ポリソームプロファイルを用いた熱ストレス下での翻訳効率試験

要約

ここで紹介するプロトコールは、ショ糖密度勾配遠心分離により 、シロイヌナズナからトランス ラトーム、リボソームに関連するmRNAを非ポリソームおよびポリソームRNAに単離するためのポリソームプロファイリングを含みます。この方法は、熱ストレスを受けた シロイヌナズナの翻訳効率を示しています。

要約

熱ストレス下での異なる遺伝子の翻訳制御は、植物が環境に適応するための重要なステップです。さまざまな遺伝子の翻訳活性を評価することは、植物のレジリエンスを支える分子メカニズムを理解するのに役立ち、地球規模の気候変動に直面してもストレス耐性が強化された作物の開発に貢献します。この論文では、熱ストレスにさらされた植物におけるポリソームプロファイリングによる翻訳効率を評価するための詳細な方法論を紹介します。 手順は、シロイヌナズナの熱ストレス治療、ポリソームプロファイルを用いた翻訳効率試験、プロファイルに基づく非ポリソームRNAとポリソームRNAを単離することによる翻訳効率の計算の3つに分かれています。最初の部分では、 シロイヌナズ ナの植物は、環境の課題を模倣するために制御された熱ストレス条件にさらされます。この処理には、植物を指定された時間高温にさらすことが含まれ、一貫性と再現性のある応力誘導が保証されます。このステップは、熱ストレスに対する植物の生理学的および分子的応答を研究するために重要です。第2部では、ポリソームプロファイリングを用いた翻訳効率試験を行います。ポリソームは、リボソーム負荷に基づいてmRNAを分離するショ糖勾配遠心分離によって抽出されます。これにより、mRNA上のリボソーム占有率を調べることができ、ストレス条件下での翻訳制御メカニズムに関する洞察が得られます。第3部では、RNAはポリソーム画分と非ポリソーム画分の両方から単離されます。スパイクインRNAは、各画分中のRNAの量を正確に測定するために使用されます。翻訳効率の計算は、通常のストレス条件と熱ストレス条件下でこれらの画分にわたるmRNAの分布を比較することによって実行されます。特定の遺伝子の翻訳活性は、リボソーム関連RNAおよび全RNAを用いた定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)を行うことにより、さらに評価されます。この方法論は、熱ストレスの影響にのみ焦点を当てており、植物の翻訳調節を分析するための詳細なプロトコルを提供します。

概要

翻訳は、生物がmRNAから機能的なタンパク質を合成し、代謝やシグナル伝達などの重要な細胞機能や生物学的プロセスをサポートし、ストレス応答を可能にするために重要です。翻訳がなければ、細胞は重要なタンパク質を産生することができず、その構造、機能、および調節に影響を与え、それによって生命の維持と生物学的多様性の育成に影響を及ぼします^1,2。したがって、植物の並進効率を研究することは非常に重要です。翻訳には、いくつかの重要なステップがあります。まず、開始はmRNAがリボソームに結合するときに起こり、真核生物のeIFなどの開始因子によって促進され、開始コドン(通常はAUG)が識別されます。次に、それぞれが特定のアミノ酸を持つトランスファーRNA(tRNA)分子がリボソームに順次結合することで伸長が進行します。ペプチド結合は隣接するアミノ酸間に形成され、mRNA配列に従ってポリペプチド鎖を伸長します。最後に、リボソームに新しく合成されたタンパク質を放出するように促す放出因子によって認識される停止コドン(UAA、UAG、またはUGA)に遭遇すると、終了が開始されます。翻訳全体を通じて、さまざまな真核生物の開始因子(eIF)、伸長因子、およびリボソームRNAが連携して、精度と効率を確保します^3,4

プロトコル

1.熱ストレス処理シロイヌナズナ苗サンプル調製

1. 1.2%植物寒天培地を添加したショ糖(pH 5.6)を含まないMurashige and Skoog(MS)基礎培地寒天プレート上に置いた濾紙にスポイトを付けて、各複製および各条件について250個の種子をプレート化します。
   注:MSプレートに苗を植えるには、滅菌濾紙をプレート上に置いて、苗の根が培地の奥深くまで浸透するのを防ぎ、サンプリングを容易にします。次に、濾紙の上に種を植えます。植物の成長や実験結果に対する糖の影響を排除するために、栽培にはショ糖を含まないMS培地を使用することをお勧めします。
2. 植えた種子が入ったMSプレートをアルミホイルで包んで光を遮断し、4°Cで2日間インキュベートして春化を誘導します。
3. 春化した種子を成長チャンバーに移し、16時間:8時間、22°Cの明暗日長、光強度100μmol/m²/sで成長させます。
4. 熱ストレスサンプルの場合は、生後5日の苗木が入ったMS培地プレートを防水粘着テープで密封し、40°Cの水浴に1時間置きます。
5. 熱処理後に回収する試料は、熱処理後すぐにプレートを冷却してください。その後、それらを22°Cの成長チャンバーに2時間置....

ディスカッション

このプロトコルは、シロイヌナズナの実生の翻訳効率を測定するための簡単で標準化された方法の概要を示しています。このプロトコルの重要なステップは、二次遠心分離とRNA抽出試薬抽出によるRNAの安定性の確保、およびスクロース勾配の綿密な調製です。さらに、スパイクイン正規化法により、非ポリソームおよびポリソームRNAを標準化および定量するための重.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf tube	Labcon	3012-870-000-9	RNA extraction
13.2 mL centrifuge tube	Beckman Coulter	331372	ultracentrifugation
Bromophenol blue	Honeywell	32712	Polysome profile
Chloroform	Honeywell	32211	RNA extraction
Cycloheximide (CHX)	Sigma-Aldrich	SI-C7698	Polysome profile
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	RNA extraction
Ethanol	Sigma-Aldrich	32221	RNA extraction
GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit	Invitrogen	900433	Normalization
Glycerol	Honeywell	15523	Normalization
Heparin	Sigma-Aldrich	SI-H3149	Polysome profile
HiScript III RT SuperMix for qPCR kit	Vazyme	R323-01	Normalization
KCl	J.T.Baker	3040-01	Polysome profile
MgCl2	Sigma-Aldrich	SI-M8266	Polysome profile
MS basal medium	Phyto	M524	Plant culture
Peak Chart Syringe Pump	Brandel	SYN4007LS	Polysome profile
Polyoxyethylene-10-Tridecyl-Ether (PTE)	Sigma-Aldrich	P2393	Polysome profile
RNasin	Promega	N251B	Polysome profile
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	SI-D6750	Polysome profile
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5391	Polysome profile
SYBR Green Supermix	Bio-Rad	BP170-8882	Normalization
TRI reagent	MRC	TR118	RNA extraction
Tris-HCl	J.T.Baker	4109-06	Polysome profile
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-100K	ultracentrifugation
UV/VISDETECTOR	Brandel	UA-6	Polysome profile