Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Burada sunulan protokol, ribozomlarla ilişkili mRNA'lar olan translatom'u, sakaroz yoğunluk gradyan santrifüjlemesi yoluyla Arabidopsis'ten polisomal olmayan ve polisomal RNA'lara izole etmek için polisomal profillemeyi içerir. Bu yöntem, ısı stresli Arabidopsis'in çeviri verimliliğini göstermektedir.
Isı stresi altında farklı genlerin translasyonel kontrolü, bitkinin çevreye adaptasyonu için kritik bir adımdır. Çeşitli genlerin translasyonel aktivitelerini değerlendirmek, bitki direncinin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamamıza yardımcı olabilir ve küresel iklim değişikliği karşısında gelişmiş stres toleransına sahip mahsullerin geliştirilmesine katkıda bulunabilir. Bu makale, ısı stresine maruz kalan bitkilerde polizom profillemesi yoluyla translasyon verimliliğini değerlendirmek için ayrıntılı bir metodoloji sunmaktadır. Prosedür üç bölüme ayrılmıştır: Arabidopsis için ısı stresi tedavisi, polizom profilleri kullanılarak translasyon verimliliği testi ve profile dayalı olarak polizomal olmayan ve polisomal RNA'yı izole ederek translasyon verimliliğinin hesaplanması. İlk bölümde, Arabidopsis bitkileri, çevresel zorlukları taklit etmek için kontrollü ısı stresi koşullarına tabi tutulur. Arıtma, bitkilerin belirli süreler boyunca yüksek sıcaklıklara maruz bırakılmasını ve tutarlı ve tekrarlanabilir stres indüksiyonunun sağlanmasını içerir. Bu adım, bitkinin ısı stresine verdiği fizyolojik ve moleküler tepkileri incelemek için çok önemlidir. İkinci bölüm, polizom profillemesi kullanılarak translasyon verimliliği testini içerir. Polizomlar, ribozomal yüklemeye dayalı olarak mRNA'ları ayıran sakaroz gradyan santrifüjlemesi yoluyla ekstrakte edilir. Bu, mRNA'lar üzerindeki ribozom doluluğunun incelenmesine izin vererek, stres koşulları altında translasyonel kontrol mekanizmaları hakkında bilgi sağlar. Üçüncü bölümde, RNA hem polizomal hem de polizomal olmayan fraksiyonlardan izole edilir. Spike-in RNA, her fraksiyondaki RNA miktarını doğru bir şekilde ölçmek için kullanılır. Translasyon verimliliğinin hesaplanması, normal ve ısı stresi koşulları altında mRNA'ların bu fraksiyonlar arasındaki dağılımı karşılaştırılarak gerçekleştirilir. Spesifik genlerin translasyon aktiviteleri, ribozomla ilişkili RNA ve toplam RNA ile kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) gerçekleştirilerek daha fazla değerlendirilir. Bu metodoloji, yalnızca ısı stresinin etkilerine odaklanır ve bitkilerde translasyonel düzenlemeyi analiz etmek için ayrıntılı bir protokol sağlar.
Translasyon, organizmaların mRNA'dan fonksiyonel proteinleri sentezlemesi, temel hücresel fonksiyonları ve metabolizma ve sinyalleşme gibi biyolojik süreçleri desteklemesi ve stres tepkilerini etkinleştirmesi için çok önemlidir. Translasyon olmadan, hücreler hayati proteinleri üretemez, yapılarını, işlevlerini ve düzenlemelerini etkiler, böylece yaşamın sürdürülmesini ve biyolojik çeşitliliğin teşvik edilmesini etkiler 1,2. Bu nedenle, bitkilerin translasyon verimliliğini incelemek çok önemlidir. Çeviri birkaç temel adımı içerir. İlk olarak, başlatma, mRNA'nın bir ribozoma bağ....
1. Isı stresi ile muamele edilmiş Arabidopsis fide numunesi hazırlama
Arabidopsis'in vahşi türü olan Col-0, MS ortamında 16 h: 8 h ışık fotoperiyodu altında büyütüldü. Kontrol için, ısı stresi işlemi yapılmadan 5 günlük fideler kullanıldı. Isı stresi grubu, önceden ısıtılmış bir su banyosunda 40 °C'de 1 saat ısıl işleme tabi tutulurken, geri kazanım grubu, ısıl işlemden hemen sonra 2 saat boyunca 22 °C'ye yerleştirildi. Farklı ısıl işlem koşulları ve geri kazanım koşulları kullanarak, translasyon veri.......
Bu protokol, Arabidopsis fidelerinin çeviri verimliliğini ölçmek için basit ve standartlaştırılmış bir yöntemin ana hatlarını çizmektedir. Bu protokolün kritik adımları, ikincil santrifüjleme ve RNA ekstraksiyon reaktif ekstraksiyonu ile RNA stabilitesinin sağlanmasının yanı sıra sükroz gradyanının titiz bir şekilde hazırlanmasıdır. Ayrıca, spike-in normalizasyon yöntemi ile polizomal olmayan ve polizomal RNA'nın normalleştirilmesi ve miktarının belirl.......
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.
Yaşam Bilimleri Koleji'ndeki Technology Commons'tan ve Ulusal Tayvan Üniversitesi (Tayvan) Bilim ve Teknoloji Bakanlığı tarafından desteklenen Enstrümantasyon Merkezi'nden ultrasantrifüj teknik araştırma hizmetlerini kabul ediyoruz. Ayrıca teknik destek için Yu-Ling Liang'a ve el yazmasının eleştirel okuması için Cheng laboratuvar üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma, Tayvan'daki Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi'nden Young Scholar Fellowship Einstein Programı tarafından hibe nos kapsamında desteklenmiştir. NSTC 113-2636-B-002-007 - M.-C.C. M.-C.C., Ulusal Tayvan Üniversitesi'nden gelen mali desteği kabul eder.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL eppendorf tube | Labcon | 3012-870-000-9 | RNA extraction |
13.2 mL centrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | ultracentrifugation |
Bromophenol blue | Honeywell | 32712 | Polysome profile |
Chloroform | Honeywell | 32211 | RNA extraction |
Cycloheximide (CHX) | Sigma-Aldrich | SI-C7698 | Polysome profile |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | RNA extraction |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221 | RNA extraction |
GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit | Invitrogen | 900433 | Normalization |
Glycerol | Honeywell | 15523 | Normalization |
Heparin | Sigma-Aldrich | SI-H3149 | Polysome profile |
HiScript III RT SuperMix for qPCR kit | Vazyme | R323-01 | Normalization |
KCl | J.T.Baker | 3040-01 | Polysome profile |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | SI-M8266 | Polysome profile |
MS basal medium | Phyto | M524 | Plant culture |
Peak Chart Syringe Pump | Brandel | SYN4007LS | Polysome profile |
Polyoxyethylene-10-Tridecyl-Ether (PTE) | Sigma-Aldrich | P2393 | Polysome profile |
RNasin | Promega | N251B | Polysome profile |
Sodium deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich | SI-D6750 | Polysome profile |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S5391 | Polysome profile |
SYBR Green Supermix | Bio-Rad | BP170-8882 | Normalization |
TRI reagent | MRC | TR118 | RNA extraction |
Tris-HCl | J.T.Baker | 4109-06 | Polysome profile |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100K | ultracentrifugation |
UV/VISDETECTOR | Brandel | UA-6 | Polysome profile |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır
Sitemizdeki deneyiminizi iyileştirmek için çerezleri kullanıyoruz
Sitemizi kullanmaya devam ederek ya da "Devam et" butonuna tıklayarak, çerezleri kabul edebilirsiniz.