Shu-Mu 脑肾穴位 经 下丘脑-垂体-睾丸轴治疗大鼠少弱精症的机制

摘要

本研究旨在验证淑睑脑肾穴对大鼠少弱精症的治疗效果，并通过下丘脑-垂体-睾丸 （HPT） 轴探讨其潜在机制。

摘要

少弱精症是男性不育症的常见原因。下丘脑-垂体-睾丸 （HPT） 轴通过生殖激素的合成和释放来调节性腺分化和成熟，在男性生育能力中起着至关重要的作用。破坏 HPT 轴稳定性会损害精子的产生，从而降低精液质量。研究电针对 HPT 轴调节的影响可能为治疗少弱精症提供见解。将 50 只 8 周龄雄性 SD 大鼠随机分为空白组、模型组、Shu-Mu 脑肾组、非穴位组和 L-肉碱组 （每组 n = 10）。除空白组外，大鼠胃内接受腺嘌呤 28 d 建立模型。造模后，Shu-Mu 脑肾组在指定穴位接受电针治疗，非穴位组每天接受 30 min 的假治疗。左旋肉碱组接受左旋肉碱 （10 mL/kg） 灌胃，每日 1 次。治疗持续 28 天。评估一般情况、器官系数和精液质量。HE 染色分析组织形态，ELISA 检测血清激素变化。与模型组相比，Shu-Mu Brain-Kidney 和 L-carnitine 组在精神、饮食和排便方面表现出显着改善，体重增加，而非穴位组没有显着变化。Shu-Mu 脑肾组和 L-肉碱组肾器官系数显著降低，但非穴位组保持不变。睾丸器官系数显示治疗组间无显著差异。Shu-Mu 脑肾组和 L-肉碱组的精子数量、密度、存活率和活力率显着提高，但非穴位组没有。H&E 染色显示 Shu-Mu 脑肾和 L-肉碱组的肾脏和睾丸组织损伤得到改善。ELISA 显示这些组 T 、 GnRH 和 INHB 升高，LH 、 FSH 、 E2 和 PRL 水平降低 （p < 0.001），非穴位组无显著变化。这些发现表明，Shu-Mu 脑肾穴位疗法通过调节 HPT 轴来提高精子质量，为少弱精子症提供了潜在的治疗方法。

引言

少弱精症分为“少精症”和“弱精症”，是男性不育症的常见类型之一，发病率约占男性不育病例的 75%¹。少弱精症的主要特征是睾丸中精子密度和活力降低，临床上主要表现为精子发生障碍、精子数量减少和精子活力低下 ^2,3。近年来，少弱精症的发病率逐年增加⁴ 年。如果不进行有效治疗，将对患者的身心健康甚至家庭和谐产生长期的不利影响⁵。研究表明，遗传问题⁶（genetic problems）、生殖内分泌失调⁷（reproductive endocrine disorders）、泌尿生殖道感染⁸（urogenital tract infections）和化学药物⁹（chemical drugs）会影响精子的产生和成熟，导致精液质量下降。目前，提高受损精子的质量已成为医学领域的一个具有挑战性的问题。

下丘脑-垂体-睾丸 （HPT） 轴是体内生殖调节的主要途径，可通过刺激下丘脑、垂体和睾丸相关的生殖激素的合成和释放来调节性腺的分化和成熟，在维持正常的男性生殖功能方面发挥着重要作用¹⁰.如果 HPT 轴功能的稳定性被破坏，将导致睾丸分泌不足，无法达到生理浓度的睾丸激素，导致睾丸中精子的数量和质量下降¹¹。因此，少弱精子症的治疗主要目的是调节 HPT 轴的功能，达到维持相关内分泌激素平衡的目的，从而增加精液中精子的数量，增强精子活性，提高精液质量。

在少弱精子症的临床治疗中，现代医学主要采用手术和抗氧化、增强精子活力的药物等方法^12,13，^而电针疗法则结合了传统中医针灸和现代医学生物电。它具有快速准确、疗效明显、不良反应少、适用疾病范围广、治疗费用低等优点，对少弱精子症有很好的治疗效果^14,15。“背是阳，腹是阴。”蜀木穴组合将蜀穴与穆穴相结合，一前一后，一阴一阳，共同作用，又称前后穴位组合法。中医 （TCM） 认为肾脏是产前精华的根，疾病位于肾脏。选择肾前牟穴荆门（GB25）和后蜀穴（BL23），具有暖肾、助阳、阴内寻阳的作用^16,17;肾储精支配骨髓生产，大脑是骨髓的海洋和所有阳的交汇处，太溪（KI3）是足少阴肾经的源点，可以调理补肝补肾，养阴，生成骨髓¹⁸。与益散仙 （MS4） 结合，连肾健脑，体现了中医¹⁹ 中“淑木脑肾穴结合”的思路，治疗效果比普通针灸更明显。

目前关于精液质量的治疗研究主要集中在改善睾丸结构和功能上，而对下丘脑-垂体-睾丸 （HPT） 轴²⁰ 不同组织中血清激素水平的调节进行了有限的研究。在初步研究中，使用 RNA 测序 （RNA-Seq） 鉴定健康大鼠和腺嘌呤诱导的少精症模型大鼠下丘脑、垂体和睾丸组织内参与精液质量调节的候选基因和调控途径²¹。此外，对两组进行精液质量检测和睾丸组织组织学分析。这些发现为腺嘌呤诱导的少弱精症大鼠精液质量的分子机制提供了见解。远近穴位电针治疗可通过调节 HPT 轴改善少弱精症大鼠精子质量，其效果与氧化应激过程有关²²。然而，尚不清楚 Shu-Mu 脑肾穴是否可以通过调节 HPT 轴来提高大鼠的精液质量。为进一步探讨改善少弱精症大鼠精液质量的调控机制及有效治疗方法，本研究采用腺嘌呤诱导的少弱精症大鼠模型，选取散三仙、神书、荆门、太溪4个穴位，从HPT轴方面探讨蜀木脑肾穴对大鼠少弱精症治疗作用的相关机制， 为临床治疗提供更科学的依据。

研究方案

所有动物实验均由宁夏医科大学动物伦理委员会审核通过（批准号：IACUC-NYLAC-2021-130）。该研究严格按照 ARRIVE 动物实验指南 2.0 进行，并遵守 NIH 实验动物护理和使用指南中描述的动物福利原则。这项随机对照动物研究采用单因素方差分析，于 2023 年 3 月至 5 月在宁夏医科大学动物实验中心进行。本研究采用体重 180-220 g 的 8 周龄 SPF 级雄性 SD 大鼠。所用试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 动物模型的建立和处理程序

1. 实验动物和群体
   1. 获得 50 只体重为 180-220 克的 8 周龄 SPF 级雄性 SD 大鼠。
   2. 在标准条件下饲养所有大鼠，保持 22-25 °C 的室温，50%-60% 的湿度，并免费提供标准啮齿动物饲料和水。
   3. 适应一周后，使用随机数字表方法将大鼠随机分为空白 （B） 组 （n = 10） 和建模组 （n = 40）。空白组给予生理盐水，通过口服强饲法给予腺嘌呤给建模组。
   4. 28 天后，将建模组随机分为模型 （M） 组、Shu-Mu 脑肾 （S） 组、非穴位 （N） 组和 L-肉碱 （L） 组 （每组 n = 10）。不处理模型组。
      1. 使用 Shu-Mu 脑肾穴位匹配方法对 Shu-Mu 脑肾组进行电针干预。对非穴位组进行非穴位治疗，对左旋肉碱组进行管饲法给予左旋肉碱口服液。连续治疗所有组 28 天。
2. 模型构建
   注意：研究表明，高剂量的腺嘌呤会影响大鼠的睾丸功能，导致性激素分泌异常，破坏 HPT 轴的功能稳定性，以及精子质量下降²³。因此，腺嘌呤通常用于建立雄性动物不育模型。
   1. 通过口服强饲法向空白组施用生理盐水（1 mL/100 g 体重），向模型组施用腺嘌呤（20 mg/100 g 体重）（图 1A）。
   2. 确保在管饲过程中持续搅拌，以防止腺嘌呤沉淀和管饲针堵塞。每天一次治疗，持续 28 天。
3. 1.3 处理程序
   1. Shu-Mu 脑肾组
      1. 在建模后的第一天开始干预。使用一次性无菌针灸针对双侧穴位进行针刺。固定大鼠后，对穴位进行暴露和消毒。
      2. 左手固定穴位皮肤，右手用一次性无菌针灸针快速刺穿穴位。连接电刺激器。以 2 Hz 的电针频率、1.5 mA 的刺激强度和局部肌肉的轻微震颤施加扩张波。
      3. 每次进行电针治疗 30 分钟，每天一次，连续 28 天（图 1B）。
         注：参考唐勇的 《实验针灸科学》附录 II，“实验动物常用的穴位”，结合比较解剖穴位选择法¹⁹ 选择大鼠的穴位。选择以下点：（1） Epangsanxian （MS4）：位于头尾点下方 3 mm 和外侧 4 mm。作：直刺 1-2 mm;（2） 神书 （BL23）：位于脊柱区，第二腰椎下棘突两侧，正中背线旁 6 mm。作：直刺 6 mm;（3）荆门（GB25）：位于侧腰部，下侧第 13 肋的自由端。作：直刺 1-2 mm;（4） 太西 （KI3）：位于足内侧，踝内侧高点与跟腱后缘之间的凹陷处。作：直刺 3 mm。
   2. 非穴位组
      1. 以与 Shu-Mu 脑肾组相同的方式选择和作非穴位 1、2 和 3（图 1B）。
         注：由于非穴位不遵循沿经络择点的原则，根据中医理论和长期临床观察，这三个穴位对弱精子症患者治疗效果不大²⁴。（1） 非穴位 1：位于肘部内侧肘尖和腋窝之间的线的中点。作：直刺 1-2 mm;（2） 非穴位 2：位于肱骨内上髁和尺骨腕部之间的中点，尺骨边缘。作：直刺 1-2 mm;（3） 非穴位 3：位于手臂内侧三角肌前肌和二头肌的交汇处。作：直刺 1-2 毫米。
   3. 左旋肉碱基团
      1. 通过口服强饲法以 10 mL/kg 体重的剂量施用左旋肉碱口服液，每天一次，连续 28 天（图 1A）。
4. 安乐死
   1. 治疗后，让所有大鼠禁食 24 小时，通过腹膜内注射 2% 戊巴比妥钠 （40 mg/kg 体重，遵循机构批准的方案） 麻醉它们，并使用一次性静脉采血针从心尖采集血液^21,24。
   2. 斩首死亡后，去除附睾的一侧以测量精液质量。收获肾脏和睾丸组织，称重并记录，并在室温下用多聚甲醛固定剂固定 48 小时，然后将它们包埋在石蜡²⁴ 中。

2. 观测指数

1. 一般观察：观察大鼠的精神状态、饮食和排便情况，并每天监测它们的体重。
2. 器官系数：死后，小心地去除肾脏和睾丸组织的表面脂肪和结缔组织，用生理盐水冲洗，用滤纸擦干，在天平上称重，并记录测量值以计算器官系数。器官系数 （%） =（器官重量 [g] / 体重 [g]） x 100%。
3. 精液质量
   1. 去除多余的脂肪后，取出每只大鼠的附睾一侧并将其置于 37 °C 的恒温水浴中 5 分钟。然后，切割、过滤、轻轻吹动并充分混合样品。
   2. 取 10 μL 稀释的精子悬液等分试样，将其滴到预热的计数板的盖玻片边缘，让精子悬液自动渗透到计数室中。
   3. 使用 CASA（计算机辅助精液分析）系统测量精子数量、密度、存活率和活力率²¹。
4. 苏木精和伊红 （H&E） 染色
   注：有关该程序的详细信息，请参阅 Yang， N. et ^al.21。
   1. 用流水冲洗固定的组织，脱水，然后包埋。
   2. 使用切片机切下石蜡切片（5 μm 厚），并在 65 °C 下烘烤 4 小时。
   3. 对切片脱蜡并用水重新水化。
   4. 用苏木精染色液对切片染色 3 分钟，然后用流水冲洗。
   5. 用 95% 乙醇将切片脱水 1 分钟，然后用伊红溶液染色 2 分钟。
   6. 密封载玻片后，使用载玻片扫描仪进行扫描，并收集和分析图像。
5. 酶联免疫吸附测定 （ELISA）
   注：有关该程序的详细信息，请参阅 Yang， N. et ^al.21。
   1. 为了制备血清，将相应浓度的标准物质和血清加入到标准物质孔和待测样品孔中，然后加入酶标记试剂。
   2. 执行孵育、洗涤、显色和终止步骤。
   3. 使用酶标记仪器测定 450 nm 波长处的吸光度，并计算睾酮 （T）、促性腺激素释放激素 （GnRH）、抑制素 B （INHB）、黄体生成素 （LH）、卵泡刺激素 （FSH）、雌二醇 （E2） 和催乳素 （PRL） 的表达水平。

3. 统计分析

1. 使用统计软件分析实验数据，并将每组的结果表示为平均值±标准差 （平均值± SD）。
2. 使用单因子方差分析可以比较满足方差正态性和同质性假设的多个组之间的样本均值。
3. 使用 t 检验 进行两组之间的比较，对不满足上述假设的数据使用非参数检验。
4. 当 p < 0.05 时，考虑具有统计显著性的差异。

结果

模型评估

造模后观察大鼠有无嗜睡、蹲伏姿势、四肢冰冷、不愿进食、体重减轻、尿量增加、稀便等症状，这些症状通常与肾阳虚证相符。

解剖后，观察肾脏坚韧、洁白且较重。H&E 染色显示模型大鼠的肾脏和睾丸组织损伤严重，肾小球形状?...

讨论

在中医中，“肾”由“内肾”和“外肾”组成，前者是指现代医学中泌尿系统的功能，后者是指下丘脑-垂体-性腺轴和解剖学上的外部生殖器官²⁵。雄性精囊属于“外肾”，其组成部分包括睾丸、附睾、精囊等²⁶。中医认为精是人体的物质基础，“肾精”包括从父母那里继承的“产精”和脾胃转化水粮精产生的“产精”，用于养五脏六肠...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine	Beijing Solarbio Science & Technology Co. Ltd.	A8330
CASA computer-assisted semen analysis system	Nanning Songjing Tianlun Biotechnology Co., Ltd.	VICOS-SPERM
Centrifuge	Sartorius	A-14C
Differentiation fluid	Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd	C0163M
Disposable sterile acupuncture needles	Hanyi brand	0.25mm*13mm
Drying machine	Leica	HI1220
Electrical stimulator	Hua Tuo Brand	SDZ-II
Electronic balance	Hangzhou Youheng Weighing Equipment Co., Ltd	HLD-6002
ELISA kit	Shanghai Jianglai Biotechnology Co. LTD	JL13251?JL11473?JL11525?JL12505?JL13256?JL12201
Enzyme-labeled instrument	Rayto	RT-6100
Eosin staining solution	Zhuhai Beso Biotechnology Co. LTD	BA-4024
Hematoxylin staining solution	Zhuhai Beso Biotechnology Co. LTD	BA-4041
Levocarnitine oral liquid	Northeast Pharmaceutical Group Shenyang First Pharmaceutical Co. LTD.	H19990372
Microtome	Leica	RM2255
Neutral balsam	Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd	Zli-9555
Paraffin embedding machine	Leica	HistoCore Arcadia H
SD rat, 8-week-old, Male, 180-220 g	144 Animal Center of Ningxia Medical University
Slide scanner	Leica	Aperio LV1
Vortex oscillator	Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd	QL-902