Mecanismo do Ponto de Acupuntura Cérebro-Rim de Shu-Mu no Tratamento da Oligoastenospermia em Ratos através do Eixo Hipotálamo-Hipófise-Testicular

Resumo

Este estudo tem como objetivo verificar o efeito terapêutico do ponto de acupuntura Cérebro-Rim de Shu-Mu na oligoastenospermia em ratos e explorar seu mecanismo subjacente através do eixo hipotálamo-hipófise-testicular (HPT).

Resumo

A oligoastenospermia é uma causa comum de infertilidade masculina. O eixo hipotálamo-hipófise-testicular (HPT) regula a diferenciação e maturação gonadal por meio da síntese e liberação de hormônios reprodutivos, desempenhando um papel vital na fertilidade masculina. A interrupção da estabilidade do eixo HPT prejudica a produção de espermatozoides, reduzindo a qualidade do sêmen. Investigar o efeito da eletroacupuntura na regulação do eixo HPT pode fornecer informações sobre o tratamento da oligoastenospermia. Cinquenta ratos SD machos de 8 semanas de idade foram divididos aleatoriamente em grupos branco, modelo, Shu-Mu Cérebro-Rim, sem acupuntura e L-carnitina (n = 10 por grupo). Com exceção do grupo em branco, os ratos receberam adenina por via intragástrica por 28 dias para estabelecer o modelo. Após a modelagem, o grupo Shu-Mu Cérebro-Rim foi submetido a eletroacupuntura em pontos de acupuntura designados, enquanto o grupo sem acupuntura recebeu tratamento simulado por 30 minutos diários. O grupo L-carnitina recebeu L-carnitina (10 mL/kg) por via intragástrica uma vez ao dia. Os tratamentos continuaram por 28 dias. Foram avaliadas as condições gerais, os coeficientes dos órgãos e a qualidade do sêmen. A coloração HE analisou a morfologia do tecido e o ELISA detectou alterações hormonais séricas. Em comparação com o grupo modelo, os grupos Shu-Mu, Cérebro-Rim e L-carnitina exibiram melhorias significativas no espírito, dieta e movimentos intestinais, com aumento do peso corporal, enquanto o grupo sem acupuntura não mostrou mudanças significativas. Os coeficientes dos órgãos renais diminuíram significativamente nos grupos Shu-Mu, Cérebro-Rim e L-carnitina, mas permaneceram inalterados no grupo sem acuponto. Os coeficientes dos órgãos testiculares não mostraram diferenças significativas entre os grupos de tratamento. As taxas de contagem de espermatozóides, densidade, sobrevivência e motilidade melhoraram significativamente nos grupos Shu-Mu Cérebro-Rim e L-carnitina, mas não no grupo sem acuponto. A coloração H & E mostrou melhora nos danos nos rins e no tecido testicular nos grupos Shu-Mu Cérebro-Rim e L-carnitina. O ELISA revelou aumento de T, GnRH e INHB e diminuição dos níveis de LH, FSH, E2 e PRL nesses grupos (p < 0,001), sem alterações significativas no grupo sem acuponto. Esses achados indicam que a terapia de acupuntura Shu-Mu Cérebro-Rim melhora a qualidade do esperma regulando o eixo HPT, oferecendo um tratamento potencial para oligoastenospermia.

Introdução

A oligoastenospermia, dividida em "oligospermia" e "astenospermia", é um dos tipos comuns de infertilidade masculina, com uma taxa de incidência responsável por cerca de 75% dos casos de infertilidade masculina¹. A oligoastenospermia é caracterizada principalmente pela diminuição da densidade e motilidade espermática nos testículos e se manifesta principalmente clinicamente como distúrbio da espermatogênese, contagem reduzida de espermatozóides e baixa motilidade espermática ^2,3. Nos últimos anos, a incidência de oligoastenospermia aumentou ano a ano⁴. Sem tratamento eficaz, terá efeitos adversos a longo prazo na saúde física e mental dos pacientes e até mesmo na harmonia familiar⁵. Estudos mostraram que problemas genéticos⁶, distúrbios endócrinos reprodutivos⁷, infecções do trato urogenital⁸ e drogas químicas⁹ podem afetar a produção e maturação do esperma, levando a um declínio na qualidade do sêmen. Atualmente, melhorar a qualidade do esperma danificado tornou-se um problema desafiador na área médica.

O eixo hipotálamo-hipófise-testicular (HPT) é a principal via de regulação reprodutiva do organismo, que pode regular a diferenciação e maturação das gônadas, estimulando a síntese e liberação de hormônios reprodutivos relacionados ao hipotálamo, hipófise e testículos, e desempenha um papel importante na manutenção da função reprodutiva masculina normal¹⁰. Se a estabilidade da função do eixo HPT for interrompida, isso fará com que a secreção testicular seja insuficiente para atingir a concentração fisiológica de testosterona, resultando em uma diminuição no número e na qualidade dos espermatozoides no testículo¹¹. Portanto, o tratamento da oligoastenospermia visa principalmente regular a função do eixo HPT e atingir o objetivo de manter o equilíbrio dos hormônios endócrinos relacionados, aumentando assim o número de espermatozoides no sêmen, aumentando a atividade espermática e melhorando a qualidade do sêmen.

No tratamento clínico da oligoastenospermia, a medicina moderna adota principalmente métodos como cirurgia e drogas antioxidantes e aumenta a motilidade dos espermatozoides^12,13, enquanto a terapia de eletroacupuntura combina a acupuntura tradicional chinesa e a bioeletricidade médica moderna. Tem as vantagens de ser rápido e preciso, ter um efeito curativo óbvio, ter poucas reações adversas, uma ampla gama de doenças adequadas e baixo custo de tratamento, e ter um bom efeito de tratamento na oligoastenospermia^14,15. "As costas são yang e o abdômen é yin." A combinação de pontos de acupuntura Shu-Mu combina os pontos Shu com os pontos Mu, um na frente e outro atrás, um yin e um yang, trabalhando juntos, também conhecido como método de combinação de pontos de acupuntura frente-trás. A medicina tradicional chinesa (MTC) acredita que o rim é a raiz da essência pré-natal e a doença está localizada no rim. O ponto Front-mu do rim, Jingmen (GB25), e o ponto Back-shu, Shenshu (BL23), são selecionados, o que tem o efeito de aquecer o rim, auxiliar yang e buscar yang dentro de yin^16,17; o rim armazena a essência e governa a produção de medula, o cérebro é o mar de medula e o ponto de encontro de todos os yang, e Taixi (KI3) é o ponto de origem do meridiano do rim Shaoyin do pé, que pode regular e tonificar o fígado e o rim, nutrir o yin e gerar medula¹⁸. Combinado com Epangsanxian (MS4), ele conecta o rim e o cérebro, refletindo a ideia de "combinação de acupontos Shu-Mu Cérebro-Rim" na MTC¹⁹, e o efeito terapêutico é mais óbvio do que o da acupuntura comum.

Os estudos atuais de tratamento sobre a qualidade do sêmen se concentram principalmente na melhoria da estrutura e função testicular, enquanto pesquisas limitadas foram conduzidas sobre a regulação dos níveis séricos de hormônios em diferentes tecidos do eixo hipotálamo-hipófise-testicular (HPT)²⁰. Em pesquisas preliminares, o sequenciamento de RNA (RNA-Seq) foi usado para identificar genes candidatos e vias regulatórias envolvidas na regulação da qualidade do sêmen nos tecidos hipotalâmico, hipofisário e testicular de ratos saudáveis e ratos modelo de oligozoospermia induzida por adenina²¹. Além disso, testes de qualidade do sêmen e análise histológica dos tecidos testiculares foram realizados em ambos os grupos. Essas descobertas forneceram informações sobre os mecanismos moleculares subjacentes à qualidade do sêmen em ratos oligoastenospermia induzida por adenina. A terapia de eletroacupuntura com acupuntura proximal distante pode melhorar a qualidade do esperma em ratos oligoastenospermia, regulando o eixo HPT, e o efeito está relacionado ao processo de estresse oxidativo²². No entanto, não se sabe se o ponto de acupuntura Cérebro-Rim de Shu-Mu pode melhorar a qualidade do sêmen de ratos, regulando o eixo HPT. Para explorar ainda mais o mecanismo regulatório de melhoria da qualidade do sêmen em ratos oligoastenospermia e métodos de tratamento eficazes, este estudo usou um modelo de oligoastenospermia induzido por adenina em ratos e selecionou quatro pontos de acupuntura, Epangsanxian, Shenshu, Jingmen e Taixi, para explorar o mecanismo relacionado do efeito terapêutico do ponto de acupuntura Cérebro-Rim Shu-Mu na oligoastenospermia em ratos do aspecto do eixo HPT, fornecendo uma base mais científica para o tratamento clínico.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade Médica de Ningxia (número de aprovação: IACUC-NYLAC-2021-130). O estudo foi realizado em estrita conformidade com as Diretrizes ARRIVE 2.0 para experimentos com animais e aderiu aos princípios de bem-estar animal descritos no Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Este estudo randomizado controlado em animais empregou análise de variância unidirecional e foi conduzido no Centro de Experimentos Animais da Universidade Médica de Ningxia de março a maio de 2023. Ratos SD machos de grau FPS com oito semanas de idade, pesando 180-220 g, foram usados para este estudo. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Procedimentos de estabelecimento e tratamento de modelos animais

1. Animais e grupos experimentais
   1. Obtenha cinquenta ratos SD machos de 8 semanas de idade, com FPS, pesando 180-220 g.
   2. Alojar todos os ratos em condições padrão, mantendo uma temperatura ambiente de 22-25 °C, umidade de 50% a 60% e fornecendo livre acesso à ração e água padrão para roedores.
   3. Após uma semana de adaptação, divida aleatoriamente os ratos em um grupo em branco (B) (n = 10) e um grupo de modelagem (n = 40) usando um método de tabela de números aleatórios. Administre solução salina normal ao grupo em branco e adenina ao grupo de modelagem por gavagem oral.
   4. Após 28 dias, divida aleatoriamente o grupo de modelagem em um grupo modelo (M), grupo Shu-Mu Cérebro-Rim (S), grupo sem acuponto (N) e grupo L-carnitina (L) (n = 10 por grupo). Deixe o grupo de modelos sem tratamento.
      1. Aplique a intervenção de eletroacupuntura usando o método de correspondência de pontos de acupuntura Shu-Mu Cérebro-Rim ao grupo Shu-Mu Cérebro-Rim. Administre tratamento sem acuponto ao grupo sem acuponto e L-carnitina líquido oral por gavagem ao grupo L-carnitina. Trate todos os grupos continuamente por 28 dias.
2. Construção do modelo
   NOTA: Estudos mostraram que altas doses de adenina podem afetar a função testicular em ratos, levando à secreção anormal de hormônios sexuais, interrupção da estabilidade funcional do eixo HPT e declínio na qualidade do esperma²³. Portanto, a adenina é comumente usada para estabelecer modelos de infertilidade animal masculina.
   1. Administre solução salina normal (1 mL / 100 g de peso corporal) ao grupo em branco e adenina (20 mg / 100 g de peso corporal) ao grupo modelo por gavagem oral ( Figura 1A ).
   2. Garanta agitação contínua durante a gavagem para evitar a precipitação de adenina e o bloqueio da agulha de gavagem. Administre o tratamento uma vez ao dia por 28 dias.
3. 1.3 Procedimento de tratamento
   1. Grupo Cérebro-Rim Shu-Mu
      1. Comece a intervenção no primeiro dia após a modelagem. Realize acupuntura com agulhas de acupuntura estéreis descartáveis em pontos bilaterais. Depois de fixar o rato, exponha e desinfete o local da acupuntura.
      2. Fixe a pele do local da acupuntura com a mão esquerda e perfure rapidamente o ponto de acupuntura com a agulha de acupuntura estéril descartável na mão direita. Conecte um estimulador elétrico. Aplique ondas dilatacionais com uma frequência de eletroacupuntura de 2 Hz, uma intensidade de estimulação de 1,5 mA e um leve tremor do músculo local.
      3. Realize o tratamento de eletroacupuntura por 30 minutos de cada vez, uma vez ao dia, por 28 dias consecutivos (Figura 1B).
         NOTA: Selecione pontos de acupuntura em ratos com referência à Ciência Experimental de Acupuntura e Moxabustão de Yong Tang, Apêndice II, "Pontos de Acupuntura Comumente Usados em Animais Experimentais", combinado com um método comparativo de seleção de pontos anatômicos¹⁹. Os seguintes pontos foram selecionados: (1) Epangsanxian (MS4): Localizado 3 mm abaixo e 4 mm fora do ponto Touwei. Operação: Picada 1-2 mm em linha reta; (2) Shenshu (BL23): Localizado na área da coluna, em ambos os lados do processo espinhoso inferior da segunda vértebra lombar, 6 mm ao lado da linha dorsal mediana. Operação: Picada 6 mm reta; (3) Jingmen (GB25): Localizado na cintura lateral, na extremidade livre da 13ª costela na parte inferior. Operação: Picada 1-2 mm em linha reta; (4) Taixi (KI3): Localizado na parte interna do pé, na depressão entre o ponto alto do tornozelo medial e a borda posterior do tendão de Aquiles. Operação: Picada 3 mm reta.
   2. Grupo sem pontos de acupuntura
      1. Selecione e opere os pontos de não acupuntura 1, 2 e 3 da mesma maneira que o grupo Cérebro-Rim Shu-Mu (Figura 1B).
         NOTA: Como os pontos de não acupuntura não seguem o princípio da seleção de pontos ao longo dos meridianos, e de acordo com a teoria da Medicina Tradicional Chinesa (MTC) e observação clínica de longo prazo, esses três pontos de acupuntura têm pouco efeito terapêutico em pacientes com oligoastenozoospermia²⁴. (1) Não acuponto 1: Localizado no ponto médio da linha entre a ponta do cotovelo e a axila na parte interna do cotovelo. Operação: Picada 1-2 mm em linha reta; (2) Não acuponto 2: Localizado no ponto médio entre o epicôndilo medial do úmero e o punho da ulna, na margem ulnar. Operação: Picada 1-2 mm em linha reta; (3) Não acuponto 3: Localizado na interseção do músculo deltóide anterior e do músculo bíceps na parte interna do braço. Operação: Pique 1-2 mm em linha reta.
   3. Grupo L-carnitina
      1. Administrar levocarnitina líquida oral por sonda oral na dose de 10 mL/kg de peso corporal, uma vez ao dia, por 28 dias consecutivos (Figura 1A).
4. Eutanásia
   1. Após o tratamento, permitir que todos os ratos jejuem por 24 horas, anestesiar-os por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico a 2% (40 mg/kg de peso corporal, seguindo protocolos aprovados institucionalmente) e coletar sangue do ápice do coração usando uma agulha descartável de coleta de sangue intravenoso^21,24.
   2. Após a morte por decapitação, remova um lado do epidídimo para medir a qualidade do sêmen. Colha os tecidos renais e testiculares, pese-os e registre-os e fixe-os em fixador de paraformaldeído à temperatura ambiente por 48 h antes de incorporá-los em parafina²⁴.

2. Índices de observação

1. Observação geral: Observe o estado mental, a dieta e os movimentos intestinais dos ratos e monitore seu peso corporal diariamente.
2. Coeficientes de órgãos: Após a morte, remova cuidadosamente a gordura superficial e o tecido conjuntivo dos tecidos renal e testicular, enxágue com solução salina normal, seque com papel de filtro, pese em uma balança e registre as medições para o cálculo dos coeficientes de órgãos. Coeficiente de órgão (%) = (peso do órgão [g] / peso corporal [g]) x 100%.
3. Qualidade do sêmen
   1. Depois de remover o excesso de gordura, remova e coloque um lado do epidídimo de cada rato em banho-maria de temperatura constante a 37 ° C por 5 min. Em seguida, corte, filtre, sopre suavemente e misture bem a amostra.
   2. Pegue uma alíquota de 10 μL da suspensão de esperma diluída e solte-a na borda da lamínula de uma placa de contagem pré-aquecida, permitindo que a suspensão de esperma penetre automaticamente na câmara de contagem.
   3. Meça a contagem de espermatozoides, densidade, taxa de sobrevivência e taxa de motilidade usando um sistema CASA (análise de sêmen assistida por computador)²¹.
4. Coloração de hematoxilina e eosina (H&E)
   NOTA: Para detalhes sobre o procedimento, consulte Yang, N. et ^al.21.
   1. Enxágue os tecidos fixados com água corrente, desidrate e incorpore-os.
   2. Corte seções de parafina (5 μm de espessura) usando um micrótomo e leve ao forno a 65 ° C por 4 h.
   3. Desparafine as seções e reidrate-as com água.
   4. Pinte as seções com solução de coloração de hematoxilina por 3 min e depois enxágue com água corrente.
   5. Desidrate as seções com etanol a 95% por 1 min e, em seguida, comente com solução de eosina por 2 min.
   6. Depois de selar as lâminas, execute a digitalização usando um scanner de lâminas e colete e analise as imagens.
5. Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA)
   NOTA: Para detalhes sobre o procedimento, consulte Yang, N. et ^al.21.
   1. Para preparar o soro, adicionar substâncias-padrão e soro das concentrações correspondentes aos alvéolos da substância-padrão e aos alvéolos de amostra a medir, seguidos da adição do reagente marcado com enzima.
   2. Realize as etapas de incubação, lavagem, desenvolvimento de cor e terminação.
   3. Determine a absorbância em um comprimento de onda de 450 nm usando um instrumento marcado com enzima e calcule os níveis de expressão de testosterona (T), hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH), inibina B (INHB), hormônio luteinizante (LH), hormônio folículo-estimulante (FSH), estradiol (E2) e prolactina (PRL).

3. Análise estatística

1. Analisar os dados experimentais utilizando software estatístico, e apresentar os resultados de cada grupo como média ± desvio padrão (média ± DP).
2. Use ANOVA unidirecional para comparar as médias da amostra entre vários grupos que atendem às suposições de normalidade e homogeneidade de variância.
3. Use o teste t para comparações entre dois grupos e testes não paramétricos para dados que não atendem às suposições acima.
4. Considera-se diferenças estatisticamente significativas quando p < 0,05.

Resultados

Avaliação do modelo

Após a modelagem, observe os ratos quanto à letargia, postura agachada, membros frios, relutância em comer, perda de peso, aumento do volume de urina, fezes moles e outros sintomas, que geralmente se alinham com a síndrome da deficiência de yang renal.

Após a dissecção, observe que os rins...

Discussão

Na MTC, o "rim" consiste no "rim interno", referindo-se às funções do sistema urinário na medicina moderna, e o "rim externo", referindo-se ao eixo hipotálamo-hipófise-gonadal e aos órgãos reprodutivos externos anatômicos²⁵. As vesículas seminais masculinas pertencem ao "rim externo" e seus componentes incluem testículos, epidídimos, vesículas seminais, etc.²⁶. A MTC considera a essência a base material do corpo humano, e a "e...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine	Beijing Solarbio Science & Technology Co. Ltd.	A8330
CASA computer-assisted semen analysis system	Nanning Songjing Tianlun Biotechnology Co., Ltd.	VICOS-SPERM
Centrifuge	Sartorius	A-14C
Differentiation fluid	Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd	C0163M
Disposable sterile acupuncture needles	Hanyi brand	0.25mm*13mm
Drying machine	Leica	HI1220
Electrical stimulator	Hua Tuo Brand	SDZ-II
Electronic balance	Hangzhou Youheng Weighing Equipment Co., Ltd	HLD-6002
ELISA kit	Shanghai Jianglai Biotechnology Co. LTD	JL13251?JL11473?JL11525?JL12505?JL13256?JL12201
Enzyme-labeled instrument	Rayto	RT-6100
Eosin staining solution	Zhuhai Beso Biotechnology Co. LTD	BA-4024
Hematoxylin staining solution	Zhuhai Beso Biotechnology Co. LTD	BA-4041
Levocarnitine oral liquid	Northeast Pharmaceutical Group Shenyang First Pharmaceutical Co. LTD.	H19990372
Microtome	Leica	RM2255
Neutral balsam	Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd	Zli-9555
Paraffin embedding machine	Leica	HistoCore Arcadia H
SD rat, 8-week-old, Male, 180-220 g	144 Animal Center of Ningxia Medical University
Slide scanner	Leica	Aperio LV1
Vortex oscillator	Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd	QL-902