在热应激下使用多核糖体谱进行翻译效率测试

摘要

这里介绍的方案涉及多核糖体分析，以通过蔗糖密度梯度离心从 拟南芥 中分离转组，与核糖体相关的 mRNA 到非多核糖体和多核糖体 RNA 中。该方法证明了热应激 拟南芥的翻译效率。

摘要

热胁迫下不同基因的翻译控制是植物适应环境的关键步骤。评估各种基因的翻译活性可以帮助我们了解植物恢复力的分子机制，有助于在面对全球气候变化时培育出具有更强抗逆性的作物。本文提出了一种通过暴露于热应激的植物中的多核糖体分析来评估翻译效率的详细方法。该程序分为三个部分: 拟南芥的热应激处理，使用多核糖体谱的翻译效率测试，以及通过根据谱分离非多核糖体和多核糖体 RNA 来计算翻译效率。在第一部分中， 拟南芥 植物受到受控的热应激条件以模拟环境挑战。处理包括将植物暴露在高温下指定时间，确保一致且可重复的应力诱导。这一步对于研究植物对热应激的生理和分子反应至关重要。第二部分涉及使用多核糖体分析的翻译效率测试。通过蔗糖梯度离心提取多核糖体，该离心法根据核糖体负载分离 mRNA。这允许检查核糖体对 mRNA 的占有率，从而深入了解应激条件下的翻译控制机制。在第三部分中，从多核糖体和非多核糖体组分中分离 RNA。加标 RNA 用于准确测量每个组分中的 RNA 量。通过比较正常和热应激条件下 mRNA 在这些组分中的分布来计算翻译效率。通过使用核糖体相关 RNA 和总 RNA 进行定量实时 PCR （qRT-PCR） 来进一步评估特定基因的翻译活性。该方法专门关注热应激的影响，为分析植物中的翻译调控提供了详细的方案。

引言

翻译对于生物体从 mRNA 合成功能性蛋白至关重要，它支持基本的细胞功能和生物过程，如新陈代谢和信号传导，并实现应激反应。没有翻译，细胞就无法产生重要蛋白质，从而影响其结构、功能和调节，从而影响维持生命和促进生物多样性 ^1,2。因此，研究植物的转化效率至关重要。翻译涉及几个基本步骤。首先，当 mRNA 与核糖体结合时发生起始，由真核生物中的 eIF 等起始因子促进，这些因子识别起始密码子，通常是 AUG。接下来，随着转移 RNA （tRNA） 分子（每个分子携带特定氨基酸）依次与核糖体结合，延伸进行。肽键在相邻氨基酸之间形成，根据 mRNA 序列延长多肽链。最后，在遇到终止密码子（UAA、UAG 或 UGA）时开始终止，终止密码子被促使核糖体释放新合成蛋白质的释放因子识别。在整个翻译过程中，各种真核起始因子 （eIF）、延伸因子和核糖体 RNA 共同作用，以确保准确性和效率 ^3,4。

先前的研究表明，翻译后修饰在调节 eIF 之间的相互作用中起着关键作用，从而影响翻译效率。体外研究表明，酪蛋白激酶 2 （CK2） 激酶磷酸化 eIF3c、eIF5 和 eIF2β，从而增加它们彼此之间以及与 eIF1 的相互作用 ^5,6。在黑暗中，E3 连接酶组成型光形态发生 1 （COP1） 通过抑制 TOR 介导的 S6K-RPS6 磷酸化来抑制翻译。未磷酸化的 RPS6 无法形成功能性核糖体，从而停止翻译⁷。相反，在光照条件下，SUPPRESSOR OF PHYA 105 （SPA1） 激酶磷酸化 eIF2α 以促进 eIF2 复合体组装并促进翻译起始⁸。这些发现突出了调节响应环境信号的翻译的复杂控制机制。

适度的环境刺激可以有效促进促进生长的翻译过程，例如光形态发生 ^8,9。然而，当环境因素过多时，不动植物需要进化出合适的调节机制来减轻环境压力造成的损害¹⁰。在以前与植物胁迫反应相关的研究中，大多数集中在代谢、激素和转录水平的调节 11,12,13,14。然而，最近的研究开始强调翻译调控对植物抗逆性的影响 15,16,17。植物可以通过降低翻译效率来提高其抗逆性，从而最大限度地减少不必要的能源消耗。由于在植物细胞中形成非膜性应激颗粒，非翻译 mRNA 和相关蛋白在其中聚集以降低翻译效率¹⁸。植物经常遇到的常见环境压力之一是热应激，据报道，热应激会诱导植物细胞内形成应激颗粒^19,20。全球变暖导致全球平均气温升高严重影响农作物产量²¹.因此，研究植物在热胁迫下的生理调节至关重要。先前的研究表明，小麦的热处理导致多核糖体结合的 mRNA 减少。然而，储存在应激颗粒中的 mRNA 被释放并重新结合到核糖体上，从而促进恢复后的翻译²²。此外，以前的研究比较了沉水植物中总 mRNA 和多核糖体结合 mRNA 之间的基因表达¹⁶。结果表明，浸没后与脱落酸和非生物胁迫反应相关的 mRNA 稳态水平略有增加。此外，多核糖体结合的 mRNA 的数量显着增加。这些结果表明，翻译调控可能在控制植物的胁迫耐受性中发挥更关键的作用。因此，有效的多核糖体 RNA 分离方法对于研究应激处理样品的翻译组至关重要。

在该方案中，我们将 RNA 分离方法从使用 LiCl 沉淀法进行高风险和大量苯酚/氯仿提取修改为小规模苯酚/硫氰酸胍提取方法，该方法需要较少的体积。前一种方法涉及与多核体组分直接混合，产生更大的实验废物 ^9,15,23。相比之下，这种改进的方法利用了差密度原理:多核糖体 RNA 首先与高盐、无糖溶液混合，然后通过超速离心沉淀。随后，使用少量苯酚/硫氰酸胍试剂进行 RNA 提取。这种方法有效地减少了有机废物的产生，使我们的实验更加环保。此外，使用的有机溶剂具有较低的毒性。这些原因促使我们相应地调整和改进实验程序。此外，以前的方法没有提供使用尖峰归一化计算翻译效率的综合方案，这对于更深入的跨耳蜗分析至关重要。

在这里，我们描述了多核糖体分析和多核糖体 RNA 分离方案，用于研究热休克应激下 拟南芥 的翻译效率和跨原子分析。该方案用于评估 Col-0 野生型在正常、热休克和恢复后条件下的翻译效率。多核糖体分析结果和多核糖体 RNA 的百分比揭示了 拟南芥 幼苗热应激处理后翻译效率的改变。

研究方案

1. 热应激处理的拟南芥幼苗样品制备

1. 将每个重复和每个条件的 250 种子铺板，滤纸上的滴管放置在不含蔗糖 （pH 5.6） 的 Murashige 和 Skoog （MS） 基础培养基琼脂平板上，补充有 1.2% 植物琼脂。
   注:要在 MS 板上种植幼苗，应在板上放置无菌滤纸，以防止幼苗根部深入培养基，便于采样。然后将种子种植在滤纸的顶部。为了排除糖对植物生长和实验结果的影响，建议使用不含蔗糖的 MS 培养基进行培养。
2. 用铝箔包裹含有种植种子的 MS 板以阻挡光线，并在 4 °C 下孵育 2 天以诱导春化。
3. 将春化种子转移到生长室中，在 22 °C 下在 16 小时:8 小时，光-暗光周期下生长，光强度为 100 μmol/m²/s。
4. 对于热应激样品，用防水胶带密封含有 5 日龄幼苗的 MS 培养基板，并将它们置于 40 °C 水浴中 1 小时。
5. 对于热处理后恢复的样品，热处理后立即冷却板。随后，将它们置于 22 °C 的生长室中 2 小时。
6. 每次重复将 250 株经过处理或未处理的幼苗收获到 1.5 mL 微量离心管中，并立即将样品在液氮中冷冻。
   注:对于每种条件，制备了两组样品。一个用于多核糖体分析分析，另一个用于非多核糖体和多核糖体 RNA 提取。

2. 蔗糖梯度制备

1. 制备含有以下浓度蔗糖的梯度溶液:12.5%、24.4%、36.3%、48.1% 和 60%。溶液组合物包括 50 mM Tris-HCl、25 mM KCl、10 mM MgCl₂、100 μg/mL 肝素和 50 μg/mL 放线菌酮 （CHX）。
2. 从高浓度到低浓度加载梯度溶液，从底部开始向上移动。加入每种浓度的梯度溶液后，先将溶液冷冻至固态，然后再加入下一个浓度。对于每种浓度的蔗糖梯度，添加 2.2 mL。这个过程将导致不连续的蔗糖密度梯度。
3. 将制备的蔗糖梯度暂时储存在 -80 °C，并在使用前在 4 °C 解冻过夜。

3. 多核糖体分析样品制备

1. 使用均质器以 30 次循环/秒的频率研磨 250 株 5 天龄的 Col-0 幼苗，无论是热应激的还是未经处理的，这些幼苗先前已冷冻成粉末，持续 1 分钟。
   注:当具有相同背景的植物数量相等时，它们具有相同的 RNA 提取产量。然而，当比较不同背景的过表达转基因或突变植物时，应根据植物条件调整植物的使用量。
2. 为了获得含有非多核糖体和多核糖体 RNA 的提取溶液，向每个试管中加入 500 μL 多核糖体提取缓冲液（200 mM Tris-HCl，pH 值 8.0,50 mM KCl，25 mM MgCl_2,50 μg/mL 放线菌酮，100 μg/mL 肝素，2% PTE，10% DOC，400 U/mL 核糖核酸酶抑制剂），并通过倒置和涡旋混合样品。确保样品在整个过程中保持在 4 °C。
3. 将提取溶液在 4 °C、12,000 x g 下离心 10 分钟。然后，通过 100 μm 细胞过滤器过滤上清液，以获得透明且无颗粒的提取溶液。
   注:提取溶液中存在的颗粒在超速离心过程中可能会沉淀，可能形成沉淀，从而影响多核糖体分析测量的准确性。
4. 将过滤后的上清液加载到预先制备的蔗糖梯度上，并确保其达到平衡。
   注意:由于超速离心机的转速很高，因此必须确保超速离心机的安全和正常运行。为此，有必要在旋转前确认样品重量相同。因此，我们利用精密天平来验证梯度的权重是否完全均匀。
5. 使用超速离心机摆斗转子，将装有样品的蔗糖梯度在 4 °C、210,000 x g 下离心 3.5 小时。将加速和减速速率设置为最大值。超速离心后，非多核糖体和多核糖体 RNA 根据其密度分布在相应的蔗糖梯度溶液中。
   注:在蔗糖梯度中，密度较低的非多核糖体 RNA 分布在上层，而多核糖体 RNA 的特征是由于存在大量参与 mRNA 活性翻译的核糖体而具有较高的密度，分布在下层。随后，可以使用密度梯度分馏器测量多核糖体分析。

4. 多核糖体分析分析

注:带有微量注射泵的密度梯度分馏器用于测量多核糖体分析。

1. 为微量注射泵准备追逐液（70% 蔗糖、10% 甘油和 0.02% 溴酚蓝）。
2. 使用软件控制密度梯度分馏器。使用去离子水校准机器。校准后，使用它来执行多核糖体分析。
   1. 要执行基线调整，请打开 UV/VISDetector 直到光线从红色变为绿色。调整 Recorder Offset 旋钮以对齐标记线，然后将 Baseline Adjust 旋钮旋转到最小打开位置。将 UV/VIS 检测器上的 Sensitivity 旋钮设置为 2.0 级，然后按下 Auto Baseline 按钮。最后，使用 Recorder Offset 旋钮将所需的基线调整为 20。校准过程将根据机构品牌和不同的样品而有所不同。
3. 超速离心后，使用试管穿刺系统将装有样品的试管放在密度梯度分馏器上，以便将试管连接到带有追逐溶液和 UV 检测器的注射泵。
4. 将密度梯度分馏器切换到软件控制模式 （REMOTE），并将微量注射泵的进样流速设置为 3 mL/min。
5. 启动软件设置，通过测量 OD₂₅₄ 开始使用分馏器获得多核糖体谱图。

5. 非多核糖体和多核糖体 RNA 的分离

注:对于方案的这一部分，在按照与前面描述的相同步骤进行超速离心后，使用来自同一批次的不同样品组。

1. 根据多核糖体谱测量结果，分别收集非多核糖体和多核糖体 RNA 组分。计算非多核糖体和多核糖体部分的溶液体积，并收集非多核糖体部分（上部）。
   注:根据概况，具有两个以上核糖体的馏分定义为多核糖体馏分，而具有 40S、60S 和 80S rRNA 峰的馏分定义为非多核糖体馏分。
2. 将 RNA 的靶组分与预冷的 2x 高盐溶液（400 mM Tris-HCl，pH 8.0,100 mM KCl，50 mM MgCl₂）充分混合。
3. 从试剂盒中加入 8 μL 稀释的真核 Poly-A RNA 对照储备液。
   注意:对于第 7 步所需的 spike-in 标准化。真核生物 Poly-A RNA 对照试剂盒包括植物中不存在的 枯草芽孢杆菌 基因，例如 DAP 基因，作为参考基因。为了确定提取后反应过程中内参基因丢失的比例，在提取前将等量的含有 DAP 基因 RNA 样品的试剂添加到含有非多核糖体或多核糖体 RNA 的不同试管中。这允许确定提取后反应过程中内参基因丢失的比例，并可用于归一化目的。
4. 使用超速离心机摆斗转子在 4 °C、450,000 x g 下离心高盐溶液混合 RNA 5 小时。
5. 超速离心后，RNA 将在离心管底部沉淀。小心地从上方倒出上清液，以保留底部的 RNA 沉淀。
6. 用 500 μL 预冷的焦碳酸二乙酯 （DEPC） 处理过的水快速洗涤 RNA 沉淀，重复此步骤 3 次。
   注:为防止 DEPC 处理过的水在洗涤过程中重新溶解 RNA，有必要在使用前预冷经 DEPC 处理过的水，以降低其溶解度。此外，在洗涤过程中，应尽量减少 DEPC 处理过的水与 RNA 沉淀之间的接触时间。

6. 非多核糖体和多核糖体 RNA 提取

1. 加入 500 μL RNA 提取试剂，与待提取的 RNA 样品混合。孵育 10 分钟。
2. 加入 100 μL 氯仿，充分混合，孵育 10 分钟以进行相分离。
3. 将反应混合物在 4 °C、12,000 x g 下离心 10 分钟。将含有 RNA 的上层透明水层转移到新试管中，与等体积的异丙醇轻轻混合，并在 -20 °C 下孵育 2 小时以进行 RNA 沉淀。
4. 沉淀后，在 4 °C、12,000 x g 下离心 10 分钟。小心丢弃上清液，并将 RNA 沉淀保留在底部。
5. 用 1 mL 预冷的 75% 乙醇洗涤 RNA 沉淀。在 4 °C、12,000 x g 下离心 10 分钟，弃去上清液，并风干 RNA 沉淀。
6. RNA 沉淀干燥后，将 RNA 沉淀重悬于 30 μL DEPC 处理过的水中，并使用全光谱 （220 nm-750 nm） 分光光度计测量 RNA 浓度 （OD₂₆₀）。

7. 尖峰归一化

1. 按照制造商的说明，使用 1000 ng 提取的 RNA 使用 qPCR 试剂盒进行逆转录。非多核糖体 RNA 和多核糖体 RNA 都需要逆转录成 cDNA。
2. 将 1 μL cDNA 与 DAP 基因引物混合，并按照制造商的说明使用 SYBR 缓冲液测量靶基因的表达水平。接下来，使用实时 PCR 检测 DAP 基因表达。
   注意: DAP 基因引物的序列如下:
   正向引物 = 5'-ATA AAA GAA TTC AGC TAA CGC TTC C-3'
   反向引物 = 5'-TTG TTT CTT TGC CTC TAT TGT ATC C-3'
3. 比较测量的非多核糖体和多核糖体 RNA 组中 DAP 基因的表达水平，并在比例丢失的条件下估计 RNA 含量。使用归一化的 RNA 含量，计算多核糖体中 RNA 的比率。

结果

野生型 拟南芥 Col-0 在 MS 培养基上在 16 小时:8 小时的光照光周期下生长。为了进行控制，使用 5 日龄的幼苗，没有热应激处理。热应激组在预热水浴中于 40 °C 下热处理 1 h，恢复组在热处理后立即在 22 °C 下放置 2 h。通过采用不同的热处理条件和回收条件，我们可以利用后续步骤来测量它们的转化效率。

在 RNA 提取之前，必须首先制备蔗糖梯?...

讨论

该协议概述了一种简单且标准化的方法，用于测量拟南芥幼苗的翻译效率。该方案的关键步骤是通过二次离心和 RNA 提取试剂提取以及蔗糖梯度的细致制备来确保 RNA 的稳定性。此外，我们提供了使用加突归一化方法对非多核糖体和多核糖体 RNA 进行归一化和定量的关键步骤。所有程序都应在冰上使用不含 RNase 的缓冲液和工具进行，这一点非常重要。此外，确保蔗糖浓度?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf tube	Labcon	3012-870-000-9	RNA extraction
13.2 mL centrifuge tube	Beckman Coulter	331372	ultracentrifugation
Bromophenol blue	Honeywell	32712	Polysome profile
Chloroform	Honeywell	32211	RNA extraction
Cycloheximide (CHX)	Sigma-Aldrich	SI-C7698	Polysome profile
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	RNA extraction
Ethanol	Sigma-Aldrich	32221	RNA extraction
GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit	Invitrogen	900433	Normalization
Glycerol	Honeywell	15523	Normalization
Heparin	Sigma-Aldrich	SI-H3149	Polysome profile
HiScript III RT SuperMix for qPCR kit	Vazyme	R323-01	Normalization
KCl	J.T.Baker	3040-01	Polysome profile
MgCl2	Sigma-Aldrich	SI-M8266	Polysome profile
MS basal medium	Phyto	M524	Plant culture
Peak Chart Syringe Pump	Brandel	SYN4007LS	Polysome profile
Polyoxyethylene-10-Tridecyl-Ether (PTE)	Sigma-Aldrich	P2393	Polysome profile
RNasin	Promega	N251B	Polysome profile
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	SI-D6750	Polysome profile
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5391	Polysome profile
SYBR Green Supermix	Bio-Rad	BP170-8882	Normalization
TRI reagent	MRC	TR118	RNA extraction
Tris-HCl	J.T.Baker	4109-06	Polysome profile
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-100K	ultracentrifugation
UV/VISDETECTOR	Brandel	UA-6	Polysome profile