Test di efficienza traslazionale utilizzando profili polisomici sotto stress termico

Riepilogo

Il protocollo qui presentato prevede la profilazione polisomiale per isolare il translatoma, gli mRNA associati ai ribosomi, in RNA non polisomiali e polisomiali da Arabidopsis attraverso la centrifugazione in gradiente di densità di saccarosio. Questo metodo dimostra l'efficienza di traslazione di Arabidopsis stressato dal calore.

Abstract

Il controllo traduzionale di diversi geni sotto stress termico è un passo fondamentale per l'adattamento delle piante all'ambiente. Valutare le attività traduzionali di vari geni può aiutarci a comprendere i meccanismi molecolari alla base della resilienza delle piante, contribuendo allo sviluppo di colture con una maggiore tolleranza allo stress di fronte ai cambiamenti climatici globali. Questo articolo presenta una metodologia dettagliata per valutare l'efficienza di traduzione attraverso la profilazione dei polisomi in impianti esposti a stress termico. La procedura è suddivisa in tre parti: trattamento da stress termico per l'Arabidopsis, test dell'efficienza di traduzione utilizzando profili polisomici e calcolo dell'efficienza di traduzione isolando l'RNA non polisomiale e polisomiale in base al profilo. Nella prima parte, le piante di Arabidopsis sono sottoposte a condizioni di stress termico controllato per imitare le sfide ambientali. Il trattamento prevede l'esposizione delle piante ad alte temperature per periodi determinati, garantendo un'induzione dello stress costante e riproducibile. Questo passaggio è fondamentale per studiare le risposte fisiologiche e molecolari della pianta allo stress da calore. La seconda parte prevede il test di efficienza traslazionale mediante profilazione polisomiale. I polisomi vengono estratti attraverso la centrifugazione in gradiente di saccarosio, che separa gli mRNA in base al carico ribosomiale. Ciò consente l'esame dell'occupazione dei ribosomi sugli mRNA, fornendo informazioni sui meccanismi di controllo traduzionale in condizioni di stress. Nella terza parte, l'RNA viene isolato sia da frazioni polisomiali che non polisomiali. L'RNA spike-in viene utilizzato per misurare con precisione la quantità di RNA in ciascuna frazione. Il calcolo dell'efficienza di traduzione viene eseguito confrontando la distribuzione degli mRNA tra queste frazioni in condizioni normali e di stress termico. Le attività di traduzione di geni specifici sono ulteriormente valutate eseguendo la PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) con RNA associato ai ribosomi e RNA totale. Questa metodologia si concentra esclusivamente sugli effetti dello stress termico, fornendo un protocollo dettagliato per l'analisi della regolazione traslazionale nelle piante.

Introduzione

La traduzione è fondamentale per gli organismi per sintetizzare proteine funzionali dall'mRNA, supportando funzioni cellulari essenziali e processi biologici come il metabolismo e la segnalazione e consentendo risposte allo stress. Senza traduzione, le cellule non possono produrre proteine vitali, influenzando la loro struttura, funzione e regolazione, influenzando così il sostentamento della vita e promuovendo la diversità biologica ^1,2. Pertanto, studiare l'efficienza traslazionale delle piante è fondamentale. La traduzione prevede diversi passaggi essenziali. In primo luogo....

Protocollo

1. Preparazione del campione di piantina di Arabidopsis trattata termicamente

1. Piastra 250 semi per ogni replica e ogni condizione con un contagocce sulla carta da filtro posta sulla piastra di agar del terreno basale Murashige e Skoog (MS) senza saccarosio (pH 5,6) integrata con fitoagar all'1,2%.
   NOTA: Per piantare piantine su piastre MS, sulla piastra viene posizionata della carta da filtro sterile per evitare che le radici delle piantine penetrino in profondità nel terreno, facilitando il campionamento. I semi vengono quindi piantati sopra la carta da filtro. ....

Discussione

Questo protocollo delinea un metodo semplice e standardizzato per misurare l'efficienza di traslazione delle piantine di Arabidopsis. Le fasi critiche di questo protocollo sono garantire la stabilità dell'RNA con la centrifugazione secondaria e l'estrazione del reagente per l'estrazione dell'RNA, nonché la preparazione meticolosa del gradiente di saccarosio. Inoltre, forniamo passaggi critici per la normalizzazione e la quantificazione dell'RNA non polisomiale e polisomiale con il meto.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf tube	Labcon	3012-870-000-9	RNA extraction
13.2 mL centrifuge tube	Beckman Coulter	331372	ultracentrifugation
Bromophenol blue	Honeywell	32712	Polysome profile
Chloroform	Honeywell	32211	RNA extraction
Cycloheximide (CHX)	Sigma-Aldrich	SI-C7698	Polysome profile
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	RNA extraction
Ethanol	Sigma-Aldrich	32221	RNA extraction
GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit	Invitrogen	900433	Normalization
Glycerol	Honeywell	15523	Normalization
Heparin	Sigma-Aldrich	SI-H3149	Polysome profile
HiScript III RT SuperMix for qPCR kit	Vazyme	R323-01	Normalization
KCl	J.T.Baker	3040-01	Polysome profile
MgCl2	Sigma-Aldrich	SI-M8266	Polysome profile
MS basal medium	Phyto	M524	Plant culture
Peak Chart Syringe Pump	Brandel	SYN4007LS	Polysome profile
Polyoxyethylene-10-Tridecyl-Ether (PTE)	Sigma-Aldrich	P2393	Polysome profile
RNasin	Promega	N251B	Polysome profile
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	SI-D6750	Polysome profile
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5391	Polysome profile
SYBR Green Supermix	Bio-Rad	BP170-8882	Normalization
TRI reagent	MRC	TR118	RNA extraction
Tris-HCl	J.T.Baker	4109-06	Polysome profile
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-100K	ultracentrifugation
UV/VISDETECTOR	Brandel	UA-6	Polysome profile