Test d’efficacité de traduction à l’aide de profils polysomiques sous contrainte thermique

Résumé

Le protocole présenté ici implique un profilage polysomal pour isoler le translatome, ARNm associé aux ribosomes, en ARN non polysomiques et polysomiques d’Arabidopsis par centrifugation à gradient de densité de saccharose. Cette méthode démontre l’efficacité de traduction d’Arabidopsis soumis à un stress thermique.

Résumé

Le contrôle translationnel de différents gènes en stress thermique est une étape critique pour l’adaptation des plantes à l’environnement. L’évaluation des activités translationnelles de divers gènes peut nous aider à comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à la résilience des plantes, contribuant ainsi au développement de cultures avec une tolérance accrue au stress face au changement climatique mondial. Cet article présente une méthodologie détaillée pour évaluer l’efficacité de la traduction par profilage des polysomes dans les plantes exposées à un stress thermique. La procédure est divisée en trois parties : le traitement du stress thermique pour Arabidopsis, le test d’efficacité de traduction à l’aide de profils de polysomes et le calcul de l’efficacité de traduction en isolant les ARN non polysomiques et polysomaux en fonction du profil. Dans la première partie, les plantes d’Arabidopsis sont soumises à des conditions de stress thermique contrôlé pour imiter les défis environnementaux. Le traitement consiste à exposer les plantes à des températures élevées pendant des durées déterminées, assurant une induction de stress constante et reproductible. Cette étape est cruciale pour étudier les réponses physiologiques et moléculaires de la plante au stress thermique. La deuxième partie implique le test d’efficacité de traduction à l’aide du profilage des polysomes. Les polysomes sont extraits par centrifugation par gradient de saccharose, qui sépare les ARNm en fonction de la charge ribosomique. Cela permet d’examiner l’occupation des ribosomes sur les ARNm, ce qui donne un aperçu des mécanismes de contrôle traductionnel dans des conditions de stress. Dans la troisième partie, l’ARN est isolé à partir de fractions polysomiques et non polysomiques. L’ARN de pointe est utilisé pour mesurer avec précision la quantité d’ARN dans chaque fraction. Le calcul de l’efficacité de traduction est effectué en comparant la distribution des ARNm à travers ces fractions dans des conditions normales et de stress thermique. Les activités de traduction de gènes spécifiques sont évaluées en effectuant une PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) avec de l’ARN associé aux ribosomes et de l’ARN total. Cette méthodologie se concentre exclusivement sur les effets du stress thermique, fournissant un protocole détaillé pour l’analyse de la régulation translationnelle chez les plantes.

Introduction

La traduction est cruciale pour que les organismes synthétisent des protéines fonctionnelles à partir de l’ARNm, soutenant les fonctions cellulaires essentielles et les processus biologiques tels que le métabolisme et la signalisation et permettant les réponses au stress. Sans traduction, les cellules ne peuvent pas produire de protéines vitales, ce qui a un impact sur leur structure, leur fonction et leur régulation, affectant ainsi le maintien de la vie et favorisant la diversité biologique ^1,2. Par conséquent, l’étude de l’efficacité translationnelle des plantes est crucial....

Protocole

1. Préparation de l’échantillon de semis d’Arabidopsis traités au stress thermique

1. Plaquez 250 graines pour chaque répétition et chaque condition avec un compte-gouttes sur le papier filtre placé sur la plaque de gélose de milieu basal Murashige et Skoog (MS) sans saccharose (pH 5,6) complétée par 1,2 % de phytoagar.
   REMARQUE : Pour planter des semis sur des plaques MS, du papier filtre stérile est placé sur la plaque pour empêcher les racines des semis de pénétrer profondément dans le milieu, facilitant ainsi l’échantillonnage. Les graines sont ensuite plantées ....

Discussion

Ce protocole décrit une méthode simple et standardisée pour mesurer l’efficacité de la traduction des semis d’Arabidopsis. Les étapes critiques de ce protocole sont d’assurer la stabilité de l’ARN avec la centrifugation secondaire et l’extraction du réactif d’extraction de l’ARN, ainsi que la préparation méticuleuse du gradient de saccharose. De plus, nous fournissons des étapes critiques pour normaliser et quantifier l’ARN non polysomal et polysomique avec la m.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf tube	Labcon	3012-870-000-9	RNA extraction
13.2 mL centrifuge tube	Beckman Coulter	331372	ultracentrifugation
Bromophenol blue	Honeywell	32712	Polysome profile
Chloroform	Honeywell	32211	RNA extraction
Cycloheximide (CHX)	Sigma-Aldrich	SI-C7698	Polysome profile
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	RNA extraction
Ethanol	Sigma-Aldrich	32221	RNA extraction
GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit	Invitrogen	900433	Normalization
Glycerol	Honeywell	15523	Normalization
Heparin	Sigma-Aldrich	SI-H3149	Polysome profile
HiScript III RT SuperMix for qPCR kit	Vazyme	R323-01	Normalization
KCl	J.T.Baker	3040-01	Polysome profile
MgCl2	Sigma-Aldrich	SI-M8266	Polysome profile
MS basal medium	Phyto	M524	Plant culture
Peak Chart Syringe Pump	Brandel	SYN4007LS	Polysome profile
Polyoxyethylene-10-Tridecyl-Ether (PTE)	Sigma-Aldrich	P2393	Polysome profile
RNasin	Promega	N251B	Polysome profile
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	SI-D6750	Polysome profile
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5391	Polysome profile
SYBR Green Supermix	Bio-Rad	BP170-8882	Normalization
TRI reagent	MRC	TR118	RNA extraction
Tris-HCl	J.T.Baker	4109-06	Polysome profile
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-100K	ultracentrifugation
UV/VISDETECTOR	Brandel	UA-6	Polysome profile