בדיקת יעילות תרגום באמצעות פרופילי פוליזום תחת לחץ חום

Summary

הפרוטוקול המוצג כאן כולל פרופיל פוליזומלי כדי לבודד טרנסלטום, mRNA הקשור לריבוזומים, לרנ"א לא פוליזומלי ופוליזומלי מארבידופסיס באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז. שיטה זו מדגימה את יעילות התרגום של Arabidopsis בלחץ חום.

Abstract

בקרה תרגומית של גנים שונים תחת עקת חום היא צעד קריטי להסתגלות הצמח לסביבה. הערכת הפעילויות התרגומי של גנים שונים יכולה לעזור לנו להבין את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס עמידות הצמח, ולתרום להתפתחות יבולים עם עמידות משופרת לעקה לנוכח שינויי האקלים העולמיים. מאמר זה מציג מתודולוגיה מפורטת להערכת יעילות התרגום באמצעות פרופיל פוליזום בצמחים החשופים לעקת חום. ההליך מחולק לשלושה חלקים: טיפול בלחץ חום עבור Arabidopsis, בדיקת יעילות תרגום באמצעות פרופילים polysome, וחישוב יעילות התרגום על ידי בידוד RNA לא פוליסומלי ו polysomal על בסיס הפרופיל. בחלק הראשון, צמחי Arabidopsis נתונים לתנאי עקת חום מבוקרת כדי לחקות אתגרים סביבתיים. הטיפול כולל חשיפת הצמחים לטמפרטורות גבוהות לפרקי זמן מוגדרים, מה שמבטיח השראת עקה עקבית וניתנת לשחזור. שלב זה חיוני לחקר התגובות הפיזיולוגיות והמולקולריות של הצמח לעקה של חום. החלק השני כולל את בדיקת יעילות התרגום באמצעות פרופיל פוליזום. פוליזומים מופקים באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של סוכרוז, אשר מפרידה mRNA על בסיס עומס ריבוזומלי. זה מאפשר לבחון את תפוסת הריבוזום על mRNAs, ומספק תובנות לגבי מנגנוני הבקרה התרגומי בתנאי עקה. בחלק השלישי, RNA מבודד משני שברים פוליזומליים ולא פוליזומליים. Spike-in RNA משמש למדידה מדויקת של כמות הרנ"א בכל שבר. חישוב יעילות התרגום מתבצע על ידי השוואת התפלגות ה-mRNA על פני שברים אלה בתנאי עקה נורמלית ובתנאי עקת חום. פעילויות התרגום של גנים ספציפיים מוערכות עוד יותר על ידי ביצוע PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR) עם RNA הקשור לריבוזום ורנ"א כולל. מתודולוגיה זו מתמקדת אך ורק בהשפעות של עקת חום, ומספקת פרוטוקול מפורט לניתוח רגולציה תרגומית בצמחים.

Introduction

תרגום חיוני לאורגניזמים כדי לסנתז חלבונים פונקציונליים מ-mRNA, לתמוך בתפקודים תאיים חיוניים ובתהליכים ביולוגיים כמו חילוף חומרים ואיתות ולאפשר תגובות עקה. ללא תרגום, תאים אינם יכולים לייצר חלבונים חיוניים, המשפיעים על מבנהם, תפקודם וויסותם, ובכך משפיעים על קיום החיים ומטפחים מגוון ביולוגי ^1,2. לכן, לימוד היעילות התרגומית של צמחים הוא חיוני. תרגום כרוך במספר שלבים חיוניים. ראשית, האתחול מתרחש כאשר mRNA נקשר לריבוזום, המתאפשר על ידי גורמי אתחול כגון eIFs באיקריוטים, המזהים את קודון ההתחלה, בדרך כלל AUG. לאחר מכן, ההתארכות מתרחשת כאשר מולקולות RNA העברה (tRNA), שכל אחת מהן נושאת ....

Protocol

1. הכנת שתיל שתיל Arabidopsis מטופל בחום

1. צלחת 250 זרעים עבור כל משוכפל וכל מצב עם טפטפת על נייר סינון מונח על צלחת אגר מדיה בסיסית Murashige ו Skoog (MS) ללא סוכרוז (pH 5.6) בתוספת 1.2% phytoagar.
   הערה: כדי לשתול שתילים על לוחות MS, נייר סינון סטרילי מונח על הצלחת כדי למנוע משורשי שתילים לחדור עמוק לתוך המדיום, מה שמקל על הדגימה. לאחר מכן זורעים זרעים על גבי נייר הסינון. כדי למנוע את השפעת הסוכרים על גדילת הצמח ותוצאות הניסוי, מומלץ להשתמש במדיום טרשת נפוצה שאינו מכיל סוכרוז לגידול.
2. עטפו את צלחת הטרשת הנפוצה המכילה זרעים נטועים ברדיד אלומיניום כדי לחסום....

תוצאות

הסוג הפראי של ארבידופסיס, Col-0, גודל בתווך טרשת נפוצה תחת פוטופריוד אור של 16 שעות:8 שעות. לצורך הבקרה נעשה שימוש בשתילים בני 5 ימים ללא טיפול בלחץ חום. קבוצת עקת החום עברה שעה אחת של טיפול בחום ב 40 מעלות צלזיוס באמבט מים שחומם מראש, ואילו קבוצת ההתאוששות הונחה על 22 מעלות צ.......

Discussion

פרוטוקול זה מתווה שיטה פשוטה וסטנדרטית למדידת יעילות התרגום של שתילי ארבידופסיס. השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה הם הבטחת יציבות RNA עם צנטריפוגה משנית ומיצוי מגיב מיצוי RNA, כמו גם הכנה קפדנית של שיפוע הסוכרוז. יתר על כן, אנו מספקים צעדים קריטיים לנרמול וכימות הרנ"א הלא פול?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf tube	Labcon	3012-870-000-9	RNA extraction
13.2 mL centrifuge tube	Beckman Coulter	331372	ultracentrifugation
Bromophenol blue	Honeywell	32712	Polysome profile
Chloroform	Honeywell	32211	RNA extraction
Cycloheximide (CHX)	Sigma-Aldrich	SI-C7698	Polysome profile
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	RNA extraction
Ethanol	Sigma-Aldrich	32221	RNA extraction
GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit	Invitrogen	900433	Normalization
Glycerol	Honeywell	15523	Normalization
Heparin	Sigma-Aldrich	SI-H3149	Polysome profile
HiScript III RT SuperMix for qPCR kit	Vazyme	R323-01	Normalization
KCl	J.T.Baker	3040-01	Polysome profile
MgCl2	Sigma-Aldrich	SI-M8266	Polysome profile
MS basal medium	Phyto	M524	Plant culture
Peak Chart Syringe Pump	Brandel	SYN4007LS	Polysome profile
Polyoxyethylene-10-Tridecyl-Ether (PTE)	Sigma-Aldrich	P2393	Polysome profile
RNasin	Promega	N251B	Polysome profile
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	SI-D6750	Polysome profile
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5391	Polysome profile
SYBR Green Supermix	Bio-Rad	BP170-8882	Normalization
TRI reagent	MRC	TR118	RNA extraction
Tris-HCl	J.T.Baker	4109-06	Polysome profile
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-100K	ultracentrifugation
UV/VISDETECTOR	Brandel	UA-6	Polysome profile