Isı Stresi Altında Polizom Profilleri Kullanılarak Translasyon Verimliliği Testi

Özet

Burada sunulan protokol, ribozomlarla ilişkili mRNA'lar olan translatom'u, sakaroz yoğunluk gradyan santrifüjlemesi yoluyla Arabidopsis'ten polisomal olmayan ve polisomal RNA'lara izole etmek için polisomal profillemeyi içerir. Bu yöntem, ısı stresli Arabidopsis'in çeviri verimliliğini göstermektedir.

Özet

Isı stresi altında farklı genlerin translasyonel kontrolü, bitkinin çevreye adaptasyonu için kritik bir adımdır. Çeşitli genlerin translasyonel aktivitelerini değerlendirmek, bitki direncinin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamamıza yardımcı olabilir ve küresel iklim değişikliği karşısında gelişmiş stres toleransına sahip mahsullerin geliştirilmesine katkıda bulunabilir. Bu makale, ısı stresine maruz kalan bitkilerde polizom profillemesi yoluyla translasyon verimliliğini değerlendirmek için ayrıntılı bir metodoloji sunmaktadır. Prosedür üç bölüme ayrılmıştır: Arabidopsis için ısı stresi tedavisi, polizom profilleri kullanılarak translasyon verimliliği testi ve profile dayalı olarak polizomal olmayan ve polisomal RNA'yı izole ederek translasyon verimliliğinin hesaplanması. İlk bölümde, Arabidopsis bitkileri, çevresel zorlukları taklit etmek için kontrollü ısı stresi koşullarına tabi tutulur. Arıtma, bitkilerin belirli süreler boyunca yüksek sıcaklıklara maruz bırakılmasını ve tutarlı ve tekrarlanabilir stres indüksiyonunun sağlanmasını içerir. Bu adım, bitkinin ısı stresine verdiği fizyolojik ve moleküler tepkileri incelemek için çok önemlidir. İkinci bölüm, polizom profillemesi kullanılarak translasyon verimliliği testini içerir. Polizomlar, ribozomal yüklemeye dayalı olarak mRNA'ları ayıran sakaroz gradyan santrifüjlemesi yoluyla ekstrakte edilir. Bu, mRNA'lar üzerindeki ribozom doluluğunun incelenmesine izin vererek, stres koşulları altında translasyonel kontrol mekanizmaları hakkında bilgi sağlar. Üçüncü bölümde, RNA hem polizomal hem de polizomal olmayan fraksiyonlardan izole edilir. Spike-in RNA, her fraksiyondaki RNA miktarını doğru bir şekilde ölçmek için kullanılır. Translasyon verimliliğinin hesaplanması, normal ve ısı stresi koşulları altında mRNA'ların bu fraksiyonlar arasındaki dağılımı karşılaştırılarak gerçekleştirilir. Spesifik genlerin translasyon aktiviteleri, ribozomla ilişkili RNA ve toplam RNA ile kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) gerçekleştirilerek daha fazla değerlendirilir. Bu metodoloji, yalnızca ısı stresinin etkilerine odaklanır ve bitkilerde translasyonel düzenlemeyi analiz etmek için ayrıntılı bir protokol sağlar.

Giriş

Translasyon, organizmaların mRNA'dan fonksiyonel proteinleri sentezlemesi, temel hücresel fonksiyonları ve metabolizma ve sinyalleşme gibi biyolojik süreçleri desteklemesi ve stres tepkilerini etkinleştirmesi için çok önemlidir. Translasyon olmadan, hücreler hayati proteinleri üretemez, yapılarını, işlevlerini ve düzenlemelerini etkiler, böylece yaşamın sürdürülmesini ve biyolojik çeşitliliğin teşvik edilmesini etkiler ^1,2. Bu nedenle, bitkilerin translasyon verimliliğini incelemek çok önemlidir. Çeviri birkaç temel adımı içerir. İlk olarak, başlatma, mRNA'nın bir ribozoma bağlanmasıyla gerçekleşir ve ökaryotlardaki eIF'ler gibi başlatma faktörleri tarafından kolaylaştırılır ve bu da başlangıç kodonunu, tipik olarak AUG'yi tanımlar. Daha sonra, uzama, her biri belirli amino asitler taşıyan transfer RNA (tRNA) molekülleri olarak ribozoma sırayla bağlanır. Peptit bağları, bitişik amino asitler arasında oluşur ve polipeptit zincirini mRNA dizisine göre uzatır. Son olarak, ribozomun yeni sentezlenen proteini serbest bırakmasını sağlayan salım faktörleri tarafından tanınan bir durdurma kodonu (UAA, UAG veya UGA) ile karşılaşıldığında sonlandırma başlatılır. Translasyon boyunca, çeşitli ökaryotik başlatma faktörleri (eIF'ler), uzama faktörleri ve ribozomal RNA'lar, doğruluk ve verimliliği sağlamak için birlikte çalışır ^3,4.

Önceki çalışmalar, çeviri sonrası değişikliklerin eIF'ler arasındaki etkileşimleri düzenlemede kritik bir rol oynadığını ve dolayısıyla çeviri verimliliğini etkilediğini göstermiştir. İn vitro araştırmalar, KAZEIN KINAZ 2 (CK2) kinazın eIF3c, eIF5 ve eIF2β'yi fosforile ederek birbirleriyle ve eIF1 ile etkileşimlerini artırdığını ortaya koymuştur ^5,6. Karanlıkta, E3 ligaz YAPISAL FOTOMORFOJENİK 1 (COP1), S6K-RPS6'nın TOR aracılı fosforilasyonunu inhibe ederek translasyonu baskılar. Fosforile olmayan RPS6, fonksiyonel ribozomlar oluşturamaz, bu nedenle translasyon^7'yi durdurur. Tersine, ışık koşulları altında, PHYA 105'İN BASKILAYICISI (SPA1) kinaz, eIF2 kompleks montajını kolaylaştırmak ve çeviri başlatmayı teşvik etmek için eIF2α'yı fosforile eder⁸. Bu bulgular, çevresel sinyallere yanıt olarak çeviriyi düzenleyen karmaşık kontrol mekanizmalarını vurgulamaktadır.

Orta derecede çevresel uyaranlar, fotomorfogenez ^8,9 gibi büyümeyi kolaylaştırmak için translasyonel süreçleri etkili bir şekilde teşvik edebilir. Bununla birlikte, çevresel faktörler aşırı olduğunda, hareketsiz bitkilerin çevresel stresin neden olduğu hasarı azaltmak için uygun düzenleyici mekanizmalar geliştirmesi gerekir¹⁰. Bitki stres tepkileri ile ilgili önceki çalışmalarda, çoğunluk metabolik, hormonal ve transkripsiyonel seviyelerde düzenlemeye odaklanmıştır 11,12,13,14. Bununla birlikte, son araştırmalar, translasyonel düzenlemenin bitki stres toleransı 15,16,17 üzerindeki etkisini vurgulamaya başlamıştır. Bitkiler, öteleme verimliliğini azaltarak stres toleranslarını artırabilir ve böylece gereksiz enerji tüketimini en aza indirebilir. Bitki hücrelerinde zarsız stres granüllerinin oluşumu nedeniyle, translasyonel olmayan mRNA ve ilişkili proteinler, translasyon verimliliğini azaltmak için bunların içinde toplanır¹⁸. Bitkilerin sıklıkla karşılaştığı yaygın çevresel streslerden biri, bitki hücreleri içinde stres granüllerinin oluşumunu indüklediği bildirilen ısı stresidir^19,20. Küresel ısınmaya bağlı olarak ortalama sıcaklıklardaki küresel artış, mahsul verimini ciddi şekilde etkilemektedir²¹. Bu nedenle, ısı stresi altındaki bitkilerin fizyolojik düzenlemesini incelemek çok önemlidir. Önceki bir çalışma, buğdayın ısıl işleminin polizome bağlı mRNA'da bir azalmaya yol açtığını göstermiştir. Bununla birlikte, stres granüllerinde depolanan mRNA'lar serbest bırakıldı ve ribozomlara yeniden bağlandı, bu da geri kazanımdan sonra translasyonu kolaylaştırdı²². Ek olarak, önceki araştırmalar, batık bitkilerde toplam mRNA ile polizoma bağlı mRNA arasındaki gen ekspresyonunu karşılaştırmıştır¹⁶. Sonuçlar, absisik asit ve abiyotik stres tepkileri ile ilişkili mRNA'nın kararlı durum seviyelerinin, suya batırıldıktan sonra hafifçe arttığını gösterdi. Ayrıca, polizoma bağlı mRNA'ların miktarı önemli ölçüde artmıştır. Bu sonuçlar, translasyon düzenlemesinin bitkilerde stres toleransını kontrol etmede daha kritik bir rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Bu nedenle, stresle muamele edilmiş numunelerin translatomunu incelemek için etkili bir polisomal RNA izolasyon yöntemi çok önemlidir.

Bu protokolde, RNA izolasyon yöntemini, LiCl çökeltme yöntemi ile yüksek riskli ve hacimli fenol/kloroform ekstraksiyonundan, daha az hacim gerektiren küçük ölçekli fenol/guanidinyum tiyosiyanat ekstraksiyon yöntemine değiştirdik. Eski yöntem, polisomal fraksiyonlarla doğrudan karıştırmayı içerir ve bu da daha büyük bir deneysel atık^{ile sonuçlanır 9,15,23}. Buna karşılık, bu modifiye edilmiş yaklaşım diferansiyel yoğunluk ilkelerini kullanır: polisomal RNA önce yüksek tuzlu, şekersiz bir çözelti ile karıştırılır ve daha sonra ultrasantrifüjleme ile çökeltilir. Daha sonra, RNA ekstraksiyonu, küçük bir hacimde fenol / guanidinyum tiyosiyanat reaktifi kullanılarak gerçekleştirilir. Bu yöntem, organik atık oluşumunu etkili bir şekilde azaltarak deneyimizi daha çevre dostu hale getirir. Ek olarak, kullanılan organik çözücüler daha düşük toksisiteye sahiptir. Bu nedenler bizi deneysel prosedürleri buna göre ayarlamaya ve geliştirmeye yöneltti. Ek olarak, önceki yöntemler, daha derinlemesine translatomik analizler için gerekli olan ani normalleştirme kullanarak çeviri verimliliklerini hesaplamak için kapsamlı bir protokol sağlamıyordu.

Burada, ısı şoku stresi altında Arabidopsis'te translasyon verimliliğini ve translatomik analizleri araştırmak için polizom profillemesi ve polizomal RNA izolasyon protokolünü açıklıyoruz. Bu protokol, normal, ısı şoku ve geri kazanım sonrası koşullar altında Col-0 vahşi tipinde çeviri verimliliğini değerlendirmek için kullanıldı. Polizom profilleme sonuçları ve polisomal RNA yüzdesi, Arabidopsis fidelerinde ısı stresi işlemini takiben translasyon verimliliğinde değişiklikler olduğunu ortaya koydu.

Protokol

1. Isı stresi ile muamele edilmiş Arabidopsis fide numunesi hazırlama

1. Murashige ve Skoog (MS) bazal media agar plakası üzerine yerleştirilen filtre kağıdı üzerine yerleştirilen filtre kağıdı üzerine yerleştirilen her replike için 250 tohum ve her koşul için 250 tohum sakaroz (pH 5.6) içermez ve %1.2 fitoagar ile desteklenir.
   NOT: MS plakalarına fidan dikmek için, fide köklerinin ortamın derinliklerine nüfuz etmesini önlemek için plaka üzerine steril filtre kağıdı yerleştirilir ve daha kolay numune almayı kolaylaştırır. Tohumlar daha sonra filtre kağıdının üzerine ekilir. Şekerlerin bitki büyümesi ve deneysel sonuçlar üzerindeki etkisini dışlamak için, yetiştirme için sakaroz içermeyen bir MS ortamının kullanılması önerilir.
2. Işığı engellemek için ekilen tohumları içeren MS plakasını alüminyum folyo ile sarın ve vernalizasyonu indüklemek için 2 gün boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
3. Vernalize tohumları, 100 μmol/m² / s ışık yoğunluğu ile 22 ° C'de 16 saat: 8 saat, açık-koyu fotoperiyot altında yetiştirilecek bir büyüme odasına aktarın.
4. Isı stresi numuneleri için, 5 günlük fideleri içeren MS orta plakalarını su geçirmez yapışkan bantla kapatın ve 1 saat boyunca 40 °C su banyosuna koyun.
5. Isıl işlemden sonra geri kazanılan numuneler için, ısıl işlemden hemen sonra plakaları soğutun. Daha sonra, 2 saat boyunca 22 ° C'de bir büyüme odasına yerleştirin.
6. Her çoğaltma için işlenmiş veya işlenmemiş 250 fideyi 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine hasat edin ve numuneleri hemen sıvı nitrojen içinde dondurun.
   NOT: Her koşul için iki grup numune hazırlandı. Biri polizom profilleme analizleri, diğeri ise polizomal olmayan ve polisomal RNA ekstraksiyonu içindir.

2. Sükroz gradyanı hazırlama

1. Aşağıdaki sükroz konsantrasyonlarını içeren gradyan çözeltisini hazırlayın:% 12.5,% 24.4,% 36.3,% 48.1 ve% 60. Çözelti bileşimi 50 mM Tris-HCl, 25 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 100 μg/mL Heparin ve 50 μg/mL sikloheksimid (CHX) içerir.
2. Gradyan çözeltilerini aşağıdan başlayarak ve yukarı doğru hareket ettirerek yüksek konsantrasyondan düşük konsantrasyona doğru yükleyin. Her bir gradyan çözeltisi konsantrasyonunu ekledikten sonra, bir sonraki konsantrasyonu eklemeden önce çözeltiyi katı hale getirin. Her sükroz gradyanı konsantrasyonu için 2.2 mL ekleyin. Bu işlem, süreksiz bir sükroz yoğunluk gradyanı ile sonuçlanacaktır.
3. Hazırlanan sükroz gradyanını geçici olarak -80 °C'de saklayın ve kullanmadan önce gece boyunca 4 °C'de çözdürün.

3. Polizom profil oluşturma numunesi hazırlama

1. Daha önce bir homojenizatör kullanılarak toz haline getirilmiş 250 adet 5 günlük Col-0 fidesini, ısıl stresli veya işlenmemiş, 30 döngü/sn frekansında 1 dakika boyunca öğütün.
   NOT: Aynı arka plana sahip bitki sayısı eşit olduğunda, aynı RNA ekstraksiyon verimine sahiptirler. Bununla birlikte, farklı geçmişlere sahip aşırı eksprese eden transgenik veya mutant bitkiler karşılaştırıldığında, kullanılan bitki miktarı bitki koşullarına göre ayarlanmalıdır.
2. Polizomal olmayan ve polisomal RNA içeren bir ekstraksiyon çözeltisi elde etmek için, her tüpe 500 μL polizom ekstraksiyon tamponu (200 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM KCl, 25 mM MgCl₂, 50 μg/mL sikloheksimid, 100 μg/mL heparin, %2 PTE, %10 DOC, 400 U/mL Ribonükleaz inhibitörü) ekleyin ve numuneleri ters çevirerek ve vorteksleyerek karıştırın. Numunelerin proses boyunca 4 °C'de tutulduğundan emin olun.
3. Ekstraksiyon çözeltisini 4 ° C'de, 12.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Ardından, berrak ve partikül içermeyen bir ekstraksiyon çözeltisi elde etmek için süpernatanı 100 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.
   NOT: Ekstraksiyon çözeltisinde bulunan parçacıklar, ultrasantrifüjleme sırasında çökelebilir ve potansiyel olarak polizom profil oluşturma ölçümlerinin doğruluğunu etkileyebilecek bir pelet oluşturabilir.
4. Filtrelenmiş süpernatanı önceden hazırlanmış bir sükroz gradyanına yükleyin ve dengeye ulaştığından emin olun.
   NOT: Ultrasantrifüjün yüksek dönme hızı nedeniyle, ultrasantrifüjün hem güvenliğini hem de düzgün çalışmasını sağlamak önemlidir. Bunu başarmak için, rotasyondan önce numune ağırlıklarının aynı olduğunu doğrulamak gerekir. Bu nedenle, gradyanların ağırlıklarının tamamen aynı olduğunu doğrulamak için hassas bir terazi kullanıyoruz.
5. Numunelerle yüklenen sakaroz gradyanını bir ultrasantrifüj sallanan kova rotoru kullanarak 3,5 saat boyunca 4 °C, 210.000 x g'de santrifüjleyin. Hızlanma ve yavaşlama oranlarını maksimuma ayarlayın. Ultrasantrifüjlemeden sonra, polizomal olmayan ve polisomal RNA, karşılık gelen sükroz gradyan çözeltisinde yoğunluklarına göre dağıtılır.
   NOT: Sükroz gradyanında, daha düşük yoğunluğa sahip polisomal olmayan RNA üst tabakada dağılırken, mRNA üzerinde aktif translasyon yapan çok sayıda ribozomun varlığına bağlı olarak daha yüksek yoğunluk ile karakterize edilen polisomal RNA alt tabakada dağılır. Daha sonra, polizom profillemesi, bir yoğunluk gradyan fraksiyonlayıcı kullanılarak ölçülebilir.

4. Polizom profil analizi

NOT: Polizom profillemesini ölçmek için mikro hacimli şırınga pompalı bir yoğunluk gradyan fraksiyonatörü kullanılır.

1. Mikro hacimli şırınga pompası için kovalama solüsyonunu (%70 sakaroz, %10 gliserol ve %0.02 Bromofenol mavisi) hazırlayın.
2. Yoğunluk gradyan fraksiyonlayıcısını kontrol etmek için yazılım kullanın. Makineyi deiyonize su kullanarak kalibre edin. Kalibrasyondan sonra, polizom profili oluşturma yapmak için kullanın.
   1. Taban çizgisi ayarını yapmak için, ışık kırmızıdan yeşile dönene kadar UV/VISDelector'ı açın. İşaret çizgisini hizalamak için Kaydedici Ofset düğmesini ayarlayın, ardından Taban Çizgisi Ayarı düğmesini minimum açık konuma çevirin. UV/VISDETECTOR üzerindeki Hassasiyet düğmesini seviye 2.0'a ayarlayın ve Otomatik Taban Çizgisi düğmesine basın. Son olarak, istenen taban çizgisini 20'ye ayarlamak için Kaydedici Ofset düğmesini kullanın. Kalibre edilen işlem, mekanizmanın markasına ve farklı numunelere bağlı olarak değişecektir.
3. Ultrasantrifüjlemeden sonra, tüplerin bulunduğu tüpleri, tüp delme sistemini kullanarak yoğunluk gradyan fraksiyonatörüne yerleştirin, böylece tüp, takip çözeltisi ve UV dedektörü ile şırınga pompasına bağlanabilir.
4. Yoğunluk gradyan fraksiyonlayıcısını yazılım kontrol moduna (REMOTE) getirin ve mikro hacimli şırınga pompasının enjeksiyon akış hızını 3 mL/dk'ya ayarlayın.
5. OD_254'ü ölçerek fraksiyonatörü kullanarak polizom profil grafiğini başlatmak ve elde etmek için yazılım ayarlarını başlatın.

5. Polizomal olmayan ve polisomal RNA'nın izolasyonu

NOT: Protokolün bu kısmı için, daha önce açıklandığı gibi aynı adımlar izlenerek ultrasantrifüjleme gerçekleştirildikten sonra aynı partiden farklı bir numune grubu kullanıldı.

1. Polizom profili ölçüm sonuçlarına dayanarak, polisomal olmayan ve polisomal RNA fraksiyonlarını ayrı ayrı toplayın. Hem polizomal olmayan hem de polisomal fraksiyonlar için çözelti hacimlerini hesaplayın ve polizomal olmayan fraksiyonu (üst kısım) toplayın.
   NOT: Profillere göre, ikiden fazla ribozoma sahip fraksiyon polisomal fraksiyon olarak tanımlanırken, 40S, 60S ve 80S rRNA zirvelerine sahip fraksiyon, polizomal olmayan fraksiyon olarak tanımlanır.
2. RNA'nın hedef fraksiyonlarını önceden soğuk 2x yüksek tuz çözeltisi (400 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM KCl, 50 mM MgCl₂) ile iyice karıştırın.
3. Kitten 8 μL seyreltilmiş Ökaryotik Poli-A RNA Kontrolü stoğu ekleyin.
   NOT: Yedinci adım için gerekli olan ani normalleştirme için. Ökaryotik Poli-A RNA Kontrol Kiti, bitkilerde bulunmayan DAP geni gibi B. subtilis genlerini referans gen olarak içerir. Ekstraksiyondan sonra reaksiyon sırasında referans gen kaybının oranını belirlemek için, ekstraksiyondan önce polizomal olmayan veya polizomal RNA içeren farklı tüplere DAP geninin RNA örneğini içeren eşit miktarda reaktif ekleyin. Bu, ekstraksiyondan sonraki reaksiyon sırasında referans gen kaybının oranının belirlenmesine izin verir ve normalizasyon amaçları için kullanılabilir.
4. Yüksek tuzlu çözelti karışımlı RNA'yı 4 °C'de, 450.000 x g'da, bir ultrasantrifüj sallanan kova rotoru kullanarak 5 saat boyunca santrifüjleyin.
5. Ultrasantrifüjlemeden sonra, RNA santrifüj tüpünün dibinde çökelecektir. Alttaki RNA peletini korumak için süpernatanı yukarıdan dikkatlice dökün.
6. RNA peletini 500 μL önceden soğuk Dietilpirokarbonat (DEPC) ile arıtılmış su ile hızlı bir şekilde yıkayın ve bu adımı 3 kez tekrarlayın.
   NOT: DEPC ile arıtılmış suyun yıkama işlemi sırasında RNA'yı yeniden çözmesini önlemek için, çözünürlüğünü azaltmak için kullanmadan önce DEPC ile arıtılmış suyun önceden soğutulması gerekir. Ek olarak, yıkama sırasında DEPC ile arıtılmış su ile RNA peleti arasındaki temas süresi en aza indirilmelidir.

6. Polizomal olmayan ve polisomal RNA ekstraksiyonu

1. 500 μL RNA ekstraksiyon reaktifi ekleyin ve ekstrakte edilecek RNA numunesi ile karıştırın. 10 dakika inkübe edin.
2. 100 μL kloroform ekleyin, iyice karıştırın ve faz ayrımı için 10 dakika inkübe edin.
3. Reaksiyon karışımını 4 °C'de, 12.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. RNA içeren üst berrak sulu tabakayı yeni bir tüpe aktarın, eşit hacimde izopropanol ile nazikçe karıştırın ve RNA çökelmesi için -20 ° C'de 2 saat inkübe edin.
4. Çökeltmeden sonra, 4 °C'de, 12.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice atın ve RNA peletini altta tutun.
5. RNA peletini 1 mL önceden soğuk %75 etanol ile yıkayın. 4 ° C'de, 12.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin, süpernatanı atın ve RNA peletini havayla kurutun.
6. RNA peleti kuruduktan sonra, RNA peletini 30 μL DEPC ile arıtılmış suda yeniden süspanse edin ve tam spektrumlu (220 nm-750 nm) spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonunu (OD₂₆₀) ölçün.

7. Ani normalleşme

1. Üreticinin talimatlarına uygun olarak bir qPCR kiti kullanılarak yapılan ters transkripsiyon için 1000 ng ekstrakte edilmiş RNA kullanın. Hem polizomal olmayan hem de polizomal RNA'nın cDNA'ya ters kopyalanması gerekir.
2. 1 μL cDNA'yı DAP gen primerleri ile karıştırın ve üreticinin talimatına göre hedef genin ekspresyon seviyesini ölçmek için SYBR tamponunu kullanın. Ardından, DAP gen ekspresyonunu tespit etmek için gerçek zamanlı PCR kullanın.
   NOT: DAP geninin primerlerinin dizileri aşağıdaki gibidir:
   İleri astar = 5'-ATA, AAA, GAA, TTC, TTC, AAG, TAA, CGC, TTC, C-3'
   Ters astar = 5'-TTG TTT CTT TGC CTC TAT TGT ATC C-3'
3. Ölçülen polizomal olmayan ve polisomal RNA gruplarındaki DAP genlerinin ekspresyon seviyelerini karşılaştırın ve oransal kayıp koşulları altında RNA içeriğini tahmin edin. Normalleştirilmiş RNA içeriğini kullanarak, polizomlardaki RNA oranını hesaplayın.

Sonuçlar

Arabidopsis'in vahşi türü olan Col-0, MS ortamında 16 h: 8 h ışık fotoperiyodu altında büyütüldü. Kontrol için, ısı stresi işlemi yapılmadan 5 günlük fideler kullanıldı. Isı stresi grubu, önceden ısıtılmış bir su banyosunda 40 °C'de 1 saat ısıl işleme tabi tutulurken, geri kazanım grubu, ısıl işlemden hemen sonra 2 saat boyunca 22 °C'ye yerleştirildi. Farklı ısıl işlem koşulları ve geri kazanım koşulları kullanarak, translasyon veri...

Tartışmalar

Bu protokol, Arabidopsis fidelerinin çeviri verimliliğini ölçmek için basit ve standartlaştırılmış bir yöntemin ana hatlarını çizmektedir. Bu protokolün kritik adımları, ikincil santrifüjleme ve RNA ekstraksiyon reaktif ekstraksiyonu ile RNA stabilitesinin sağlanmasının yanı sıra sükroz gradyanının titiz bir şekilde hazırlanmasıdır. Ayrıca, spike-in normalizasyon yöntemi ile polizomal olmayan ve polizomal RNA'nın normalleştirilmesi ve miktarının belirl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf tube	Labcon	3012-870-000-9	RNA extraction
13.2 mL centrifuge tube	Beckman Coulter	331372	ultracentrifugation
Bromophenol blue	Honeywell	32712	Polysome profile
Chloroform	Honeywell	32211	RNA extraction
Cycloheximide (CHX)	Sigma-Aldrich	SI-C7698	Polysome profile
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	RNA extraction
Ethanol	Sigma-Aldrich	32221	RNA extraction
GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit	Invitrogen	900433	Normalization
Glycerol	Honeywell	15523	Normalization
Heparin	Sigma-Aldrich	SI-H3149	Polysome profile
HiScript III RT SuperMix for qPCR kit	Vazyme	R323-01	Normalization
KCl	J.T.Baker	3040-01	Polysome profile
MgCl2	Sigma-Aldrich	SI-M8266	Polysome profile
MS basal medium	Phyto	M524	Plant culture
Peak Chart Syringe Pump	Brandel	SYN4007LS	Polysome profile
Polyoxyethylene-10-Tridecyl-Ether (PTE)	Sigma-Aldrich	P2393	Polysome profile
RNasin	Promega	N251B	Polysome profile
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	SI-D6750	Polysome profile
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5391	Polysome profile
SYBR Green Supermix	Bio-Rad	BP170-8882	Normalization
TRI reagent	MRC	TR118	RNA extraction
Tris-HCl	J.T.Baker	4109-06	Polysome profile
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-100K	ultracentrifugation
UV/VISDETECTOR	Brandel	UA-6	Polysome profile