Test di efficienza traslazionale utilizzando profili polisomici sotto stress termico

Riepilogo

Il protocollo qui presentato prevede la profilazione polisomiale per isolare il translatoma, gli mRNA associati ai ribosomi, in RNA non polisomiali e polisomiali da Arabidopsis attraverso la centrifugazione in gradiente di densità di saccarosio. Questo metodo dimostra l'efficienza di traslazione di Arabidopsis stressato dal calore.

Abstract

Il controllo traduzionale di diversi geni sotto stress termico è un passo fondamentale per l'adattamento delle piante all'ambiente. Valutare le attività traduzionali di vari geni può aiutarci a comprendere i meccanismi molecolari alla base della resilienza delle piante, contribuendo allo sviluppo di colture con una maggiore tolleranza allo stress di fronte ai cambiamenti climatici globali. Questo articolo presenta una metodologia dettagliata per valutare l'efficienza di traduzione attraverso la profilazione dei polisomi in impianti esposti a stress termico. La procedura è suddivisa in tre parti: trattamento da stress termico per l'Arabidopsis, test dell'efficienza di traduzione utilizzando profili polisomici e calcolo dell'efficienza di traduzione isolando l'RNA non polisomiale e polisomiale in base al profilo. Nella prima parte, le piante di Arabidopsis sono sottoposte a condizioni di stress termico controllato per imitare le sfide ambientali. Il trattamento prevede l'esposizione delle piante ad alte temperature per periodi determinati, garantendo un'induzione dello stress costante e riproducibile. Questo passaggio è fondamentale per studiare le risposte fisiologiche e molecolari della pianta allo stress da calore. La seconda parte prevede il test di efficienza traslazionale mediante profilazione polisomiale. I polisomi vengono estratti attraverso la centrifugazione in gradiente di saccarosio, che separa gli mRNA in base al carico ribosomiale. Ciò consente l'esame dell'occupazione dei ribosomi sugli mRNA, fornendo informazioni sui meccanismi di controllo traduzionale in condizioni di stress. Nella terza parte, l'RNA viene isolato sia da frazioni polisomiali che non polisomiali. L'RNA spike-in viene utilizzato per misurare con precisione la quantità di RNA in ciascuna frazione. Il calcolo dell'efficienza di traduzione viene eseguito confrontando la distribuzione degli mRNA tra queste frazioni in condizioni normali e di stress termico. Le attività di traduzione di geni specifici sono ulteriormente valutate eseguendo la PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) con RNA associato ai ribosomi e RNA totale. Questa metodologia si concentra esclusivamente sugli effetti dello stress termico, fornendo un protocollo dettagliato per l'analisi della regolazione traslazionale nelle piante.

Introduzione

La traduzione è fondamentale per gli organismi per sintetizzare proteine funzionali dall'mRNA, supportando funzioni cellulari essenziali e processi biologici come il metabolismo e la segnalazione e consentendo risposte allo stress. Senza traduzione, le cellule non possono produrre proteine vitali, influenzando la loro struttura, funzione e regolazione, influenzando così il sostentamento della vita e promuovendo la diversità biologica ^1,2. Pertanto, studiare l'efficienza traslazionale delle piante è fondamentale. La traduzione prevede diversi passaggi essenziali. In primo luogo, l'inizio avviene quando l'mRNA si lega a un ribosoma, facilitato da fattori di inizio come gli eIF negli eucarioti, che identificano il codone di inizio, tipicamente AUG. Successivamente, l'allungamento procede quando le molecole di RNA di trasferimento (tRNA), ciascuna delle quali trasporta amminoacidi specifici, si legano in sequenza al ribosoma. I legami peptidici si formano tra gli amminoacidi adiacenti, allungando la catena polipeptidica secondo la sequenza dell'mRNA. Infine, la terminazione viene avviata quando si incontra un codone di stop (UAA, UAG o UGA), riconosciuto dai fattori di rilascio che spingono il ribosoma a rilasciare la proteina appena sintetizzata. Durante la traduzione, vari fattori di iniziazione eucariotici (eIF), fattori di allungamento e RNA ribosomiali lavorano insieme per garantire accuratezza ed efficienza ^3,4.

Studi precedenti hanno indicato che le modifiche post-traduzionali svolgono un ruolo critico nella regolazione delle interazioni tra gli eIF e quindi influenzano l'efficienza della traduzione. La ricerca in vitro ha rivelato che la caseina chinasi 2 (CK2) fosforila eIF3c, eIF5 ed eIF2β per aumentare le loro interazioni tra loro e con eIF1 ^5,6. Al buio, la E3 ligasi CONSTITUTIVAMENTE FOTOMORFOGENICA 1 (COP1) reprime la traduzione inibendo la fosforilazione di S6K-RPS6 mediata da TOR. L'RPS6 non fosforilato non è in grado di formare ribosomi funzionali, interrompendo così la traduzione⁷. Al contrario, in condizioni di luce, la chinasi SUPPRESSOR OF PHYA 105 (SPA1) fosforila eIF2α per facilitare l'assemblaggio del complesso eIF2 e promuovere l'inizio della traduzione⁸. Questi risultati evidenziano i complessi meccanismi di controllo che regolano la traduzione in risposta ai segnali ambientali.

Stimoli ambientali moderati possono promuovere efficacemente i processi traduzionali per facilitare la crescita, come la fotomorfogenesi ^8,9. Tuttavia, quando i fattori ambientali sono eccessivi, le piante immobili devono sviluppare meccanismi di regolazione adeguati per mitigare i danni causati dallo stress ambientale¹⁰. In studi precedenti relativi alle risposte allo stress delle piante, la maggior parte si è concentrata sulla regolazione a livello metabolico, ormonale e trascrizionale 11,12,13,14. Tuttavia, recenti ricerche hanno iniziato a evidenziare l'influenza della regolazione traslazionale sulla tolleranza allo stress delle piante 15,16,17. Le piante possono aumentare la loro tolleranza allo stress riducendo l'efficienza traslazionale, riducendo così al minimo il consumo di energia non necessario. A causa della formazione di granuli di stress non membranosi nelle cellule vegetali, l'mRNA non tradotto e le proteine associate si aggregano al loro interno per ridurre l'efficienza traduzionale¹⁸. Uno degli stress ambientali comuni che le piante incontrano spesso è lo stress da calore, che è stato segnalato per indurre la formazione di granuli di stress all'interno delle cellule vegetali^19,20. L'aumento globale delle temperature medie dovuto al riscaldamento globale incide gravemente sui raccolti²¹. Pertanto, studiare la regolazione fisiologica delle piante sotto stress termico è fondamentale. Uno studio precedente ha dimostrato che il trattamento termico del grano ha provocato una diminuzione dell'mRNA legato ai polisomi. Tuttavia, gli mRNA immagazzinati nei granuli di stress sono stati rilasciati e rilegati ai ribosomi, facilitando la traduzione dopo il recupero²². Inoltre, ricerche precedenti hanno confrontato l'espressione genica tra l'mRNA totale e l'mRNA legato ai polisomi nelle piante sommerse¹⁶. I risultati hanno indicato che i livelli di mRNA allo stato stazionario associati all'acido abscissico e alle risposte allo stress abiotico sono leggermente aumentati dopo l'immersione. Inoltre, la quantità di mRNA legati ai polisomi è aumentata in modo significativo. Questi risultati suggeriscono che la regolazione della traduzione potrebbe svolgere un ruolo più critico nel controllo della tolleranza allo stress nelle piante. Pertanto, un metodo efficace di isolamento dell'RNA polisomiale è fondamentale per studiare il translatoma di campioni trattati sotto stress.

In questo protocollo, abbiamo modificato il metodo di isolamento dell'RNA dall'estrazione fenolo/cloroformio ad alto rischio e voluminoso con il metodo di precipitazione LiCl al metodo di estrazione fenolo/tiocianato di guanidinio su piccola scala, che richiede meno volume. Il primo metodo prevede la miscelazione diretta con frazioni polisomiali, ottenendo un rifiuto sperimentale più grande ^9,15,23. Al contrario, questo approccio modificato utilizza principi di densità differenziale: l'RNA polisomiale viene prima miscelato con una soluzione ad alto contenuto di sale e senza zucchero e poi precipitato mediante ultracentrifugazione. Successivamente, l'estrazione dell'RNA viene eseguita utilizzando un piccolo volume di reagente fenolo/guanidinio tiocianato. Questo metodo riduce efficacemente la produzione di rifiuti organici, rendendo il nostro esperimento più rispettoso dell'ambiente. Inoltre, i solventi organici utilizzati hanno una tossicità inferiore. Questi motivi ci hanno portato ad adeguare e migliorare di conseguenza le procedure sperimentali. Inoltre, i metodi precedenti non fornivano un protocollo completo per il calcolo dell'efficienza di traduzione utilizzando la normalizzazione spike-in, essenziale per analisi translatomiche più approfondite.

Qui, descriviamo il profilo dei polisomi e il protocollo di isolamento dell'RNA polisomiale per studiare l'efficienza della traduzione e le analisi translatomiche in Arabidopsis sotto stress da shock termico. Questo protocollo è stato impiegato per valutare l'efficienza della traduzione nel wild type Col-0 in condizioni normali, shock termico e post-recupero. I risultati del profilo dei polisomi e la percentuale di RNA polisomiale hanno rivelato alterazioni nell'efficienza della traduzione dopo il trattamento con stress termico nelle piantine di Arabidopsis .

Protocollo

1. Preparazione del campione di piantina di Arabidopsis trattata termicamente

1. Piastra 250 semi per ogni replica e ogni condizione con un contagocce sulla carta da filtro posta sulla piastra di agar del terreno basale Murashige e Skoog (MS) senza saccarosio (pH 5,6) integrata con fitoagar all'1,2%.
   NOTA: Per piantare piantine su piastre MS, sulla piastra viene posizionata della carta da filtro sterile per evitare che le radici delle piantine penetrino in profondità nel terreno, facilitando il campionamento. I semi vengono quindi piantati sopra la carta da filtro. Per escludere l'influenza degli zuccheri sulla crescita delle piante e sui risultati sperimentali, si consiglia di utilizzare un terreno MS che non contenga saccarosio per la coltivazione.
2. Avvolgere la piastra MS contenente i semi piantati con un foglio di alluminio per bloccare la luce e incubarla a 4 °C per 2 giorni per indurre la vernalizzazione.
3. Trasferire i semi vernalizzati in una camera di crescita da coltivare in un fotoperiodo chiaro-scuro di 16 h:8 h, a 22 °C con un'intensità luminosa di 100 μmol/m²/s.
4. Per i campioni di stress termico, sigillare le piastre medie MS contenenti piantine di 5 giorni con nastro adesivo impermeabile e metterle in un bagno d'acqua a 40 °C per 1 ora.
5. Per i campioni che si riprendono dopo il trattamento termico, raffreddare le piastre immediatamente dopo il trattamento termico. Successivamente, metterli in una camera di crescita a 22 °C per 2 h.
6. Raccogli 250 piantine trattate o non trattate in provette da microcentrifuga da 1,5 ml per ogni replica e congela immediatamente i campioni in azoto liquido.
   NOTA: Per ogni condizione sono stati preparati due gruppi di campioni. Uno è per le analisi di profilazione dei polisomi e l'altro è per l'estrazione di RNA non polisomiale e polisomale.

2. Preparazione del gradiente di saccarosio

1. Preparare la soluzione a gradiente contenente le seguenti concentrazioni di saccarosio: 12,5%, 24,4%, 36,3%, 48,1% e 60%. La composizione della soluzione comprende 50 mM di Tris-HCl, 25 mM di KCl, 10 mM di MgCl₂, 100 μg/mL di eparina e 50 μg/mL di cicloesimide (CHX).
2. Caricare le soluzioni a gradiente da alta a bassa concentrazione, partendo dal basso e salendo verso l'alto. Dopo aver aggiunto ogni concentrazione di soluzione a gradiente, congelare la soluzione allo stato solido prima di aggiungere la concentrazione successiva. Per ogni concentrazione di gradiente di saccarosio, aggiungere 2,2 ml. Questo processo si tradurrà in un gradiente discontinuo di densità del saccarosio.
3. Conservare temporaneamente il gradiente di saccarosio preparato a -80 °C e scongelare per una notte a 4 °C prima dell'uso.

3. Preparazione del campione per il profilo dei polisomi

1. Macinare 250 piantine di Col-0 di 5 giorni, stressate dal calore o non trattate, precedentemente congelate in polvere utilizzando un omogeneizzatore a una frequenza di 30 cicli/s per 1 minuto.
   NOTA: Quando il numero di piante con lo stesso background è uguale, hanno la stessa resa di estrazione dell'RNA. Tuttavia, quando si confrontano piante transgeniche o mutanti che sovraesprimono background diversi, la quantità di piante utilizzate dovrebbe essere regolata in base alle condizioni della pianta.
2. Per ottenere una soluzione di estrazione contenente RNA non polisomiale e polisomiale, aggiungere 500 μL di tampone di estrazione dei polisomi (200 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM KCl, 25 mM MgCl₂, 50 μg/mL cicloesimide, 100 μg/mL di eparina, 2% PTE, 10% DOC, 400 U/mL di inibitore della ribonucleasi) a ciascuna provetta e mescolare i campioni invertendo e vorticando. Assicurarsi che i campioni siano mantenuti a 4 °C durante tutto il processo.
3. Centrifugare la soluzione di estrazione a 4 °C, 12.000 x g per 10 min. Quindi, filtrare il surnatante attraverso un filtro cellulare da 100 μm per ottenere una soluzione di estrazione limpida e priva di particelle.
   NOTA: Le particelle presenti nella soluzione di estrazione possono sedimentare durante l'ultracentrifugazione, formando potenzialmente un pellet che potrebbe influire sull'accuratezza delle misure di profilazione dei polisomi.
4. Caricare il surnatante filtrato su un gradiente di saccarosio pre-preparato e assicurarsi che raggiunga l'equilibrio.
   NOTA: A causa dell'elevata velocità di rotazione dell'ultracentrifuga, è essenziale garantire sia la sicurezza che il corretto funzionamento dell'ultracentrifuga. Per raggiungere questo obiettivo, è necessario confermare che i pesi del campione siano identici prima della rotazione. Pertanto, utilizziamo una bilancia di precisione per verificare che i pesi dei gradienti siano completamente uniformi.
5. Centrifugare il gradiente di saccarosio caricato con campioni a 4 °C, 210.000 x g per 3,5 ore utilizzando un rotore a secchiello oscillante per ultracentrifuga. Impostare i tassi di accelerazione e decelerazione al massimo. Dopo l'ultracentrifugazione, l'RNA non polisomiale e polisomiale vengono distribuiti in base alla loro densità nella corrispondente soluzione a gradiente di saccarosio.
   NOTA: Nel gradiente di saccarosio, l'RNA non polisomiale con densità inferiore si distribuisce nello strato superiore, mentre l'RNA polisomiale, caratterizzato da una densità più elevata dovuta alla presenza di numerosi ribosomi impegnati nella traduzione attiva sull'mRNA, si distribuisce nello strato inferiore. Successivamente, il profilo dei polisomi può essere misurato utilizzando un frazionatore a gradiente di densità.

4. Analisi del profilo dei polisomi

NOTA: Per misurare la profilazione dei polisomi viene utilizzato un frazionatore a gradiente di densità con una pompa a siringa per microvolumi.

1. Preparare la soluzione chase (70% saccarosio, 10% glicerolo e 0,02% blu di bromofenolo) per la pompa a siringa per microvolumi.
2. Usa il software per controllare il frazionatore del gradiente di densità. Calibrare la macchina utilizzando acqua deionizzata. Dopo la calibrazione, utilizzarlo per eseguire la profilazione dei polisomi.
   1. Per eseguire la regolazione della linea di base, accendere l'UV/VISDettor fino a quando la luce non cambia da rossa a verde. Regolare la manopola Offset registratore per allineare la linea di marcatura, quindi ruotare la manopola di regolazione della linea di base sulla posizione di apertura minima. Impostare la manopola Sensibilità sul rivelatore UV/VIS sul livello 2.0 e premere il pulsante Auto Baseline . Infine, utilizzare la manopola Recorder Offset per regolare la linea di base desiderata su 20. Il processo calibrato varia a seconda della marca del meccanismo e dei diversi campioni.
3. Dopo l'ultracentrifugazione, posizionare le provette con i campioni sul frazionatore a gradiente di densità utilizzando il sistema di perforazione delle provette in modo che la provetta possa essere collegata alla pompa a siringa con la soluzione di inseguimento e il rivelatore UV.
4. Impostare il frazionatore del gradiente di densità in modalità di controllo software (REMOTE) e impostare la portata di iniezione della pompa a siringa per microvolumi su 3 ml/min.
5. Avviare le impostazioni del software per iniziare e ottenere il grafico del profilo del polisoma utilizzando il frazionatore misurando OD₂₅₄.

5. Isolamento di RNA non polisomiale e polisomiale

NOTA: Per questa parte del protocollo, è stato utilizzato un gruppo diverso di campioni dello stesso lotto dopo aver eseguito l'ultracentrifugazione seguendo gli stessi passaggi descritti in precedenza.

1. Sulla base dei risultati della misurazione del profilo dei polisomi, raccogliere separatamente le frazioni di RNA non polisomiale e polisomiale. Calcolare i volumi di soluzione sia per le frazioni non polisomiali che per quelle polisomiali e raccogliere la frazione non polisomiale (parte superiore).
   NOTA: Secondo i profili, la frazione con più di due ribosomi è definita come frazione polisomica, mentre la frazione con i picchi di rRNA 40S, 60S e 80S è definita come frazione non polisomiale .
2. Miscelare accuratamente le frazioni target di RNA con una soluzione pre-fredda 2x ad alto contenuto di sale (400 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM KCl, 50 mM MgCl₂).
3. Aggiungere 8 μL di stock diluito di poli-A eucariotico RNA Control dal kit.
   NOTA: Per la normalizzazione spike-in necessaria per il settimo passaggio. Il kit di controllo dell'RNA Poly-A eucariotico include come geni di riferimento i geni di B. subtilis , come il gene DAP che non sono presenti nelle piante. Per determinare la percentuale di perdita del gene di riferimento durante la reazione dopo l'estrazione, aggiungere una quantità uguale di reagente contenente un campione di RNA del gene DAP a provette diverse con RNA non polisomiale o polisomiale prima dell'estrazione. Ciò consente di determinare la proporzione di perdita del gene di riferimento durante la reazione dopo l'estrazione e può essere utilizzato a scopo di normalizzazione.
4. Centrifugare l'RNA miscelato in soluzione ad alto contenuto di sale a 4 °C, 450.000 x g, per 5 ore utilizzando un rotore a secchiello oscillante per ultracentrifuga.
5. Dopo l'ultracentrifugazione, l'RNA precipiterà sul fondo della provetta da centrifuga. Versare con cura il surnatante dall'alto per preservare il pellet di RNA sul fondo.
6. Lavare rapidamente il pellet di RNA con 500 μl di acqua trattata con dietilpirocarbonato (DEPC) pre-freddo, ripetendo questo passaggio 3 volte.
   NOTA: Per evitare che l'acqua trattata con DEPC dissolva nuovamente l'RNA durante il processo di lavaggio, è necessario pre-raffreddare l'acqua trattata con DEPC prima dell'uso per ridurne la solubilità. Inoltre, il tempo di contatto tra l'acqua trattata con DEPC e il pellet di RNA durante il lavaggio dovrebbe essere ridotto al minimo.

6. Estrazione di RNA non polisomiale e polisomiale

1. Aggiungere 500 μl di reagente per l'estrazione dell'RNA e mescolare con il campione di RNA da estrarre. Incubare per 10 min.
2. Aggiungere 100 μl di cloroformio, mescolare accuratamente e incubare per 10 minuti per la separazione di fase.
3. Centrifugare la miscela di reazione a 4 °C, 12.000 x g per 10 minuti. Trasferire lo strato acquoso chiaro superiore contenente RNA in una nuova provetta, mescolarlo delicatamente con un volume uguale di isopropanolo e incubare a -20 °C per 2 ore per la precipitazione dell'RNA.
4. Dopo la precipitazione, centrifugare a 4 °C, 12.000 x g per 10 min. Scartare con cura il surnatante e conservare il pellet di RNA sul fondo.
5. Lavare il pellet di RNA con 1 mL di etanolo pre-freddo al 75%. Centrifugare a 4 °C, 12.000 x g per 10 minuti, scartare il surnatante e asciugare all'aria il pellet di RNA.
6. Una volta essiccato il pellet di RNA, risospendere il pellet di RNA in 30 μL di acqua trattata con DEPC e misurare la concentrazione di RNA (OD₂₆₀) utilizzando uno spettrofotometro a spettro completo (220 nm-750 nm).

7. Normalizzazione dei picchi

1. Utilizzare 1000 ng di RNA estratto per la trascrizione inversa eseguita utilizzando un kit qPCR seguendo le istruzioni del produttore. Sia l'RNA non polisomiale che quello polisomiale devono essere trascritti inversamente in cDNA.
2. Mescolare 1 μL di cDNA con i primer del gene DAP e utilizzare il tampone SYBR per misurare il livello di espressione del gene bersaglio secondo le istruzioni del produttore. Successivamente, utilizzare la PCR in tempo reale per rilevare l'espressione genica DAP .
   NOTA: Le sequenze dei primer del gene DAP sono le seguenti:
   Innesco in avanti = 5'-ATA, AAA, GAA, TTC, AGC, TAA, CGC, TTC, C-3'
   Innesco inverso = 5'-TTG TTT CTT TGC CTC TAT TGT ATC C-3'
3. Confrontare i livelli di espressione dei geni DAP nei gruppi di RNA non polisomiali e polisomiali misurati e stimare il contenuto di RNA in condizioni di perdita proporzionale. Utilizzando il contenuto di RNA normalizzato, calcolare il rapporto di RNA nei polisomi.

Risultati

Il tipo selvatico di Arabidopsis, Col-0, è stato coltivato su terreno MS in un fotoperiodo leggero di 16 h:8 h. Per il controllo, sono state utilizzate piantine di 5 giorni senza trattamento da stress termico. Il gruppo di stress termico è stato sottoposto a 1 ora di trattamento termico a 40 °C in un bagno d'acqua preriscaldato, mentre il gruppo di recupero è stato posto a 22 °C per 2 ore subito dopo il trattamento termico. Utilizzando diverse condizioni di trattamento term...

Discussione

Questo protocollo delinea un metodo semplice e standardizzato per misurare l'efficienza di traslazione delle piantine di Arabidopsis. Le fasi critiche di questo protocollo sono garantire la stabilità dell'RNA con la centrifugazione secondaria e l'estrazione del reagente per l'estrazione dell'RNA, nonché la preparazione meticolosa del gradiente di saccarosio. Inoltre, forniamo passaggi critici per la normalizzazione e la quantificazione dell'RNA non polisomiale e polisomiale con il meto...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf tube	Labcon	3012-870-000-9	RNA extraction
13.2 mL centrifuge tube	Beckman Coulter	331372	ultracentrifugation
Bromophenol blue	Honeywell	32712	Polysome profile
Chloroform	Honeywell	32211	RNA extraction
Cycloheximide (CHX)	Sigma-Aldrich	SI-C7698	Polysome profile
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	RNA extraction
Ethanol	Sigma-Aldrich	32221	RNA extraction
GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit	Invitrogen	900433	Normalization
Glycerol	Honeywell	15523	Normalization
Heparin	Sigma-Aldrich	SI-H3149	Polysome profile
HiScript III RT SuperMix for qPCR kit	Vazyme	R323-01	Normalization
KCl	J.T.Baker	3040-01	Polysome profile
MgCl2	Sigma-Aldrich	SI-M8266	Polysome profile
MS basal medium	Phyto	M524	Plant culture
Peak Chart Syringe Pump	Brandel	SYN4007LS	Polysome profile
Polyoxyethylene-10-Tridecyl-Ether (PTE)	Sigma-Aldrich	P2393	Polysome profile
RNasin	Promega	N251B	Polysome profile
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	SI-D6750	Polysome profile
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5391	Polysome profile
SYBR Green Supermix	Bio-Rad	BP170-8882	Normalization
TRI reagent	MRC	TR118	RNA extraction
Tris-HCl	J.T.Baker	4109-06	Polysome profile
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-100K	ultracentrifugation
UV/VISDETECTOR	Brandel	UA-6	Polysome profile