Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Özet

Burada sunulan protokol, ribozomlarla ilişkili mRNA'lar olan translatom'u, sakaroz yoğunluk gradyan santrifüjlemesi yoluyla Arabidopsis'ten polisomal olmayan ve polisomal RNA'lara izole etmek için polisomal profillemeyi içerir. Bu yöntem, ısı stresli Arabidopsis'in çeviri verimliliğini göstermektedir.

Özet

Isı stresi altında farklı genlerin translasyonel kontrolü, bitkinin çevreye adaptasyonu için kritik bir adımdır. Çeşitli genlerin translasyonel aktivitelerini değerlendirmek, bitki direncinin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamamıza yardımcı olabilir ve küresel iklim değişikliği karşısında gelişmiş stres toleransına sahip mahsullerin geliştirilmesine katkıda bulunabilir. Bu makale, ısı stresine maruz kalan bitkilerde polizom profillemesi yoluyla translasyon verimliliğini değerlendirmek için ayrıntılı bir metodoloji sunmaktadır. Prosedür üç bölüme ayrılmıştır: Arabidopsis için ısı stresi tedavisi, polizom profilleri kullanılarak translasyon verimliliği testi ve profile dayalı olarak polizomal olmayan ve polisomal RNA'yı izole ederek translasyon verimliliğinin hesaplanması. İlk bölümde, Arabidopsis bitkileri, çevresel zorlukları taklit etmek için kontrollü ısı stresi koşullarına tabi tutulur. Arıtma, bitkilerin belirli süreler boyunca yüksek sıcaklıklara maruz bırakılmasını ve tutarlı ve tekrarlanabilir stres indüksiyonunun sağlanmasını içerir. Bu adım, bitkinin ısı stresine verdiği fizyolojik ve moleküler tepkileri incelemek için çok önemlidir. İkinci bölüm, polizom profillemesi kullanılarak translasyon verimliliği testini içerir. Polizomlar, ribozomal yüklemeye dayalı olarak mRNA'ları ayıran sakaroz gradyan santrifüjlemesi yoluyla ekstrakte edilir. Bu, mRNA'lar üzerindeki ribozom doluluğunun incelenmesine izin vererek, stres koşulları altında translasyonel kontrol mekanizmaları hakkında bilgi sağlar. Üçüncü bölümde, RNA hem polizomal hem de polizomal olmayan fraksiyonlardan izole edilir. Spike-in RNA, her fraksiyondaki RNA miktarını doğru bir şekilde ölçmek için kullanılır. Translasyon verimliliğinin hesaplanması, normal ve ısı stresi koşulları altında mRNA'ların bu fraksiyonlar arasındaki dağılımı karşılaştırılarak gerçekleştirilir. Spesifik genlerin translasyon aktiviteleri, ribozomla ilişkili RNA ve toplam RNA ile kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) gerçekleştirilerek daha fazla değerlendirilir. Bu metodoloji, yalnızca ısı stresinin etkilerine odaklanır ve bitkilerde translasyonel düzenlemeyi analiz etmek için ayrıntılı bir protokol sağlar.

Giriş

Translasyon, organizmaların mRNA'dan fonksiyonel proteinleri sentezlemesi, temel hücresel fonksiyonları ve metabolizma ve sinyalleşme gibi biyolojik süreçleri desteklemesi ve stres tepkilerini etkinleştirmesi için çok önemlidir. Translasyon olmadan, hücreler hayati proteinleri üretemez, yapılarını, işlevlerini ve düzenlemelerini etkiler, böylece yaşamın sürdürülmesini ve biyolojik çeşitliliğin teşvik edilmesini etkiler 1,2. Bu nedenle, bitkilerin translasyon verimliliğini incelemek çok önemlidir. Çeviri birkaç temel adımı içerir. İlk olarak, başlatma, mRNA'nın bir ribozoma bağ....

Protokol

1. Isı stresi ile muamele edilmiş Arabidopsis fide numunesi hazırlama

  1. Murashige ve Skoog (MS) bazal media agar plakası üzerine yerleştirilen filtre kağıdı üzerine yerleştirilen filtre kağıdı üzerine yerleştirilen her replike için 250 tohum ve her koşul için 250 tohum sakaroz (pH 5.6) içermez ve %1.2 fitoagar ile desteklenir.
    NOT: MS plakalarına fidan dikmek için, fide köklerinin ortamın derinliklerine nüfuz etmesini önlemek için plaka üzerine steril filtre kağıdı yerleştirilir ve daha kolay numune almayı kolaylaştırır. Tohumlar daha sonra filtre kağıdının üzerine....

Temsili Sonuçlar

Arabidopsis'in vahşi türü olan Col-0, MS ortamında 16 h: 8 h ışık fotoperiyodu altında büyütüldü. Kontrol için, ısı stresi işlemi yapılmadan 5 günlük fideler kullanıldı. Isı stresi grubu, önceden ısıtılmış bir su banyosunda 40 °C'de 1 saat ısıl işleme tabi tutulurken, geri kazanım grubu, ısıl işlemden hemen sonra 2 saat boyunca 22 °C'ye yerleştirildi. Farklı ısıl işlem koşulları ve geri kazanım koşulları kullanarak, translasyon veri.......

Tartışmalar

Bu protokol, Arabidopsis fidelerinin çeviri verimliliğini ölçmek için basit ve standartlaştırılmış bir yöntemin ana hatlarını çizmektedir. Bu protokolün kritik adımları, ikincil santrifüjleme ve RNA ekstraksiyon reaktif ekstraksiyonu ile RNA stabilitesinin sağlanmasının yanı sıra sükroz gradyanının titiz bir şekilde hazırlanmasıdır. Ayrıca, spike-in normalizasyon yöntemi ile polizomal olmayan ve polizomal RNA'nın normalleştirilmesi ve miktarının belirl.......

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Yaşam Bilimleri Koleji'ndeki Technology Commons'tan ve Ulusal Tayvan Üniversitesi (Tayvan) Bilim ve Teknoloji Bakanlığı tarafından desteklenen Enstrümantasyon Merkezi'nden ultrasantrifüj teknik araştırma hizmetlerini kabul ediyoruz. Ayrıca teknik destek için Yu-Ling Liang'a ve el yazmasının eleştirel okuması için Cheng laboratuvar üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma, Tayvan'daki Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi'nden Young Scholar Fellowship Einstein Programı tarafından hibe nos kapsamında desteklenmiştir. NSTC 113-2636-B-002-007 - M.-C.C. M.-C.C., Ulusal Tayvan Üniversitesi'nden gelen mali desteği kabul eder.

....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL eppendorf tubeLabcon3012-870-000-9RNA extraction
13.2 mL centrifuge tubeBeckman Coulter331372ultracentrifugation
Bromophenol blueHoneywell32712Polysome profile
ChloroformHoneywell32211RNA extraction
Cycloheximide (CHX)Sigma-AldrichSI-C7698Polysome profile
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)Sigma-AldrichD5758RNA extraction
EthanolSigma-Aldrich32221RNA extraction
GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control KitInvitrogen900433Normalization
GlycerolHoneywell15523Normalization
HeparinSigma-AldrichSI-H3149Polysome profile
HiScript III RT SuperMix for qPCR kitVazymeR323-01Normalization
KClJ.T.Baker 3040-01Polysome profile
MgCl2Sigma-AldrichSI-M8266Polysome profile
MS basal mediumPhytoM524Plant culture
Peak Chart Syringe PumpBrandelSYN4007LSPolysome profile
Polyoxyethylene-10-Tridecyl-Ether (PTE)Sigma-AldrichP2393Polysome profile
RNasinPromegaN251BPolysome profile
Sodium deoxycholate (DOC) Sigma-AldrichSI-D6750Polysome profile
SucroseSigma-AldrichS5391Polysome profile
SYBR Green SupermixBio-RadBP170-8882Normalization
TRI reagentMRCTR118RNA extraction
Tris-HClJ.T.Baker 4109-06Polysome profile
UltracentrifugeBeckman CoulterOptima L-100Kultracentrifugation
UV/VISDETECTORBrandelUA-6Polysome profile

Referanslar

  1. Picard, F., Loubière, P., Girbal, L., Cocaign-Bousquet, M. The significance of translation regulation in the stress response. BMC genomics. 14, 1-11 (2013).
  2. Yuan, S., Zhou, G., Xu, G. Translation machinery: the basis of tran....

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

This article has been published

Video Coming Soon

Sitemizdeki deneyiminizi iyileştirmek için çerezleri kullanıyoruz

Sitemizi kullanmaya devam ederek ya da "Devam et" butonuna tıklayarak, çerezleri kabul edebilirsiniz.