בדיקת יעילות תרגום באמצעות פרופילי פוליזום תחת לחץ חום

Summary

הפרוטוקול המוצג כאן כולל פרופיל פוליזומלי כדי לבודד טרנסלטום, mRNA הקשור לריבוזומים, לרנ"א לא פוליזומלי ופוליזומלי מארבידופסיס באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז. שיטה זו מדגימה את יעילות התרגום של Arabidopsis בלחץ חום.

Abstract

בקרה תרגומית של גנים שונים תחת עקת חום היא צעד קריטי להסתגלות הצמח לסביבה. הערכת הפעילויות התרגומי של גנים שונים יכולה לעזור לנו להבין את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס עמידות הצמח, ולתרום להתפתחות יבולים עם עמידות משופרת לעקה לנוכח שינויי האקלים העולמיים. מאמר זה מציג מתודולוגיה מפורטת להערכת יעילות התרגום באמצעות פרופיל פוליזום בצמחים החשופים לעקת חום. ההליך מחולק לשלושה חלקים: טיפול בלחץ חום עבור Arabidopsis, בדיקת יעילות תרגום באמצעות פרופילים polysome, וחישוב יעילות התרגום על ידי בידוד RNA לא פוליסומלי ו polysomal על בסיס הפרופיל. בחלק הראשון, צמחי Arabidopsis נתונים לתנאי עקת חום מבוקרת כדי לחקות אתגרים סביבתיים. הטיפול כולל חשיפת הצמחים לטמפרטורות גבוהות לפרקי זמן מוגדרים, מה שמבטיח השראת עקה עקבית וניתנת לשחזור. שלב זה חיוני לחקר התגובות הפיזיולוגיות והמולקולריות של הצמח לעקה של חום. החלק השני כולל את בדיקת יעילות התרגום באמצעות פרופיל פוליזום. פוליזומים מופקים באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של סוכרוז, אשר מפרידה mRNA על בסיס עומס ריבוזומלי. זה מאפשר לבחון את תפוסת הריבוזום על mRNAs, ומספק תובנות לגבי מנגנוני הבקרה התרגומי בתנאי עקה. בחלק השלישי, RNA מבודד משני שברים פוליזומליים ולא פוליזומליים. Spike-in RNA משמש למדידה מדויקת של כמות הרנ"א בכל שבר. חישוב יעילות התרגום מתבצע על ידי השוואת התפלגות ה-mRNA על פני שברים אלה בתנאי עקה נורמלית ובתנאי עקת חום. פעילויות התרגום של גנים ספציפיים מוערכות עוד יותר על ידי ביצוע PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR) עם RNA הקשור לריבוזום ורנ"א כולל. מתודולוגיה זו מתמקדת אך ורק בהשפעות של עקת חום, ומספקת פרוטוקול מפורט לניתוח רגולציה תרגומית בצמחים.

Introduction

תרגום חיוני לאורגניזמים כדי לסנתז חלבונים פונקציונליים מ-mRNA, לתמוך בתפקודים תאיים חיוניים ובתהליכים ביולוגיים כמו חילוף חומרים ואיתות ולאפשר תגובות עקה. ללא תרגום, תאים אינם יכולים לייצר חלבונים חיוניים, המשפיעים על מבנהם, תפקודם וויסותם, ובכך משפיעים על קיום החיים ומטפחים מגוון ביולוגי ^1,2. לכן, לימוד היעילות התרגומית של צמחים הוא חיוני. תרגום כרוך במספר שלבים חיוניים. ראשית, האתחול מתרחש כאשר mRNA נקשר לריבוזום, המתאפשר על ידי גורמי אתחול כגון eIFs באיקריוטים, המזהים את קודון ההתחלה, בדרך כלל AUG. לאחר מכן, ההתארכות מתרחשת כאשר מולקולות RNA העברה (tRNA), שכל אחת מהן נושאת חומצות אמינו ספציפיות, נקשרות ברצף לריבוזום. קשרים פפטידים נוצרים בין חומצות אמינו סמוכות, מאריכים את שרשרת הפוליפפטיד על פי רצף mRNA. לבסוף, הסיום מתחיל עם מפגש עם קודון עצירה (UAA, UAG או UGA), המוכר על ידי גורמי שחרור המניעים את הריבוזום לשחרר את החלבון המסונתז החדש. במהלך התרגום, גורמי אתחול אאוקריוטים שונים (eIFs), גורמי התארכות ורנ"א ריבוזומלי פועלים יחד כדי להבטיח דיוק ויעילות ^3,4.

מחקרים קודמים הצביעו על כך ששינויים לאחר תרגום ממלאים תפקיד קריטי בוויסות אינטראקציות בין eIFs ובכך משפיעים על יעילות התרגום. מחקר במבחנה גילה כי CASEIN KINASE 2 (CK2) קינאז פוספורילטים eIF3c, eIF5 ו- eIF2β כדי להגביר את האינטראקציות שלהם אחד עם השני ועם eIF1 ^5,6. בחושך, E3 ligase CONSTITUTIVELY PHOTOMORPHOGENIC 1 (COP1) מדכא את התרגום על ידי עיכוב זרחן בתיווך TOR של S6K-RPS6. RPS6 שאינו פוספורילציה אינו מסוגל ליצור ריבוזומים פונקציונליים, ובכך מפסיק את תרגום⁷. לעומת זאת, בתנאי אור, המדכא של PHYA 105 (SPA1) קינאז פוספורילטים eIF2α כדי להקל על הרכבה מורכבת eIF2 ולקדם אתחול תרגום⁸. ממצאים אלה מדגישים את מנגנוני הבקרה המורכבים המווסתים את התרגום בתגובה לאותות סביבתיים.

גירויים סביבתיים מתונים יכולים לקדם ביעילות תהליכי תרגום כדי להקל על הצמיחה, כגון פוטומורפוגנזה ^8,9. עם זאת, כאשר גורמים סביבתיים הם מוגזמים, צמחים חסרי תנועה צריכים לפתח מנגנוני ויסות מתאימים כדי להפחית את הנזק שנגרם על ידי לחץ סביבתי¹⁰. במחקרים קודמים הקשורים לתגובות עקה של צמחים, הרוב התמקדו בוויסות ברמה המטבולית, ההורמונלית והשעתוק 11,12,13,14. עם זאת, מחקרים אחרונים החלו להדגיש את ההשפעה של רגולציה תרגומית על עמידות לעקה צמחית 15,16,17. צמחים יכולים להגביר את עמידות העקה שלהם על ידי הפחתת יעילות התרגום, ובכך למזער צריכת אנרגיה מיותרת. בשל היווצרותם של גרגרי עקה לא ממברניים בתאי צמחים, mRNA לא מתורגם וחלבונים הקשורים אליהם מצטברים בתוכם כדי להפחית את יעילות התרגום¹⁸. אחת העקות הסביבתיות הנפוצות שצמחים נתקלים בהן לעתים קרובות היא עקת חום, אשר דווחה כגורמת להיווצרות גרגרי עקה בתוך תאי הצמח^19,20. העלייה העולמית בטמפרטורות הממוצעות עקב ההתחממות הגלובלית פוגעת קשות ביבול²¹. לכן, חקר הוויסות הפיזיולוגי של צמחים תחת עקת חום הוא חיוני. מחקר קודם הראה כי טיפול בחום של חיטה הביא לירידה ב-mRNA הקשור לפוליזום. עם זאת, mRNA שאוחסנו בגרגרי לחץ שוחררו ונקשרו מחדש לריבוזומים, מה שהקל על התרגום לאחר ההחלמה²². בנוסף, מחקרים קודמים השוו ביטוי גנים בין mRNA כולל לבין mRNA הקשור לפוליזום בצמחים שקועים¹⁶. התוצאות הצביעו על כך שרמות ה-mRNA במצב יציב הקשורות לחומצה אבסציסית ולתגובות עקה אביוטיות עלו מעט לאחר השקיעה. יתר על כן, כמות mRNA הקשורים לפוליזום גדלה באופן משמעותי. תוצאות אלה מצביעות על כך שרגולציה של תרגום עשויה למלא תפקיד קריטי יותר בשליטה על עמידות לעקה בצמחים. לכן, שיטת בידוד RNA פוליזומלית יעילה חיונית לחקר הטרנסלטום של דגימות שטופלו בלחץ.

בפרוטוקול זה, שינינו את שיטת בידוד הרנ"א משיטת מיצוי פנול/כלורופורם בסיכון גבוה ונפח עם משקעים LiCl לשיטת מיצוי פנול/גואנידיניום תיוציאנט בקנה מידה קטן, הדורשת פחות נפח. השיטה הראשונה כוללת ערבוב ישיר עם שברים פוליזומליים, וכתוצאה מכך פסולת ניסיונית גדולה יותר ^9,15,23. לעומת זאת, גישה שונה זו משתמשת בעקרונות צפיפות דיפרנציאלית: רנ"א פוליזומלי מעורבב תחילה עם תמיסה עתירת מלח וללא סוכר ולאחר מכן מואץ על ידי אולטרה-צנטריפוגה. לאחר מכן, מיצוי RNA מבוצע באמצעות נפח קטן של מגיב פנול/גואנידיניום תיוציאנט. שיטה זו מפחיתה ביעילות את ייצור הפסולת האורגנית, מה שהופך את הניסוי שלנו לידידותי יותר לסביבה. בנוסף, הממסים האורגניים המשמשים הם בעלי רעילות נמוכה יותר. סיבות אלה הובילו אותנו להתאים ולשפר את הליכי הניסוי בהתאם. בנוסף, שיטות קודמות לא סיפקו פרוטוקול מקיף לחישוב יעילות התרגום באמצעות נורמליזציה של ספייק-אין, שהיא חיונית לניתוחים טרנסלאטומיים מעמיקים יותר.

במאמר זה אנו מתארים פרופיל פוליזום ופרוטוקול בידוד RNA פוליזומלי לחקירת יעילות תרגום ואנליזות טרנסלאטומיות בארבידופסיס תחת לחץ הלם חום. פרוטוקול זה שימש להערכת יעילות התרגום בסוג הבר Col-0 בתנאים רגילים, הלם חום ולאחר התאוששות. תוצאות פרופיל פוליזום ואחוז הרנ"א הפוליזומלי גילו שינויים ביעילות התרגום בעקבות טיפול בעקת חום בשתילי ארבידופסיס .

Protocol

1. הכנת שתיל שתיל Arabidopsis מטופל בחום

1. צלחת 250 זרעים עבור כל משוכפל וכל מצב עם טפטפת על נייר סינון מונח על צלחת אגר מדיה בסיסית Murashige ו Skoog (MS) ללא סוכרוז (pH 5.6) בתוספת 1.2% phytoagar.
   הערה: כדי לשתול שתילים על לוחות MS, נייר סינון סטרילי מונח על הצלחת כדי למנוע משורשי שתילים לחדור עמוק לתוך המדיום, מה שמקל על הדגימה. לאחר מכן זורעים זרעים על גבי נייר הסינון. כדי למנוע את השפעת הסוכרים על גדילת הצמח ותוצאות הניסוי, מומלץ להשתמש במדיום טרשת נפוצה שאינו מכיל סוכרוז לגידול.
2. עטפו את צלחת הטרשת הנפוצה המכילה זרעים נטועים ברדיד אלומיניום כדי לחסום את האור ולדגור עליה ב -4 מעלות צלזיוס למשך יומיים כדי לגרום לוורנליזציה.
3. מעבירים את הזרעים הוורנליים לתא גדילה לגידול מתחת ל-16 שעות: 8 שעות, פוטופריוד בהיר-כהה ב-22°C עם עוצמת אור של 100 μmol/m²/s.
4. לדגימות לחץ חום, אטמו את הצלחות הבינוניות של MS המכילות שתילים בני 5 ימים עם סרט דבק עמיד למים והניחו אותם באמבט מים של 40 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
5. עבור דגימות המתאוששות לאחר טיפול בחום, יש לקרר את הצלחות מיד לאחר הטיפול בחום. לאחר מכן, מניחים אותם בתא צמיחה ב 22 ° C במשך 2 שעות.
6. לקצור 250 שתילים עם מטופלים או לא מטופלים לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות 1.5 מ"ל עבור כל לשכפל ולהקפיא את הדגימות בחנקן נוזלי מיד.
   הערה: עבור כל תנאי הוכנו שתי קבוצות דגימות. האחד מיועד לניתוחי פרופיל פוליזומים, והשני מיועד למיצוי RNA לא פוליזומלי ופוליזומלי.

2. הכנת מדרג סוכרוז

1. הכינו את תמיסת השיפוע המכילה את הריכוזים הבאים של סוכרוז: 12.5%, 24.4%, 36.3%, 48.1% ו-60%. הרכב התמיסה כולל 50 mM Tris-HCl, 25 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 100 μg/mL Heparin, ו-50 μg/mL cycloheximide (CHX).
2. טען את תמיסות השיפוע מריכוז גבוה לנמוך, החל מלמטה ונע כלפי מעלה. לאחר הוספת כל ריכוז של תמיסת שיפוע, מקפיאים את התמיסה למצב מוצק לפני הוספת הריכוז הבא. עבור כל ריכוז של שיפוע סוכרוז, להוסיף 2.2 מ"ל. תהליך זה יגרום לשיפוע צפיפות סוכרוז לא רציף.
3. יש לאחסן את שיפוע הסוכרוז המוכן באופן זמני בטמפרטורה של -80°C ולהפשיר למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C לפני השימוש.

3. הכנת מדגם פרופיל פוליזום

1. טחנו 250 שתילי Col-0 בני 5 ימים, בין אם במצוקת חום או לא מטופלים, שהוקפאו בעבר לאבקה באמצעות הומוגנייזר בתדירות של 30 מחזורים לשנייה למשך דקה.
   הערה: כאשר מספר הצמחים עם אותו רקע שווה, יש להם אותה תפוקת מיצוי RNA. עם זאת, כאשר משווים ביטוי יתר של צמחים טרנסגניים או מוטנטיים בעלי רקע שונה, יש להתאים את כמות הצמחים המשמשים בהתאם לתנאי הצמח.
2. כדי לקבל תמיסת מיצוי המכילה RNA לא פוליזומלי ופוליזומלי, הוסף 500 μL של חיץ מיצוי פוליזום (200 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM KCl, 25 mM MgCl₂, 50 μg / mL cycloheximide, 100 μg / mL הפרין, 2% PTE, 10% DOC, 400 U/mL מעכב ריבונוקלאז) לכל צינור, וערבב את הדגימות על ידי היפוך ומערבול. ודא כי הדגימות נשמרות ב 4 ° C לאורך כל התהליך.
3. צנטריפוגה את תמיסת השאיבה ב 4 ° C, 12,000 x גרם במשך 10 דקות. לאחר מכן, סנן את הסופרנאטנט דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר כדי לקבל תמיסת מיצוי ברורה ונטולת חלקיקים.
   הערה: החלקיקים הנמצאים בתמיסת המיצוי עשויים לשקוע במהלך אולטרה-צנטריפוגה, מה שעלול ליצור גלולה שעלולה להשפיע על הדיוק של מדידות פרופיל פוליזום.
4. העמיסו את הסופרנאטנט המסונן על שיפוע סוכרוז שהוכן מראש וודאו שהוא מגיע לשיווי משקל.
   הערה: בשל מהירות הסיבוב הגבוהה של האולטרה-צנטריפוגה, חיוני להבטיח הן בטיחות והן תפקוד תקין של האולטרה-צנטריפוגה. כדי להשיג זאת, יש צורך לאשר כי משקלי המדגם זהים לפני סיבוב. לכן, אנו משתמשים באיזון מדויק כדי לוודא שמשקולות השיפועים אחידות לחלוטין.
5. צנטריפוגה שיפוע הסוכרוז טעון בדגימות ב 4 ° C, 210,000 x גרם במשך 3.5 שעות באמצעות רוטור דלי מתנדנד אולטרה צנטריפוגה. הגדר את קצבי ההאצה וההאטה למקסימום. לאחר אולטרהצנטריפוגה, RNA לא פוליזומלי ופוליזומלי מופצים על פי צפיפותם בתמיסת שיפוע הסוכרוז המתאימה.
   הערה: בשיפוע הסוכרוז, RNA לא פוליזומלי עם צפיפות נמוכה יותר מתפשט בשכבה העליונה, בעוד RNA פוליזומלי, המאופיין בצפיפות גבוהה יותר בשל נוכחותם של ריבוזומים רבים העוסקים בתרגום פעיל על mRNA, מתפשט בשכבה התחתונה. לאחר מכן, פרופיל פוליזום ניתן למדוד באמצעות מקטע שיפוע צפיפות.

4. ניתוח פרופיל פוליזום

הערה: מקטע שיפוע צפיפות עם משאבת מזרק מיקרו-נפח משמש למדידת פרופיל פוליזום.

1. הכינו את תמיסת המרדף (70% סוכרוז, 10% גליצרול ו-0.02% ברומופנול כחול) למשאבת מזרק מיקרו-נפח.
2. השתמש בתוכנה כדי לשלוט במקטע מעבר הצבע של הצפיפות. כיול המכונה באמצעות מים שעברו דה-יוניזציה. לאחר הכיול, השתמש בו כדי לבצע פרופיל פוליזום.
   1. כדי לבצע כוונון קו בסיס, הפעל את UV/VISDetector עד שהנורית תשתנה מאדום לירוק. כוונן את ידית הסטת המקליט כדי ליישר את קו הסמן, ולאחר מכן סובב את ידית התאמת קו הבסיס למצב הפתיחה המינימלי. הגדר את ידית הרגישות ב- UV/VISDETECTOR לרמה 2.0 ולחץ על הלחצן Auto Baseline . לבסוף, השתמש בידית היסט המקליט כדי להתאים את קו הבסיס הרצוי ל- 20. התהליך המכויל ישתנה בהתאם למותג המנגנון ולדגימות השונות.
3. לאחר אולטרה-צנטריפוגה, הניחו את הצינורות עם הדגימות על מקטע שיפוע הצפיפות באמצעות מערכת פירסינג הצינור כך שניתן יהיה לחבר את הצינור למשאבת המזרק באמצעות תמיסת המרדף וגלאי UV.
4. העבר את מקטע שיפוע הצפיפות למצב בקרת תוכנה (REMOTE) והגדר את קצב זרימת ההזרקה של משאבת מזרק המיקרו-נפח ל- 3 מ"ל/דקה.
5. הפעל את הגדרות התוכנה כדי להתחיל ולקבל את גרף פרופיל הפוליזום באמצעות המקטע על-ידי מדידת OD₂₅₄.

5. בידוד RNA לא פוליזומלי ופוליזומלי

הערה: עבור חלק זה של הפרוטוקול, נעשה שימוש בקבוצה שונה של דגימות מאותה אצווה לאחר ביצוע אולטרה-צנטריפוגה בעקבות אותם שלבים כפי שתואר קודם לכן.

1. בהתבסס על תוצאות מדידת פרופיל הפוליזום, אספו בנפרד את שברי ה-RNA הלא-פוליזומליים והפוליזומליים. חשב את נפחי התמיסה עבור שברים לא פוליזומליים ופוליזומליים כאחד ואסוף את החלק הלא פוליזומלי (החלק העליון).
   הערה: על פי הפרופילים, השבר עם יותר משני ריבוזומים מוגדר כשבר פוליזומלי, ואילו השבר עם פסגות rRNA 40S, 60S ו-80S מוגדר כשבר לא פוליזומלי.
2. ערבבו היטב את שברי המטרה של RNA עם תמיסת מלח גבוהה 2x קרה מראש (400 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM KCl, 50 mM MgCl₂).
3. הוסף 8 μL של מלאי מדולל של Eukaryotic Poly-A RNA Control מהערכה.
   הערה: עבור הנורמליזציה המהירה הנדרשת לשלב השביעי. ערכת בקרת הרנ"א Poly-A האיקריוטי כוללת גנים מסוג B. subtilis , כגון הגן DAP שאינם קיימים בצמחים, כגני ייחוס. כדי לקבוע את שיעור אובדן גן הייחוס במהלך התגובה לאחר החילוץ, הוסף כמות שווה של מגיב המכיל דגימת RNA של גן DAP לצינורות שונים עם RNA לא פוליסומלי או פוליזומלי לפני החילוץ. זה מאפשר לקבוע את שיעור אובדן גן הייחוס במהלך התגובה לאחר מיצוי והוא יכול לשמש למטרות נורמליזציה.
4. צנטריפוגה תמיסת מלח גבוהה מעורבב RNA ב 4 ° C, 450,000 x גרם, במשך 5 שעות באמצעות רוטור דלי מתנדנד אולטרה צנטריפוגה.
5. לאחר אולטרה-צנטריפוגה, RNA יזרז בתחתית צינור הצנטריפוגה. מוזגים בזהירות את הסופרנאטנט מלמעלה כדי לשמר את כדורית הרנ"א בתחתית.
6. שטפו במהירות את גלולת הרנ"א עם 500 מיקרוליטר של מים שטופלו בדיאתילפירוקרבונט (DEPC) לפני הקור, וחזרו על שלב זה 3x.
   הערה: כדי למנוע ממים שטופלו ב-DEPC להמיס מחדש את הרנ"א במהלך תהליך הכביסה, יש צורך לקרר מראש את המים שטופלו ב-DEPC לפני השימוש כדי להפחית את מסיסותם. בנוסף, יש למזער את זמן המגע בין המים המטופלים ב-DEPC לבין כדורי ה-RNA במהלך הכביסה.

6. מיצוי RNA לא פוליזומלי ופוליזומלי

1. הוסף 500 μL של מגיב מיצוי RNA וערבב עם דגימת RNA לחילוץ. דוגרים במשך 10 דקות.
2. מוסיפים 100 מיקרוליטר כלורופורם, מערבבים היטב ודגרים במשך 10 דקות להפרדת פאזות.
3. צנטריפוגה את תערובת התגובה ב 4 ° C, 12,000 x גרם במשך 10 דקות. מעבירים את השכבה המימית השקופה העליונה המכילה RNA לצינור חדש, מערבבים אותה בעדינות עם נפח שווה של איזופרופנול, ודגרים ב -20 ° C למשך שעתיים עבור משקעים RNA.
4. לאחר משקעים, צנטריפוגה ב 4 °C (75 °F), 12,000 x גרם במשך 10 דקות. בזהירות להשליך את supernatant ולשמור את גלולת RNA בתחתית.
5. לשטוף את גלולת RNA עם 1 מ"ל של טרום קר 75% אתנול. צנטריפוגה בטמפרטורה של 4°C, 12,000 x g למשך 10 דקות, השליכו את הסופרנטנט וייבשו באוויר את כדורית ה-RNA.
6. לאחר ייבוש כדורית הרנ"א, יש להשהות מחדש את כדורית הרנ"א ב-30 מיקרוליטר מים שטופלו ב-DEPC ולמדוד את ריכוז הרנ"א (OD₂₆₀) באמצעות ספקטרופוטומטר בספקטרום מלא (220-750 ננומטר).

7. נורמליזציה מהירה

1. השתמש 1000 ng של RNA מופק עבור שעתוק לאחור נעשה באמצעות ערכת qPCR בהתאם להוראות היצרן. גם RNA לא פוליזומלי וגם רנ"א פוליזומלי צריכים להיות משועתקים לאחור ל-cDNA.
2. ערבבו 1 μL של cDNA עם פריימרים של גן DAP והשתמשו במאגר SYBR כדי למדוד את רמת הביטוי של גן המטרה בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, השתמש ב- PCR בזמן אמת כדי לזהות ביטוי גנים DAP .
   הערה: רצפים של פריימרים של גן DAP הם כדלקמן:
   פריימר קדמי = 5'-ATA AAA GAA TTC AGC TAA CGC TTC C-3'
   פריימר הפוך = 5'-TTG TTT CTT TGC CTC TAT TGT ATC C-3'
3. השווה את רמות הביטוי של גני DAP בקבוצות ה-RNA הלא-פוליזומליות והפוליסומליות שנמדדו והערך את תכולת ה-RNA בתנאים של אובדן פרופורציונלי. באמצעות תוכן RNA מנורמל, לחשב את היחס של RNA פוליזומים.

תוצאות

הסוג הפראי של ארבידופסיס, Col-0, גודל בתווך טרשת נפוצה תחת פוטופריוד אור של 16 שעות:8 שעות. לצורך הבקרה נעשה שימוש בשתילים בני 5 ימים ללא טיפול בלחץ חום. קבוצת עקת החום עברה שעה אחת של טיפול בחום ב 40 מעלות צלזיוס באמבט מים שחומם מראש, ואילו קבוצת ההתאוששות הונחה על 22 מעלות צ...

Discussion

פרוטוקול זה מתווה שיטה פשוטה וסטנדרטית למדידת יעילות התרגום של שתילי ארבידופסיס. השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה הם הבטחת יציבות RNA עם צנטריפוגה משנית ומיצוי מגיב מיצוי RNA, כמו גם הכנה קפדנית של שיפוע הסוכרוז. יתר על כן, אנו מספקים צעדים קריטיים לנרמול וכימות הרנ"א הלא פול?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf tube	Labcon	3012-870-000-9	RNA extraction
13.2 mL centrifuge tube	Beckman Coulter	331372	ultracentrifugation
Bromophenol blue	Honeywell	32712	Polysome profile
Chloroform	Honeywell	32211	RNA extraction
Cycloheximide (CHX)	Sigma-Aldrich	SI-C7698	Polysome profile
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	RNA extraction
Ethanol	Sigma-Aldrich	32221	RNA extraction
GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit	Invitrogen	900433	Normalization
Glycerol	Honeywell	15523	Normalization
Heparin	Sigma-Aldrich	SI-H3149	Polysome profile
HiScript III RT SuperMix for qPCR kit	Vazyme	R323-01	Normalization
KCl	J.T.Baker	3040-01	Polysome profile
MgCl2	Sigma-Aldrich	SI-M8266	Polysome profile
MS basal medium	Phyto	M524	Plant culture
Peak Chart Syringe Pump	Brandel	SYN4007LS	Polysome profile
Polyoxyethylene-10-Tridecyl-Ether (PTE)	Sigma-Aldrich	P2393	Polysome profile
RNasin	Promega	N251B	Polysome profile
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	SI-D6750	Polysome profile
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5391	Polysome profile
SYBR Green Supermix	Bio-Rad	BP170-8882	Normalization
TRI reagent	MRC	TR118	RNA extraction
Tris-HCl	J.T.Baker	4109-06	Polysome profile
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-100K	ultracentrifugation
UV/VISDETECTOR	Brandel	UA-6	Polysome profile