Sıçanlarda Oligoastenospermi Tedavisinde Shu-Mu Beyin-Böbrek Akupunktur Noktasının Hipotalamik-Hipofiz-Testis Ekseni ile Mekanizması

Özet

Bu çalışma, Shu-Mu Beyin-Böbrek akupunktur noktasının sıçanlarda oligoastenospermi üzerindeki terapötik etkisini doğrulamayı ve hipotalamik-hipofiz-testis (HPT) ekseni aracılığıyla altta yatan mekanizmasını araştırmayı amaçlamaktadır.

Özet

Oligoastenospermi, erkek infertilitesinin yaygın bir nedenidir. Hipotalamik-hipofiz-testiküler (HPT) ekseni, üreme hormonu sentezi ve salınımı yoluyla gonadal farklılaşmayı ve olgunlaşmayı düzenler ve erkek doğurganlığında hayati bir rol oynar. HPT ekseni stabilitesinin bozulması sperm üretimini bozarak semen kalitesini düşürür. Elektroakupunkturun HPT eksen regülasyonu üzerindeki etkisinin araştırılması, oligoastenospermi tedavisinde fikir verebilir. Elli 8 haftalık erkek SD sıçan rastgele boş, model, Shu-Mu Beyin-Böbrek, akupunktur noktası olmayan ve L-karnitin gruplarına ayrıldı (grup başına n = 10). Boş grup dışında, sıçanlar modeli oluşturmak için 28 gün boyunca intragastrik olarak adenin aldı. Modelleme sonrası, Shu-Mu Beyin-Böbrek grubuna belirlenen akupunktur noktalarında elektroakupunktur uygulanırken, akupunktur noktası olmayan gruba günde 30 dakika boyunca sahte tedavi uygulandı. L-karnitin grubuna günde bir kez intragastrik olarak L-karnitin (10 mL/kg) verildi. Tedaviler 28 gün boyunca devam etti. Genel durumlar, organ katsayıları ve semen kalitesi değerlendirildi. HE boyaması doku morfolojisini analiz etti ve ELISA serum hormonu değişikliklerini tespit etti. Model grubuyla karşılaştırıldığında, Shu-Mu Beyin-Böbrek ve L-karnitin grupları, vücut ağırlığının artmasıyla birlikte ruh, diyet ve bağırsak hareketlerinde önemli gelişmeler sergilerken, akupunktur noktası olmayan grup önemli bir değişiklik göstermedi. Renal organ katsayıları Shu-Mu Beyin-Böbrek ve L-karnitin gruplarında önemli ölçüde azaldı, ancak akupunktur noktası olmayan grupta değişmeden kaldı. Testis organ katsayıları tedavi grupları arasında anlamlı fark göstermedi. Sperm sayısı, yoğunluğu, sağkalım ve motilite oranları Shu-Mu Beyin-Böbrek ve L-karnitin gruplarında önemli ölçüde iyileşti, ancak akupunktur noktası olmayan grupta değil. H&E boyaması, Shu-Mu Beyin-Böbrek ve L-karnitin gruplarında iyileşmiş böbrek ve testis dokusu hasarı gösterdi. ELISA, bu gruplarda artmış T, GnRH ve INHB ve azalmış LH, FSH, E2 ve PRL seviyelerini ortaya çıkardı (p < 0.001), akupunktur noktası olmayan grupta anlamlı bir değişiklik olmadı. Bu bulgular, Shu-Mu Beyin-Böbrek akupunktur noktası tedavisinin, HPT eksenini düzenleyerek sperm kalitesini iyileştirdiğini ve oligoastenospermi için potansiyel bir tedavi sunduğunu göstermektedir.

Giriş

"Oligospermi" ve "astenospermi" olarak ikiye ayrılan oligoastenospermi, erkek kısırlığı vakalarının yaklaşık %75'ini oluşturan insidans oranı ile yaygın erkek kısırlığı türlerinden biridir¹. Oligoastenospermi esas olarak testislerde azalmış sperm yoğunluğu ve motilitesi ile karakterizedir ve çoğunlukla klinik olarak spermatogenez bozukluğu, azalmış sperm sayısı ve düşük sperm motilitesi ile kendini gösterir ^2,3. Son yıllarda oligoastenospermi görülme sıklığı yıldan yıla artmıştır⁴. Etkili tedavi olmadan, hastaların fiziksel ve zihinsel sağlığı ve hatta aile uyumu üzerinde uzun vadeli olumsuz etkileri olacaktır⁵. Çalışmalar, genetik problemlerin⁶, üreme endokrin bozukluklarının⁷, ürogenital sistem enfeksiyonlarının⁸ ve kimyasal ilaçların⁹ sperm üretimini ve olgunlaşmasını etkileyerek semen kalitesinde düşüşe yol açabileceğini göstermiştir. Şu anda, hasarlı spermin kalitesinin iyileştirilmesi tıp alanında zorlu bir sorun haline gelmiştir.

Hipotalamik-hipofiz-testiküler (HPT) ekseni, hipotalamus, hipofiz bezi ve testislerle ilgili üreme hormonlarının sentezini ve salınımını uyararak gonadların farklılaşmasını ve olgunlaşmasını düzenleyebilen vücuttaki üreme düzenlemesinin ana yoludur ve normal erkek üreme fonksiyonunun sürdürülmesinde önemli bir rol oynar¹⁰. HPT eksen fonksiyonunun stabilitesi bozulursa, testis sekresyonunun testosteronun fizyolojik konsantrasyonuna ulaşmak için yetersiz kalmasına neden olur ve bu da testis^11'deki sperm sayısında ve kalitesinde bir azalmaya neden olur. Bu nedenle, oligoastenospermi tedavisi esas olarak HPT ekseninin işlevini düzenlemeyi ve ilgili endokrin hormonların dengesini koruma amacına ulaşmayı, böylece menideki sperm sayısını artırmayı, sperm aktivitesini arttırmayı ve semen kalitesini iyileştirmeyi amaçlar.

Oligoastenosperminin klinik tedavisinde, modern tıp esas olarak cerrahi ve anti-oksidasyon ilaçları gibi yöntemleri benimser ve sperm motilitesini^{arttırır 12,13}, ^{elektroakupunktur} tedavisi ise geleneksel Çin akupunkturu ve modern tıbbi biyoelektriği birleştirir. Hızlı ve doğru olması, belirgin bir iyileştirici etkiye sahip olması, az sayıda yan versit reaksiyona sahip olması, uygun hastalıkların geniş bir yelpazede bulunması ve düşük tedavi maliyeti, oligoastenospermi üzerinde iyi bir tedavi etkisine sahip olması gibi avantajlara sahiptir^14,15. "Sırt yang ve karın yin." Shu-Mu akupunktur noktası kombinasyonu, Shu noktalarını, biri önde diğeri arkada, biri yin ve biri yang olmak üzere Mu noktalarıyla birleştirir ve birlikte çalışır, aynı zamanda ön-arka akupunktur noktası kombinasyon yöntemi olarak da bilinir. Geleneksel Çin tıbbı (TCM), böbreğin doğum öncesi özün kökü olduğuna ve hastalığın böbrekte bulunduğuna inanmaktadır. Böbreğin Ön-mu noktası, Jingmen (GB25) ve Arka-shu noktası, Shenshu (BL23) seçilir, bu da böbreği ısıtma, yang'a yardım etme ve yin^16,17 içinde yang arama etkisine sahiptir; böbrek özü depolar ve ilik üretimini yönetir, beyin ilik denizi ve tüm yang'ın buluşma yeridir ve Taixi (KI3), karaciğeri ve böbreği düzenleyebilen ve tonlayabilen, yin'i besleyebilen ve ilik üretebilen ayak Shaoyin böbrek meridyeninin kaynak noktasıdır¹⁸. Epangsanxian (MS4) ile birleştiğinde, TCM^19'daki "Shu-Mu Beyin-Böbrek akupunktur noktası kombinasyonu" fikrini yansıtan böbrek ve beyni birbirine bağlar ve terapötik etki sıradan akupunkturdan daha belirgindir.

Semen kalitesi ile ilgili güncel tedavi çalışmaları öncelikle testis yapısını ve fonksiyonunu iyileştirmeye odaklanırken, hipotalamik-hipofiz-testis (HPT) ekseninin farklı dokularında serum hormon seviyelerinin düzenlenmesi üzerine sınırlı araştırma yapılmıştır²⁰. Ön araştırmada, sağlıklı sıçanların ve adenin kaynaklı oligozoospermi modeli sıçanların hipotalamik, hipofiz ve testis dokularında semen kalitesinin düzenlenmesinde rol oynayan aday genleri ve düzenleyici yolları tanımlamak için RNA dizilimi (RNA-Seq) kullanıldı²¹. Ek olarak, her iki grupta da semen kalite testi ve testis dokularının histolojik analizi yapıldı. Bu bulgular, adenin ile indüklenen oligoastenospermi sıçanlarında semen kalitesinin altında yatan moleküler mekanizmalar hakkında bilgi sağlamıştır. Uzak yaklaşık akupunktur noktası ile elektroakupunktur tedavisi, HPT eksenini düzenleyerek oligoastenospermi sıçanlarında sperm kalitesini artırabilir ve etki oksidatif stres süreci ile ilgilidir²². Bununla birlikte, Shu-Mu Beyin-Böbrek akupunktur noktasının, HPT eksenini düzenleyerek sıçanların semen kalitesini iyileştirip iyileştiremeyeceği bilinmemektedir. Oligoastenospermi sıçanlarında semen kalitesini iyileştirmenin düzenleyici mekanizmasını ve etkili tedavi yöntemlerini daha fazla araştırmak için, bu çalışmada adenin kaynaklı bir sıçan oligoastenospermi modeli kullanıldı ve Shu-Mu Beyin-Böbrek akupunktur noktasının sıçanlarda oligoastenospermi üzerindeki terapötik etkisinin ilgili mekanizmasını HPT ekseni açısından araştırmak için dört akupunktur noktası, Epangsanxian, Shenshu, Jingmen ve Taixi seçildi. klinik tedavi için daha bilimsel bir temel sağlar.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Ningxia Tıp Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır (onay numarası: IACUC-NYLAC-2021-130). Çalışma, hayvan deneyleri için ARRIVE Yönergeleri 2.0'a sıkı sıkıya bağlı kalınarak gerçekleştirildi ve NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nda açıklanan hayvan refahı ilkelerine bağlı kaldı. Bu randomize kontrollü hayvan çalışması, tek yönlü varyans analizi kullandı ve Mart-Mayıs 2023 tarihleri arasında Ningxia Tıp Üniversitesi Hayvan Deney Merkezi'nde gerçekleştirildi. Bu çalışma için 180-220 g ağırlığındaki sekiz haftalık SPF dereceli erkek SD sıçanlar kullanıldı. Kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Hayvan modeli oluşturma ve tedavi işlemleri

1. Deney hayvanları ve grupları
   1. 180-220 g ağırlığında elli adet 8 haftalık SPF dereceli erkek SD sıçan elde edin.
   2. Tüm sıçanları standart koşullar altında barındırın, oda sıcaklığını 22-25 °C, nem oranını %50-60 arasında tutun ve standart kemirgen yemi ve suyuna serbest erişim sağlayın.
   3. Bir haftalık adaptasyondan sonra, rasgele sayı tablosu yöntemini kullanarak fareleri rastgele bir boş (B) grubuna (n = 10) ve bir modelleme grubuna (n = 40) bölün. Boş gruba normal salin ve modelleme grubuna oral gavaj ile adenin uygulayın.
   4. 28 gün sonra, modelleme grubunu rastgele bir model (M) grubuna, Shu-Mu Beyin-Böbrek (S) grubuna, akupunktur noktası olmayan (N) gruba ve L-karnitin (L) grubuna (grup başına n = 10) bölün. Model grubunu tedavi edilmeden bırakın.
      1. Shu-Mu Beyin-Böbrek grubuna Shu-Mu Beyin-Böbrek akupunktur noktası eşleştirme yöntemini kullanarak elektroakupunktur müdahalesi uygulayın. Akupunktur noktası olmayan gruba akupunktur noktası olmayan tedavi ve L-karnitin grubuna gavaj yoluyla L-karnitin oral sıvısı uygulayın. Tüm grupları 28 gün boyunca sürekli olarak tedavi edin.
2. Model yapımı
   NOT: Çalışmalar, yüksek dozda adenin sıçanlarda testis fonksiyonunu etkileyebileceğini, seks hormonlarının anormal salgılanmasına, HPT ekseninin fonksiyonel stabilitesinin bozulmasına ve sperm kalitesinde düşüşe yol açabileceğini göstermiştir²³. Bu nedenle, adenin, erkek hayvan kısırlık modelleri oluşturmak için yaygın olarak kullanılır.
   1. Boş gruba normal salin (1 mL / 100 g vücut ağırlığı) ve oral gavaj ile model grubuna adenin (20 mg / 100 g vücut ağırlığı) uygulayın (Şekil 1A).
   2. Adenin çökelmesini ve gavaj iğnesinin tıkanmasını önlemek için gavaj sırasında sürekli çalkalama sağlayın. Tedaviyi 28 gün boyunca günde bir kez uygulayın.
3. 1.3 Tedavi prosedürü
   1. Shu-Mu Beyin-Böbrek grubu
      1. Modellemeden sonraki ilk gün müdahaleye başlayın. Tek kullanımlık steril akupunktur iğneleri ile iki taraflı noktalara akupunktur yapın. Fareyi sabitledikten sonra, akupunktur bölgesini açığa çıkarın ve dezenfekte edin.
      2. Akupunktur bölgesinin cildini sol elinizle sabitleyin ve sağ elinizdeki tek kullanımlık steril akupunktur iğnesi ile akupunktur noktasını hızlı bir şekilde delin. Bir elektrik stimülatörü bağlayın. Elektroakupunktur frekansı 2 Hz, stimülasyon yoğunluğu 1.5 mA ve lokal kasın hafif titremesi ile dilatasyon dalgaları uygulayın.
      3. Art arda 28 gün boyunca, günde bir kez, her seferinde 30 dakika boyunca elektroakupunktur tedavisi uygulayın (Şekil 1B).
         NOT: Yong Tang'ın Deneysel Akupunktur ve Yakı Bilimi, Ek II, "Deney Hayvanlarında Yaygın Olarak Kullanılan Akupunktur Noktaları"na atıfta bulunarak sıçanlarda akupunktur noktalarını seçin, karşılaştırmalı anatomik nokta seçim yöntemi¹⁹ ile birlikte. Aşağıdaki noktalar seçildi: (1) Epangsanxian (MS4): Touwei noktasının 3 mm altında ve 4 mm dışında bulunur. Çalışma: 1-2 mm düz delin; (2) Shenshu (BL23): Omurga bölgesinde, ikinci bel omurun alt omurga sürecinin her iki yanında, medyan sırt çizgisinin 6 mm yanında bulunur. Çalışma: 6 mm düz delin; (3) Jingmen (GB25): Yan belde, alt taraftaki 13. kaburganın serbest ucunda bulunur. Çalışma: 1-2 mm düz delin; (4) Taixi (KI3): Ayağın iç tarafında, medial ayak bileğinin yüksek noktası ile Aşil tendonunun arka kenarı arasındaki çöküntüde bulunur. Çalışma: 3 mm düz delin.
   2. Akupunktur noktası olmayan grup
      1. Akupunktur noktası olmayan 1, 2 ve 3'ü Shu-Mu Beyin-Böbrek grubuyla aynı şekilde seçin ve çalıştırın (Şekil 1B).
         NOT: Akupunktur olmayan noktalar meridyenler boyunca nokta seçimi prensibine uymadığından ve Geleneksel Çin Tıbbı (TCM) teorisine ve uzun süreli klinik gözlemlere göre, bu üç akupunktur noktasının oligoastenozoospermi²⁴ olan hastalar üzerinde çok az terapötik etkisi vardır. (1) Akupunktur noktası olmayan 1: Dirseğin iç tarafında dirsek ucu ile koltuk altı arasındaki çizginin orta noktasında bulunur. Çalışma: 1-2 mm düz delin; (2) Akupunktur olmayan 2: Humerusun medial epikondili ile ulnanın el bileği arasındaki orta noktada, ulnar kenarda bulunur. Çalışma: 1-2 mm düz delin; (3) Akupunktur noktası olmayan 3: Ön deltoid kas ile iç koldaki pazı kasının kesiştiği noktada bulunur. Çalışma: 1-2 mm düz delin.
   3. L-karnitin grubu
      1. Levokarnitin oral sıvısını, art arda 28 gün boyunca günde bir kez 10 mL / kg vücut ağırlığı dozunda oral gavaj ile uygulayın (Şekil 1A).
4. Ötanazi
   1. Tedaviden sonra, tüm sıçanların 24 saat oruç tutmasına izin verin, intraperitoneal %2 pentobarbital sodyum enjeksiyonu (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek 40 mg / kg vücut ağırlığı) ile anestezi yapın ve tek kullanımlık bir intravenöz kan alma iğnesi kullanarak kalbin tepesinden kan toplayın^21,24.
   2. Dekapitasyon ile ölümden sonra, meni kalitesini ölçmek için epididimin bir tarafını çıkarın. Böbrek ve testis dokularını toplayın, tartın ve kaydedin ve parafin^24'e gömmeden önce oda sıcaklığında 48 saat paraformaldehit fiksatifinde sabitleyin.

2. Gözlem endeksleri

1. Genel gözlem: Sıçanların zihinsel durumunu, diyetini ve bağırsak hareketlerini gözlemleyin ve vücut ağırlıklarını günlük olarak izleyin.
2. Organ katsayıları: Ölümden sonra, hem böbrek hem de testis dokularından yüzey yağını ve bağ dokusunu dikkatlice çıkarın, normal tuzlu su ile durulayın, filtre kağıdı ile kurulayın, bir teraziye tartın ve organ katsayılarının hesaplanması için ölçümleri kaydedin. Organ katsayısı (%) = (organ ağırlığı [g] / vücut ağırlığı [g]) x %100.
3. Semen kalitesi
   1. Fazla yağı çıkardıktan sonra, epididimin bir tarafını her sıçandan çıkarın ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de sabit sıcaklıktaki bir su banyosuna yerleştirin. Ardından kesin, süzün, hafifçe üfleyin ve numuneyi iyice karıştırın.
   2. Seyreltilmiş sperm süspansiyonunun 10 μL'lik bir alikotunu alın ve önceden ısıtılmış bir sayma plakasının kapak camının kenarına bırakın, böylece sperm süspansiyonunun otomatik olarak sayma odasına nüfuz etmesine izin verin.
   3. Bir CASA (bilgisayar destekli semen analizi) sistemi kullanarak sperm sayısını, yoğunluğunu, hayatta kalma oranını ve motilite oranını ölçün²¹.
4. Hematoksilen ve Eozin (H & E) boyama
   NOT: Prosedürle ilgili ayrıntılar için Yang, N. ve ^ark.21'e bakın.
   1. Sabit dokuları akan su ile durulayın, kurutun ve gömün.
   2. Bir mikrotom kullanarak parafin bölümlerini (5 μm kalınlığında) kesin ve 65 ° C'de 4 saat pişirin.
   3. Bölümleri mumdan arındırın ve suyla yeniden sulandırın.
   4. Bölümleri hematoksilen boyama solüsyonu ile 3 dakika boyayın, ardından akan su ile durulayın.
   5. Bölümleri 1 dakika% 95 etanol ile kurutun, ardından 2 dakika boyunca eozin çözeltisi ile boyayın.
   6. Slaytları mühürledikten sonra, bir slayt tarayıcı kullanarak tarama yapın ve görüntüleri toplayın ve analiz edin.
5. Enzime Bağlı İmmünosorbent Testi (ELISA)
   NOT: Prosedürle ilgili ayrıntılar için Yang, N. ve ^ark.21'e bakın.
   1. Serumu hazırlamak için, standart madde kuyucuklarına ve ölçülecek numune kuyucuklarına standart maddeler ve karşılık gelen konsantrasyonlarda serum ekleyin, ardından enzim etiketli reaktifin eklenmesi izleyin.
   2. Kuluçka, yıkama, renk geliştirme ve sonlandırma adımlarını gerçekleştirin.
   3. Enzim etiketli bir alet kullanarak 450 nm dalga boyunda absorbansı belirleyin ve testosteron (T), gonadotropin salgılatıcı hormon (GnRH), inhibin B (INHB), luteinize edici hormon (LH), folikül uyarıcı hormon (FSH), estradiol (E2) ve prolaktin (PRL).

3. İstatistiksel analiz

1. Deneysel verileri istatistiksel yazılım kullanarak analiz edin ve her grubun sonuçlarını ortalama ± standart sapma (ortalama ± SD) olarak sunun.
2. Normallik ve varyansın homojenliği varsayımlarını karşılayan birden çok grup arasındaki örnek ortalamaları karşılaştırmak için tek yönlü ANOVA kullanın.
3. İki grup arasındaki karşılaştırmalar için t-testini ve yukarıdaki varsayımları karşılamayan veriler için parametrik olmayan testleri kullanın.
4. p < 0.05 olduğunda farklılıkları istatistiksel olarak anlamlı olarak düşünün.

Sonuçlar

Model değerlendirmesi

Modellemeden sonra, fareleri uyuşukluk, çömelmiş duruş, soğuk uzuvlar, yemek yeme isteksizliği, kilo kaybı, artan idrar hacmi, gevşek dışkı ve genellikle böbrek-yang eksikliği sendromu ile uyumlu diğer semptomlar açısından gözlemleyin.

Diseksiyondan sonra böbreklerin sert, bey...

Tartışmalar

TCM'de "böbrek", modern tıpta üriner sistemin işlevlerine atıfta bulunan "iç böbrek" ve hipotalamik-hipofiz-gonadal eksene ve anatomik dış üreme organlarına atıfta bulunan "dış böbrek"ten oluşur²⁵. Erkek seminal veziküller "dış böbrek" e aittir ve bileşenleri arasında testisler, epididimitler, seminal veziküller vb. bulunur²⁶. TCM, özü insan vücudunun maddi temeli olarak kabul eder ve "böbrek özü", ebeveynlerden...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine	Beijing Solarbio Science & Technology Co. Ltd.	A8330
CASA computer-assisted semen analysis system	Nanning Songjing Tianlun Biotechnology Co., Ltd.	VICOS-SPERM
Centrifuge	Sartorius	A-14C
Differentiation fluid	Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd	C0163M
Disposable sterile acupuncture needles	Hanyi brand	0.25mm*13mm
Drying machine	Leica	HI1220
Electrical stimulator	Hua Tuo Brand	SDZ-II
Electronic balance	Hangzhou Youheng Weighing Equipment Co., Ltd	HLD-6002
ELISA kit	Shanghai Jianglai Biotechnology Co. LTD	JL13251?JL11473?JL11525?JL12505?JL13256?JL12201
Enzyme-labeled instrument	Rayto	RT-6100
Eosin staining solution	Zhuhai Beso Biotechnology Co. LTD	BA-4024
Hematoxylin staining solution	Zhuhai Beso Biotechnology Co. LTD	BA-4041
Levocarnitine oral liquid	Northeast Pharmaceutical Group Shenyang First Pharmaceutical Co. LTD.	H19990372
Microtome	Leica	RM2255
Neutral balsam	Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd	Zli-9555
Paraffin embedding machine	Leica	HistoCore Arcadia H
SD rat, 8-week-old, Male, 180-220 g	144 Animal Center of Ningxia Medical University
Slide scanner	Leica	Aperio LV1
Vortex oscillator	Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd	QL-902