Тест на эффективность трансляции с использованием полисомных профилей в условиях теплового напряжения

Резюме

Представленный здесь протокол включает в себя полисомальное профилирование для выделения транслатома, мРНК, связанных с рибосомами, в неполисомальные и полисомальные РНК из Arabidopsis с помощью центрифугирования градиента плотности сахарозы. Этот метод демонстрирует эффективность трансляции термически напряженного арабидопсиса.

Аннотация

Трансляционный контроль различных генов в условиях теплового стресса является критически важным этапом для адаптации растений к окружающей среде. Оценка трансляционной активности различных генов может помочь нам понять молекулярные механизмы, лежащие в основе устойчивости растений, способствуя развитию культур с повышенной стрессоустойчивостью в условиях глобального изменения климата. В данной работе представлена подробная методология оценки эффективности трансляции с помощью полисомного профилирования на предприятиях, подверженных тепловому стрессу. Процедура разделена на три части: обработка термическим стрессом для арабидопсиса, проверка эффективности трансляции с использованием полисомных профилей и расчет эффективности трансляции путем выделения неполисомальной и полисомальной РНК на основе профиля. В первой части растения Arabidopsis подвергаются контролируемому тепловому стрессу, чтобы имитировать проблемы окружающей среды. Обработка включает в себя воздействие на растения высоких температур в течение заданного времени, что обеспечивает постоянную и воспроизводимую индукцию напряжения. Этот шаг имеет решающее значение для изучения физиологических и молекулярных реакций растения на тепловой стресс. Вторая часть включает в себя проверку эффективности трансляции с помощью полисомного профилирования. Полисомы экстрагируются с помощью градиентного центрифугирования сахарозы, которое разделяет мРНК на основе рибосомной нагрузки. Это позволяет исследовать занятость рибосом на мРНК, что дает представление о механизмах трансляционного контроля в условиях стресса. В третьей части РНК выделяется как из полисомных, так и из неполисомальных фракций. Spike-in РНК используется для точного измерения количества РНК в каждой фракции. Расчет эффективности трансляции выполняется путем сравнения распределения мРНК по этим фракциям в нормальных условиях и в условиях теплового стресса. Трансляционную активность конкретных генов дополнительно оценивают путем проведения количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) с рибосом-ассоциированной РНК и общей РНК. Эта методология фокусируется исключительно на эффектах теплового стресса, предоставляя подробный протокол для анализа трансляционной регуляции в растениях.

Введение

Трансляция имеет решающее значение для организмов для синтеза функциональных белков из мРНК, поддерживая основные клеточные функции и биологические процессы, такие как метаболизм и передача сигналов, а также обеспечивая реакцию на стресс. Без трансляции клетки не могут производить жизненно важные белки, что влияет на их структуру, функцию и регуляцию, тем самым влияя на поддержание жизни и способствуя биологическому разнообразию ^1,2. Поэтому изучение трансляционной эффективности растений имеет решающее значение. Перевод включает в себя несколько важных этапов. Во-первых, иници....

протокол

1. Подготовка образца рассады арабидопсиса с термическим стрессом

1. Пластина 250 семян для каждой реплики и каждого состояния с пипеткой на фильтровальной бумаге, помещенной на агаровую пластину Мурашиге и Скуга (MS) без сахарозы (pH 5,6) с добавлением 1,2% фитоагара.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для посадки рассады на пластины MS на пластину кладут стерильную фильтровальную бумагу, чтобы предотвратить проникновение корней рассады глубоко в среду, что облегчает отбор проб. Затем семена высаживают поверх фильтровальной бумаги. Чтобы исключить влияние сахаров на рост растений и резул....

Результаты

Дикий вид Arabidopsis, Col-0, выращивали на среде MS при световом фотопериоде 16 ч:8 ч. Для контроля использовали 5-дневную рассаду без обработки термическим стрессом. Группу теплового стресса подвергали тепловой обработке в течение 1 ч при 40 °С на предварительно нагретой во?.......

Обсуждение

В этом протоколе изложен простой и стандартизированный метод измерения эффективности трансляции сеянцев арабидопсиса. Важнейшими этапами этого протокола являются обеспечение стабильности РНК с помощью вторичного центрифугирования и экстракции РНК реагентом, а та.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf tube	Labcon	3012-870-000-9	RNA extraction
13.2 mL centrifuge tube	Beckman Coulter	331372	ultracentrifugation
Bromophenol blue	Honeywell	32712	Polysome profile
Chloroform	Honeywell	32211	RNA extraction
Cycloheximide (CHX)	Sigma-Aldrich	SI-C7698	Polysome profile
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	RNA extraction
Ethanol	Sigma-Aldrich	32221	RNA extraction
GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit	Invitrogen	900433	Normalization
Glycerol	Honeywell	15523	Normalization
Heparin	Sigma-Aldrich	SI-H3149	Polysome profile
HiScript III RT SuperMix for qPCR kit	Vazyme	R323-01	Normalization
KCl	J.T.Baker	3040-01	Polysome profile
MgCl2	Sigma-Aldrich	SI-M8266	Polysome profile
MS basal medium	Phyto	M524	Plant culture
Peak Chart Syringe Pump	Brandel	SYN4007LS	Polysome profile
Polyoxyethylene-10-Tridecyl-Ether (PTE)	Sigma-Aldrich	P2393	Polysome profile
RNasin	Promega	N251B	Polysome profile
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	SI-D6750	Polysome profile
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5391	Polysome profile
SYBR Green Supermix	Bio-Rad	BP170-8882	Normalization
TRI reagent	MRC	TR118	RNA extraction
Tris-HCl	J.T.Baker	4109-06	Polysome profile
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-100K	ultracentrifugation
UV/VISDETECTOR	Brandel	UA-6	Polysome profile