA 量。通过比较正常和热应激条件下 mRNA 在这些组分中的分布来计算翻译效率。通过使用核糖体相关 RNA 和总 RNA 进行定量实时 PCR （qRT-PCR） 来进一步评估特定基因的翻译活性。该方法专门关注热应激的影响，为分析植物中的翻译调控提供了详细的方案。

引言

翻译对于生物体从 mRNA 合成功能性蛋白至关重要，它支持基本的细胞功能和生物过程，如新陈代谢和信号传导，并实现应激反应。没有翻译，细胞就无法产生重要蛋白质，从而影响其结构、功能和调节，从而影响维持生命和促进生物多样性 ^1,2。因此，研究植物的转化效率至关重要。翻译涉及几个基本步骤。首先，当 mRNA 与核糖体结合时发生起始，由真核生物中的 eIF 等起始因子促进，这些因子识别起始密码子，通常是 AUG。接下来，随着转移 RNA （tRNA） 分子（每个分子携带特定氨基酸）依次与核糖体结合，延伸进行。肽键在相邻氨基酸之间形成，根据 mRNA 序列延长多肽链。最后，在遇到终止密码子（UAA、UAG 或 UGA）时开始终止，终止密码子被促使核糖体释放新合成蛋白质的释放因子识别。在整个翻译过程中，各种真核起始因子 （eIF）、延伸因子和核糖体 RNA 共同作用，以确保准确性和效率 ^3,4。

先前的研究表明，翻译后修饰在调节 eIF 之间的相互作用中起着关键作用，从而影响翻译效率。体外研究表明，酪蛋白激酶 2 （CK2） 激酶磷酸化 eIF3c、eIF5 和 eIF2....

研究方案

1. 热应激处理的拟南芥幼苗样品制备

1. 将每个重复和每个条件的 250 种子铺板，滤纸上的滴管放置在不含蔗糖 （pH 5.6） 的 Murashige 和 Skoog （MS） 基础培养基琼脂平板上，补充有 1.2% 植物琼脂。
   注：要在 MS 板上种植幼苗，应在板上放置无菌滤纸，以防止幼苗根部深入培养基，便于采样。然后将种子种植在滤纸的顶部。为了排除糖对植物生长和实验结果的影响，建议使用不含蔗糖的 MS 培养基进行培养。
2. 用铝箔包裹含有种植种子的 MS 板以阻挡光线，并在 4 °C 下孵育 2 天以诱导春化。
3. 将春化种子转移到生长室中，在 22 °C 下在 16 小时：8 小时，光-暗光周期下生长，光强度为 100 μmol/m²/s。
4. 对于热应激样品，用防水胶带密封含有 5 日龄幼苗的 MS 培养基板，并将它们置于 40 °C 水浴中 1 小时。
5. 对于热处理后恢复的样品，热处理后立即冷却板。随后，将它们置于 22 °C 的生长室中 2 小时。
6. 每次重复将 250 株经过处理或未处理的幼苗收获到 1.5 mL 微量离心管中，并立即将样品在液氮中冷冻。
   注：对于每种条件，制备了两组样品。一个用于多....

讨论

该协议概述了一种简单且标准化的方法，用于测量拟南芥幼苗的翻译效率。该方案的关键步骤是通过二次离心和 RNA 提取试剂提取以及蔗糖梯度的细致制备来确保 RNA 的稳定性。此外，我们提供了使用加突归一化方法对非多核糖体和多核糖体 RNA 进行归一化和定量的关键步骤。所有程序都应在冰上使用不含 RNase 的缓冲液和工具进行，这一点非常重要。此外，确保蔗糖浓度?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf tube	Labcon	3012-870-000-9	RNA extraction
13.2 mL centrifuge tube	Beckman Coulter	331372	ultracentrifugation
Bromophenol blue	Honeywell	32712	Polysome profile
Chloroform	Honeywell	32211	RNA extraction
Cycloheximide (CHX)	Sigma-Aldrich	SI-C7698	Polysome profile
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	RNA extraction
Ethanol	Sigma-Aldrich	32221	RNA extraction
GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit	Invitrogen	900433	Normalization
Glycerol	Honeywell	15523	Normalization
Heparin	Sigma-Aldrich	SI-H3149	Polysome profile
HiScript III RT SuperMix for qPCR kit	Vazyme	R323-01	Normalization
KCl	J.T.Baker	3040-01	Polysome profile
MgCl2	Sigma-Aldrich	SI-M8266	Polysome profile
MS basal medium	Phyto	M524	Plant culture
Peak Chart Syringe Pump	Brandel	SYN4007LS	Polysome profile
Polyoxyethylene-10-Tridecyl-Ether (PTE)	Sigma-Aldrich	P2393	Polysome profile
RNasin	Promega	N251B	Polysome profile
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	SI-D6750	Polysome profile
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5391	Polysome profile
SYBR Green Supermix	Bio-Rad	BP170-8882	Normalization
TRI reagent	MRC	TR118	RNA extraction
Tris-HCl	J.T.Baker	4109-06	Polysome profile
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-100K	ultracentrifugation
UV/VISDETECTOR	Brandel	UA-6	Polysome profile