Meccanismo dell'agopunto cervello-rene Shu-Mu nel trattamento dell'oligoastenospermia nei ratti attraverso l'asse ipotalamo-ipofisi-testicolo

Riepilogo

Questo studio mira a verificare l'effetto terapeutico dell'agopunto Shu-Mu Brain-Kidney sull'oligoastenospermia nei ratti e ad esplorare il suo meccanismo sottostante attraverso l'asse ipotalamo-ipofisi-testicolare (HPT).

Abstract

L'oligoastenospermia è una causa comune di infertilità maschile. L'asse ipotalamo-ipofisi-testicolare (HPT) regola la differenziazione e la maturazione delle gonadi attraverso la sintesi e il rilascio di ormoni riproduttivi, svolgendo un ruolo vitale nella fertilità maschile. L'interruzione della stabilità dell'asse HPT compromette la produzione di spermatozoi, riducendo la qualità dello sperma. Lo studio dell'effetto dell'elettroagopuntura sulla regolazione dell'asse HPT può fornire informazioni sul trattamento dell'oligoastenospermia. Cinquanta ratti SD maschi di 8 settimane sono stati divisi casualmente in gruppi bianchi, modello, Shu-Mu Brain-Kidney, non-agopoint e L-carnitina (n = 10 per gruppo). Fatta eccezione per il gruppo bianco, i ratti hanno ricevuto adenina per via intragastrica per 28 giorni per stabilire il modello. Dopo la modellazione, il gruppo Shu-Mu Cervello-Rene è stato sottoposto a elettroagopuntura in punti di agopuntura designati, mentre il gruppo senza punti di agopuntura ha ricevuto un trattamento fittizio per 30 minuti al giorno. Il gruppo L-carnitina ha ricevuto L-carnitina (10 ml/kg) per via intragastrica una volta al giorno. I trattamenti sono continuati per 28 giorni. Sono state valutate le condizioni generali, i coefficienti degli organi e la qualità dello sperma. La colorazione HE ha analizzato la morfologia dei tessuti e l'ELISA ha rilevato cambiamenti ormonali sierici. Rispetto al gruppo modello, i gruppi Shu-Mu Brain-Renney e L-carnitina hanno mostrato miglioramenti significativi nello spirito, nella dieta e nei movimenti intestinali, con un aumento del peso corporeo, mentre il gruppo senza agopunti non ha mostrato cambiamenti significativi. I coefficienti degli organi renali sono diminuiti significativamente nei gruppi Shu-Mu Cervello-Rene e L-carnitina, ma sono rimasti invariati nel gruppo senza agopunti. I coefficienti degli organi testicolari non hanno mostrato differenze significative tra i gruppi di trattamento. Il numero di spermatozoi, la densità, la sopravvivenza e i tassi di motilità sono migliorati significativamente nei gruppi Shu-Mu cervello-rene e L-carnitina, ma non nel gruppo senza agopunti. La colorazione H&E ha mostrato un miglioramento del danno ai reni e ai tessuti testicolari nei gruppi Shu-Mu Brain-Kidney e L-carnitina. L'ELISA ha rivelato un aumento di T, GnRH e INHB e una diminuzione dei livelli di LH, FSH, E2 e PRL in questi gruppi (p < 0,001), senza cambiamenti significativi nel gruppo senza agopunti. Questi risultati indicano che la terapia con agopuntura Shu-Mu Brain-Kidney migliora la qualità dello sperma regolando l'asse HPT, offrendo un potenziale trattamento per l'oligoastenospermia.

Introduzione

L'oligoastenospermia, suddivisa in "oligospermia" e "astenospermia", è uno dei tipi più comuni di infertilità maschile, con un tasso di incidenza che rappresenta circa il 75% dei casi di infertilità maschile¹. L'oligoastenospermia è caratterizzata principalmente da una diminuzione della densità e della motilità degli spermatozoi nei testicoli e si manifesta principalmente clinicamente come disturbo della spermatogenesi, riduzione del numero di spermatozoi e bassa motilità degli spermatozoi ^2,3. Negli ultimi anni, l'incidenza dell'oligoastenosparmia è aumentata di anno in anno⁴. Senza un trattamento efficace, avrà effetti negativi a lungo termine sulla salute fisica e mentale dei pazienti e persino sull'armonia familiare⁵. Gli studi hanno dimostrato che i problemi genetici⁶, i disturbi endocrini riproduttivi⁷, le infezioni del tratto urogenitale⁸ e i farmaci chimici⁹ possono influenzare la produzione e la maturazione degli spermatozoi, portando a un declino della qualità dello sperma. Attualmente, migliorare la qualità degli spermatozoi danneggiati è diventato un problema impegnativo in campo medico.

L'asse ipotalamo-ipofisi-testicolo (HPT) è la principale via di regolazione riproduttiva nel corpo, che può regolare la differenziazione e la maturazione delle gonadi stimolando la sintesi e il rilascio di ormoni riproduttivi correlati all'ipotalamo, alla ghiandola pituitaria e ai testicoli e svolge un ruolo importante nel mantenimento della normale funzione riproduttiva maschile¹⁰. Se la stabilità della funzione dell'asse HPT viene interrotta, la secrezione testicolare sarà insufficiente a raggiungere la concentrazione fisiologica di testosterone, con conseguente diminuzione del numero e della qualità degli spermatozoi nel testicolo¹¹. Pertanto, il trattamento dell'oligoastenospermia mira principalmente a regolare la funzione dell'asse HPT e raggiungere lo scopo di mantenere l'equilibrio degli ormoni endocrini correlati, aumentando così il numero di spermatozoi nello sperma, migliorando l'attività degli spermatozoi e migliorando la qualità dello sperma.

Nel trattamento clinico dell'oligoastenospermia, la medicina moderna adotta principalmente metodi come la chirurgia e i farmaci anti-ossidazione e migliorano la motilità degli spermatozoi^12,13, mentre la terapia di elettroagopuntura combina l'agopuntura tradizionale cinese e la moderna bioelettricità medica. Ha i vantaggi di essere veloce e preciso, di avere un evidente effetto curativo, di avere poche reazioni avverse, un'ampia gamma di malattie adatte e un basso costo di trattamento e di avere un buon effetto di trattamento sull'oligoastenospermia^14,15. "La schiena è yang e l'addome è yin". La combinazione di agopunti Shu-Mu combina i punti Shu con i punti Mu, uno nella parte anteriore e uno nella parte posteriore, uno yin e uno yang, lavorando insieme, noto anche come metodo di combinazione di punti di agopuntura anteriore-posteriore. La medicina tradizionale cinese (MTC) crede che il rene sia la radice dell'essenza prenatale e che la malattia si trovi nel rene. Il punto Front-mu del rene, Jingmen (GB25), e il punto Back-shu, Shenshu (BL23), sono selezionati, il che ha l'effetto di riscaldare il rene, assistere yang e cercare yang all'interno di yin^16,17; il rene immagazzina l'essenza e governa la produzione di midollo, il cervello è il mare di midollo e il luogo di incontro di tutto lo yang, e Taixi (KI3) è il punto di origine del meridiano del rene Shaoyin del piede, che può regolare e tonificare il fegato e il rene, nutrire lo yin e generare il midollo¹⁸. Combinato con Epangsanxian (MS4), collega il rene e il cervello, riflettendo l'idea della "combinazione di agopunture Shu-Mu cervello-rene" in MTC¹⁹, e l'effetto terapeutico è più evidente di quello dell'agopuntura ordinaria.

Gli attuali studi di trattamento sulla qualità dello sperma si concentrano principalmente sul miglioramento della struttura e della funzione testicolare, mentre sono state condotte ricerche limitate sulla regolazione dei livelli sierici di ormoni in diversi tessuti dell'asse ipotalamo-ipofisi-testicolo (HPT)²⁰. Nella ricerca preliminare, il sequenziamento dell'RNA (RNA-Seq) è stato utilizzato per identificare i geni candidati e le vie regolatorie coinvolte nella regolazione della qualità dello sperma all'interno dei tessuti ipotalamo, ipofisari e testicolari di ratti sani e ratti modello di oligozoospermia indotta da adenina²¹. Inoltre, in entrambi i gruppi sono stati eseguiti test di qualità dello sperma e analisi istologica dei tessuti testicolari. Questi risultati hanno fornito informazioni sui meccanismi molecolari alla base della qualità dello sperma nei ratti oligoastenosparmia indotta da adenina. La terapia di elettroagopuntura con agopuntura approssimale a distanza potrebbe migliorare la qualità dello sperma nei ratti oligoastenosparmia regolando l'asse HPT e l'effetto è correlato al processo di stress ossidativo²². Tuttavia, non è noto se l'agopunto Shu-Mu cervello-rene possa migliorare la qualità dello sperma dei ratti regolando l'asse HPT. Per esplorare ulteriormente il meccanismo regolatorio del miglioramento della qualità dello sperma nei ratti oligoastenosparmia e i metodi di trattamento efficaci, questo studio ha utilizzato un modello di ratti indotti da adenina di oligoastenospermia e ha selezionato quattro agopunti, Epangsanxian, Shenshu, Jingmen e Taixi, per esplorare il meccanismo correlato dell'effetto terapeutico dell'agopunto cervello-rene Shu-Mu sull'oligoastenospermia nei ratti dal punto di vista dell'asse HPT, fornendo una base più scientifica per il trattamento clinico.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati esaminati e approvati dal Comitato etico animale della Ningxia Medical University (numero di approvazione: IACUC-NYLAC-2021-130). Lo studio è stato condotto in stretta conformità con le linee guida ARRIVE 2.0 per gli esperimenti sugli animali e ha aderito ai principi di benessere animale descritti nella Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Questo studio randomizzato controllato su animali ha utilizzato un'analisi unidirezionale della varianza ed è stato condotto presso l'Animal Experiment Center della Ningxia Medical University da marzo a maggio 2023. Per questo studio sono stati utilizzati ratti SD maschi di grado SPF di otto settimane del peso di 180-220 g. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Definizione del modello animale e procedure di trattamento

1. Animali da esperimento e gruppi
   1. Procurati cinquanta ratti SD maschi di grado SPF di 8 settimane del peso di 180-220 g.
   2. Ospita tutti i ratti in condizioni standard, mantenendo una temperatura ambiente di 22-25 °C, un'umidità del 50%-60% e fornendo libero accesso al mangime e all'acqua standard per roditori.
   3. Dopo una settimana di adattamento, dividere casualmente i ratti in un gruppo bianco (B) (n = 10) e un gruppo di modellazione (n = 40) utilizzando un metodo della tabella dei numeri casuali. Somministrare soluzione fisiologica normale al gruppo bianco e adenina al gruppo modellante mediante gavagage orale.
   4. Dopo 28 giorni, dividere casualmente il gruppo di modellazione in un gruppo modello (M), un gruppo Shu-Mu cervello-rene (S), un gruppo non agopunto (N) e un gruppo L-carnitina (L) (n = 10 per gruppo). Lasciare il gruppo di modelli non trattato.
      1. Applicare l'intervento di elettroagopuntura utilizzando il metodo di corrispondenza dei punti di agopuntura Shu-Mu cervello-rene al gruppo Shu-Mu cervello-rene. Somministrare un trattamento senza agopunti al gruppo senza agopunti e L-carnitina liquida orale mediante sonda gastrica al gruppo L-carnitina. Trattare tutti i gruppi ininterrottamente per 28 giorni.
2. Costruzione del modello
   NOTA: Gli studi hanno dimostrato che alte dosi di adenina possono influenzare la funzione testicolare nei ratti, portando a una secrezione anomala di ormoni sessuali, all'interruzione della stabilità funzionale dell'asse HPT e a un declino della qualità dello sperma²³. Pertanto, l'adenina è comunemente usata per stabilire modelli di infertilità animale maschile.
   1. Somministrare soluzione fisiologica normale (1 ml/100 g di peso corporeo) al gruppo bianco e adenina (20 mg/100 g di peso corporeo) al gruppo modello mediante sonda gastrica orale (Figura 1A).
   2. Garantire un'agitazione continua durante la sonda gastrica per prevenire la precipitazione dell'adenina e il blocco dell'ago della sonda gastrica. Somministrare il trattamento una volta al giorno per 28 giorni.
3. 1.3 Procedura di trattamento
   1. Gruppo Shu-Mu cervello-rene
      1. Iniziare l'intervento il primo giorno dopo la modellazione. Eseguire l'agopuntura con aghi per agopuntura sterili monouso su punti bilaterali. Dopo aver fissato il ratto, esporre e disinfettare il sito di agopuntura.
      2. Fissare la pelle del sito di agopuntura con la mano sinistra e perforare rapidamente il punto di agopuntura con l'ago per agopuntura sterile monouso nella mano destra. Collegare uno stimolatore elettrico. Applicare onde dilatative con una frequenza di elettroagopuntura di 2 Hz, un'intensità di stimolazione di 1,5 mA e un leggero tremore del muscolo locale.
      3. Eseguire il trattamento di elettroagopuntura per 30 minuti ogni volta, una volta al giorno, per 28 giorni consecutivi (Figura 1B).
         NOTA: Selezionare i punti di agopuntura nei ratti con riferimento a Yong Tang's Experimental Acupuncture and Moxibustion Science, Appendice II, "Punti di agopuntura comunemente usati negli animali da esperimento", combinato con un metodo di selezione anatomica comparativa^{dei punti 19}. Sono stati selezionati i seguenti punti: (1) Epangsanxian (MS4): situato 3 mm sotto e 4 mm fuori dal punto Touwei. Operazione: Puntura 1-2 mm diritta; (2) Shenshu (BL23): Situato nell'area della colonna vertebrale, su entrambi i lati del processo spinoso inferiore della seconda vertebra lombare, 6 mm accanto alla linea dorsale mediana. Operazione: Puntura 6 mm diritta; (3) Jingmen (GB25): Situato sulla vita laterale, all'estremità libera della 13a costola sul lato inferiore. Operazione: Puntura 1-2 mm diritta; (4) Taixi (KI3): Situato sul lato interno del piede, nella depressione tra il punto più alto della caviglia mediale e il bordo posteriore del tendine d'Achille. Operazione: Bucherellare 3 mm dritto.
   2. Gruppo non agopuntico
      1. Seleziona e utilizza i non-agopunti 1, 2 e 3 allo stesso modo del gruppo Cervello-Rene Shu-Mu (Figura 1B).
         NOTA: Poiché i non-agopunti non seguono il principio della selezione dei punti lungo i meridiani, e secondo la teoria della Medicina Tradizionale Cinese (MTC) e l'osservazione clinica a lungo termine, questi tre agopunti hanno scarso effetto terapeutico sui pazienti con oligoastenozoospermia²⁴. (1) Non agopunto 1: situato nel punto medio della linea tra la punta del gomito e l'ascella sul lato interno del gomito. Operazione: Puntura 1-2 mm diritta; (2) Non agopunto 2: Situato nel punto medio tra l'epicondilo mediale dell'omero e il polso dell'ulna, sul margine ulnare. Operazione: Puntura 1-2 mm diritta; (3) Non agopunto 3: situato all'intersezione tra il muscolo deltoide anteriore e il muscolo bicipite sul braccio interno. Operazione: Bucherellare 1-2 mm dritto.
   3. Gruppo L-carnitina
      1. Somministrare levocarnitina liquida orale mediante sonda gastrica orale alla dose di 10 ml/kg di peso corporeo, una volta al giorno, per 28 giorni consecutivi (Figura 1A).
4. Eutanasia
   1. Dopo il trattamento, lasciare che tutti i ratti digiunino per 24 ore, anestetizzarli mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico al 2% (40 mg/kg di peso corporeo, seguendo protocolli istituzionalmente approvati) e raccogliere il sangue dall'apice del cuore utilizzando un ago monouso per la raccolta del sangue endovenoso^21,24.
   2. Dopo la morte per decapitazione, rimuovere un lato dell'epididimo per misurare la qualità dello sperma. Raccogliere i tessuti renali e testicolari, pesarli e registrarli e fissarli nel fissativo paraformaldeide a temperatura ambiente per 48 ore prima di incorporarli nella paraffina²⁴.

2. Indici di osservazione

1. Osservazione generale: osservare lo stato mentale, la dieta e i movimenti intestinali dei ratti e monitorare quotidianamente il loro peso corporeo.
2. Coefficienti d'organo: Dopo la morte, rimuovere con cura il grasso superficiale e il tessuto connettivo sia dai reni che dai tessuti testicolari, sciacquare con soluzione fisiologica, asciugare con carta da filtro, pesare su una bilancia e registrare le misurazioni per il calcolo dei coefficienti d'organo. Coefficiente d'organo (%) = (peso d'organo [g] / peso corporeo [g]) x 100%.
3. Qualità dello sperma
   1. Dopo aver rimosso il grasso in eccesso, rimuovere e porre un lato dell'epididimo da ciascun ratto in un bagnomaria a temperatura costante a 37 °C per 5 minuti. Quindi, tagliare, filtrare, soffiare delicatamente e mescolare bene il campione.
   2. Prelevare un'aliquota di 10 μl della sospensione di spermatozoi diluita e farla cadere sul bordo del vetro di copertura di una piastra di conteggio preriscaldata, consentendo alla sospensione di spermatozoi di permeare automaticamente nella camera di conteggio.
   3. Misurare il numero di spermatozoi, la densità, il tasso di sopravvivenza e il tasso di motilità utilizzando un sistema CASA (computer-assisted semenanalysis)²¹.
4. Colorazione con ematossilina ed eosina (H&E)
   NOTA: Per i dettagli sulla procedura, fare riferimento a Yang, N. et ^al.21.
   1. Sciacquare i fazzoletti fissati con acqua corrente, disidratarli e incorporarli.
   2. Tagliare le sezioni di paraffina (5 μm di spessore) con un microtomo e cuocere a 65 °C per 4 ore.
   3. Decerare le sezioni e reidratarle con acqua.
   4. Macchiare le sezioni con una soluzione colorante di ematossilina per 3 minuti, quindi risciacquare con acqua corrente.
   5. Disidratare le sezioni con etanolo al 95% per 1 minuto, quindi colorare con soluzione di eosina per 2 minuti.
   6. Dopo aver sigillato i vetrini, eseguire la scansione utilizzando uno scanner per vetrini e raccogliere e analizzare le immagini.
5. Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA)
   NOTA: Per i dettagli sulla procedura, fare riferimento a Yang, N. et ^al.21.
   1. Per preparare il siero, aggiungere le sostanze standard e il siero delle concentrazioni corrispondenti ai pozzetti della sostanza standard e ai pozzetti del campione da misurare, quindi aggiungere il reagente marcato con l'enzima.
   2. Eseguire le fasi di incubazione, lavaggio, sviluppo del colore e terminazione.
   3. Determinare l'assorbanza a una lunghezza d'onda di 450 nm utilizzando uno strumento marcato con un enzima e calcolare i livelli di espressione del testosterone (T), dell'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH), dell'inibina B (INHB), dell'ormone luteinizzante (LH), dell'ormone follicolo-stimolante (FSH), dell'estradiolo (E2) e della prolattina (PRL).

3. Analisi statistica

1. Analizzare i dati sperimentali utilizzando software statistici e presentare i risultati di ciascun gruppo come media ± deviazione standard (media ± SD).
2. Utilizzare l'ANOVA unidirezionale per confrontare le medie campionarie tra più gruppi che soddisfano le ipotesi di normalità e omogeneità della varianza.
3. Utilizzare il test t per i confronti tra due gruppi e i test non parametrici per i dati che non soddisfano le ipotesi di cui sopra.
4. Considera le differenze statisticamente significative quando p < 0,05.

Risultati

Valutazione del modello

Dopo la modellazione, osservare i ratti per letargia, postura accovacciata, arti freddi, riluttanza a mangiare, perdita di peso, aumento del volume delle urine, feci molli e altri sintomi, che generalmente si allineano con la sindrome della carenza di rene-yang.

Dopo la dissezione, osserva che i...

Discussione

Nella MTC, il "rene" è costituito dal "rene interno", che si riferisce alle funzioni del sistema urinario nella medicina moderna, e dal "rene esterno", che si riferisce all'asse ipotalamo-ipofisi-gonadi e agli organi riproduttivi esterni anatomici²⁵. Le vescicole seminali maschili appartengono al "rene esterno" e i loro componenti includono i testicoli, gli epididimi, le vescicole seminali, ecc.²⁶. La MTC considera l'essenza come la base m...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine	Beijing Solarbio Science & Technology Co. Ltd.	A8330
CASA computer-assisted semen analysis system	Nanning Songjing Tianlun Biotechnology Co., Ltd.	VICOS-SPERM
Centrifuge	Sartorius	A-14C
Differentiation fluid	Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd	C0163M
Disposable sterile acupuncture needles	Hanyi brand	0.25mm*13mm
Drying machine	Leica	HI1220
Electrical stimulator	Hua Tuo Brand	SDZ-II
Electronic balance	Hangzhou Youheng Weighing Equipment Co., Ltd	HLD-6002
ELISA kit	Shanghai Jianglai Biotechnology Co. LTD	JL13251?JL11473?JL11525?JL12505?JL13256?JL12201
Enzyme-labeled instrument	Rayto	RT-6100
Eosin staining solution	Zhuhai Beso Biotechnology Co. LTD	BA-4024
Hematoxylin staining solution	Zhuhai Beso Biotechnology Co. LTD	BA-4041
Levocarnitine oral liquid	Northeast Pharmaceutical Group Shenyang First Pharmaceutical Co. LTD.	H19990372
Microtome	Leica	RM2255
Neutral balsam	Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd	Zli-9555
Paraffin embedding machine	Leica	HistoCore Arcadia H
SD rat, 8-week-old, Male, 180-220 g	144 Animal Center of Ningxia Medical University
Slide scanner	Leica	Aperio LV1
Vortex oscillator	Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd	QL-902