Mécanisme de l’acupoint cerveau-rein Shu-Mu dans le traitement de l’oligoasthénospermie chez le rat via l’axe hypothalamo-hypophyso-testiculaire

Résumé

Cette étude vise à vérifier l’effet thérapeutique de l’acupoint Shu-Mu Brain-Kidney sur l’oligoasthénospermie chez le rat et à explorer son mécanisme sous-jacent à travers l’axe hypothalamo-hypophyso-testiculaire (HPT).

Résumé

L’oligoasthénospermie est une cause fréquente d’infertilité masculine. L’axe hypothalamo-hypophyso-testiculaire (HPT) régule la différenciation et la maturation des gonades par la synthèse et la libération d’hormones de reproduction, jouant un rôle essentiel dans la fertilité masculine. La perturbation de la stabilité de l’axe HPT nuit à la production de spermatozoïdes, réduisant ainsi la qualité du sperme. L’étude de l’effet de l’électroacupuncture sur la régulation de l’axe HPT peut fournir des informations sur le traitement de l’oligoasthénospermie. Cinquante rats SD mâles âgés de 8 semaines ont été divisés au hasard en groupes blancs, modèles, Shu-Mu Cerveau-Rein, sans points d’acupuncture et L-carnitine (n = 10 par groupe). À l’exception du groupe blanc, les rats ont reçu de l’adénine par voie intragastrique pendant 28 jours pour établir le modèle. Après la modélisation, le groupe Shu-Mu Brain-Kidney a subi une électroacupuncture à des points d’acupuncture désignés, tandis que le groupe sans acupoint a reçu un traitement simulé pendant 30 minutes par jour. Le groupe L-carnitine a reçu de la L-carnitine (10 mL/kg) par voie intragastrique une fois par jour. Les traitements se sont poursuivis pendant 28 jours. Les conditions générales, les coefficients organiques et la qualité du sperme ont été évalués. La coloration HE a analysé la morphologie des tissus et ELISA a détecté des changements hormonaux sériques. Par rapport au groupe modèle, les groupes Shu-Mu Brain-Kidney et L-carnitine ont montré des améliorations significatives de l’esprit, de l’alimentation et des selles, avec une augmentation du poids corporel, tandis que le groupe sans point d’acupuncture n’a montré aucun changement significatif. Les coefficients des organes rénaux ont diminué de manière significative dans les groupes Shu-Mu Brain-Kidney et L-carnitine, mais sont restés inchangés dans le groupe sans points d’acupuncture. Les coefficients des organes testiculaires n’ont montré aucune différence significative entre les groupes de traitement. Le nombre, la densité, la survie et les taux de motilité des spermatozoïdes se sont considérablement améliorés dans les groupes Shu-Mu Brain-Kidney et L-carnitine, mais pas dans le groupe sans point d’acupuncture. La coloration H&E a montré une amélioration des lésions rénales et testiculaires dans les groupes Shu-Mu Brain-Kidney et L-carnitine. L’ELISA a révélé une augmentation de la T, de la GnRH et de l’INHB et une diminution des taux de LH, FSH, E2 et PRL dans ces groupes (p < 0,001), sans changement significatif dans le groupe sans point d’acupuncture. Ces résultats indiquent que la thérapie Shu-Mu Brain-Kidney acupoint améliore la qualité des spermatozoïdes en régulant l’axe HPT, offrant ainsi un traitement potentiel pour l’oligoasthénospermie.

Introduction

L’oligoasthénospermie, divisée en « oligospermie » et « asthénospermie », est l’un des types courants d’infertilité masculine, avec un taux d’incidence représentant environ 75 % des cas d’infertilité masculine¹. L’oligoasthénospermie se caractérise principalement par une diminution de la densité et de la motilité des spermatozoïdes dans les testicules et se manifeste principalement cliniquement par un trouble de la spermatogenèse, une réduction du nombre de spermatozoïdes et une faible motilité des spermatozoïdes ^2,3. Ces dernières années, l’incidence de l’oligoasthénospermie a augmenté d’année en année^. En l’absence d’un traitement efficace, elle aura des effets néfastes à long terme sur la santé physique et mentale des patients, voire^{sur l’harmonie} familiale5. Des études ont montré que les problèmes génétiques⁶, les troubles endocriniens de la reproduction⁷, les infections du tractus urogénital⁸ et les médicaments chimiques⁹ peuvent affecter la production et la maturation des spermatozoïdes, entraînant une baisse de la qualité du sperme. Actuellement, l’amélioration de la qualité des spermatozoïdes endommagés est devenue un problème difficile dans le domaine médical.

L’axe hypothalamo-hypophyso-testiculaire (HPT) est la principale voie de régulation de la reproduction dans le corps, qui peut réguler la différenciation et la maturation des gonades en stimulant la synthèse et la libération d’hormones reproductives liées à l’hypothalamus, à l’hypophyse et aux testicules, et joue un rôle important dans le maintien d’une fonction reproductive masculine normale¹⁰. Si la stabilité de la fonction de l’axe HPT est perturbée, la sécrétion testiculaire sera insuffisante pour atteindre la concentration physiologique de testostérone, ce qui entraînera une diminution du nombre et de la qualité des spermatozoïdes dans le testicule¹¹. Par conséquent, le traitement de l’oligoasthénospermie vise principalement à réguler la fonction de l’axe HPT et à atteindre l’objectif de maintenir l’équilibre des hormones endocriniennes associées, augmentant ainsi le nombre de spermatozoïdes dans le sperme, augmentant l’activité des spermatozoïdes et améliorant la qualité du sperme.

Dans le traitement clinique de l’oligoasthénospermie, la médecine moderne adopte principalement des méthodes telles que la chirurgie et les médicaments anti-oxydants et améliorent la motilité des spermatozoïdes^12,13, tandis que la thérapie par électroacupuncture combine l’acupuncture traditionnelle chinoise et la bioélectricité médicale moderne. Il présente les avantages d’être rapide et précis, d’avoir un effet curatif évident, d’avoir peu d’effets indésirables, un large éventail de maladies appropriées et un faible coût de traitement, et d’avoir un bon effet de traitement sur l’oligoasthénospermie^14,15. « Le dos est yang et l’abdomen est yin. » La combinaison de points d’acupuncture Shu-Mu combine les points Shu avec les points Mu, un à l’avant et un à l’arrière, un yin et un yang, travaillant ensemble, également connue sous le nom de méthode de combinaison d’acupoints avant-arrière. La médecine traditionnelle chinoise (MTC) croit que le rein est la racine de l’essence prénatale et que la maladie est située dans le rein. Le point Front-mu du rein, Jingmen (GB25), et le point Back-shu, Shenshu (BL23), sont sélectionnés, ce qui a pour effet de réchauffer le rein, d’aider le yang et de rechercher le yang dans le yin^16,17 ; le rein stocke l’essence et régit la production de moelle, le cerveau est la mer de moelle et le lieu de rencontre de tous les yang, et Taixi (KI3) est le point source du méridien du rein Shaoyin du pied, qui peut réguler et tonifier le foie et les reins, nourrir le yin et générer la moelle¹⁸. Combiné avec l’Epangsanxian (MS4), il relie le rein et le cerveau, reflétant l’idée de la « combinaison de points d’acupuncture Shu-Mu Brain-Kidney » dans la MTC¹⁹, et l’effet thérapeutique est plus évident que celui de l’acupuncture ordinaire.

Les études de traitement actuelles sur la qualité du sperme se concentrent principalement sur l’amélioration de la structure et de la fonction testiculaires, tandis que des recherches limitées ont été menées sur la régulation des taux d’hormones sériques dans différents tissus de l’axe hypothalamo-hypophyso-testiculaire (HPT)²⁰. Dans le cadre de recherches préliminaires, le séquençage de l’ARN (RNA-Seq) a été utilisé pour identifier les gènes candidats et les voies régulatrices impliquées dans la régulation de la qualité du sperme dans les tissus hypothalamiques, hypophysaires et testiculaires de rats sains et de rats modèles d’oligozoospermie induite par l’adénine²¹. De plus, des tests de qualité du sperme et une analyse histologique des tissus testiculaires ont été effectués dans les deux groupes. Ces résultats ont permis de mieux comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à la qualité du sperme chez les rats atteints d’oligoasthénospermie induite par l’adénine. La thérapie d’électroacupuncture avec un point d’acupuncture approximatif à distance pourrait améliorer la qualité des spermatozoïdes chez les rats oligoasthénospermes en régulant l’axe HPT, et l’effet est lié au processus de stress oxydatif²². Cependant, on ne sait pas si l’acupoint Shu-Mu Brain-Kidney peut améliorer la qualité du sperme des rats en régulant l’axe HPT. Afin d’explorer davantage le mécanisme régulateur de l’amélioration de la qualité du sperme chez les rats oligoasthénospermes et les méthodes de traitement efficaces, cette étude a utilisé un modèle d’oligoasthénospermie induite par l’adénine chez le rat et a sélectionné quatre points d’acupuncture, Epangsanxian, Shenshu, Jingmen et Taixi, pour explorer le mécanisme associé de l’effet thérapeutique de l’acupoint Shu-Mu Cerveau-Rein sur l’oligoasthénospermie chez le rat du point de vue de l’axe HPT. fournissant une base plus scientifique pour le traitement clinique.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été examinées et approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université médicale du Ningxia (numéro d’approbation : IACUC-NYLAC-2021-130). L’étude a été réalisée en stricte conformité avec les directives ARRIVE 2.0 pour l’expérimentation animale et a adhéré aux principes de bien-être animal décrits dans le Guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Cette étude contrôlée randomisée sur des animaux a utilisé une analyse de variance à un facteur et a été menée au Centre d’expérimentation animale de l’Université de médecine du Ningxia de mars à mai 2023. Des rats SD mâles de 180 à 220 g, âgés de huit semaines, pesant de 180 à 220 g ont été utilisés pour cette étude. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés sont répertoriés dans le tableau des matériaux.

1. Procédures d’établissement et de traitement des modèles animaux

1. Animaux d’expérimentation et groupes
   1. Obtenez cinquante rats SD mâles de 8 semaines pesant de 180 à 220 g.
   2. Hébergez tous les rats dans des conditions standard, en maintenant une température ambiante de 22-25 °C, une humidité de 50 à 60 % et en leur offrant un accès gratuit à de la nourriture et à de l’eau standard pour rongeurs.
   3. Après une semaine d’adaptation, divisez au hasard les rats en un groupe blanc (B) (n = 10) et un groupe modèle (n = 40) à l’aide d’une méthode de table de nombres aléatoires. Administrer une solution saline normale au groupe blanc et de l’adénine au groupe modelage par gavage oral.
   4. Après 28 jours, divisez au hasard le groupe de modélisation en un groupe modèle (M), un groupe Shu-Mu Cerveau-Rein (S), un groupe sans point d’acupuncture (N) et un groupe L-carnitine (L) (n = 10 par groupe). Laissez le groupe de modèles non traité.
      1. Appliquez l’intervention d’électroacupuncture à l’aide de la méthode d’appariement des points d’acupuncture Shu-Mu Brain-Kidney au groupe Shu-Mu Brain-Kidney. Administrer un traitement sans acupoint au groupe sans acupoint et un liquide oral de L-carnitine par gavage au groupe L-carnitine. Traitez tous les groupes en continu pendant 28 jours.
2. Construction de modèles
   REMARQUE : Des études ont montré que de fortes doses d’adénine peuvent affecter la fonction testiculaire chez les rats, entraînant une sécrétion anormale d’hormones sexuelles, une perturbation de la stabilité fonctionnelle de l’axe HPT et une baisse de la qualité du sperme²³. Par conséquent, l’adénine est couramment utilisée pour établir des modèles d’infertilité chez les animaux mâles.
   1. Administrer une solution saline normale (1 mL/100 g de poids corporel) au groupe blanc et de l’adénine (20 mg/100 g de poids corporel) au groupe modèle par gavage oral (figure 1A).
   2. Assurer une agitation continue pendant le gavage pour éviter la précipitation de l’adénine et le blocage de l’aiguille du gavage. Administrer le traitement une fois par jour pendant 28 jours.
3. 1.3 Procédure de traitement
   1. Groupe Shu-Mu Cerveau-Rein
      1. Commencer l’intervention le premier jour après la modélisation. Effectuez l’acupuncture avec des aiguilles d’acupuncture stériles jetables sur des points bilatéraux. Après avoir réparé le rat, exposez et désinfectez le site d’acupuncture.
      2. Fixez la peau du site d’acupuncture avec la main gauche et percez rapidement le point d’acupuncture avec l’aiguille d’acupuncture stérile jetable dans la main droite. Connectez un stimulateur électrique. Appliquez des ondes de dilatation avec une fréquence d’électroacupuncture de 2 Hz, une intensité de stimulation de 1,5 mA et un léger tremblement du muscle local.
      3. Effectuez un traitement d’électroacupuncture pendant 30 minutes à chaque fois, une fois par jour, pendant 28 jours consécutifs (Figure 1B).
         REMARQUE : Sélectionnez les points d’acupuncture chez le rat en vous référant à l’Experimental Acupuncture and Moxibustion Science de Yong Tang, Annexe II, « Points d’acupuncture couramment utilisés chez les animaux de laboratoire », combiné à une méthode de sélection de points anatomiques comparative¹⁹. Les points suivants ont été sélectionnés : (1) Epangsanxian (MS4) : situé à 3 mm en dessous et 4 mm à l’extérieur du point Touwei. Opération : Piqûre droite de 1 à 2 mm ; (2) Shenshu (BL23) : Situé dans la région de la colonne vertébrale, des deux côtés de l’apophyse épineuse inférieure de la deuxième vertèbre lombaire, à 6 mm de la ligne dorsale médiane. Opération : Piqûre de 6 mm droite ; (3) Jingmen (GB25) : Situé sur le côté de la taille, à l’extrémité libre de la 13e côte sur le côté inférieur. Opération : Piqûre droite de 1 à 2 mm ; (4) Taixi (KI3) : Situé sur la face interne du pied, dans la dépression entre le point haut de la cheville médiale et le bord postérieur du tendon d’Achille. Fonctionnement : Piqûre de 3 mm droite.
   2. Groupe sans points d’acupuncture
      1. Sélectionnez et utilisez les points non acuculaires 1, 2 et 3 de la même manière que le groupe Shu-Mu Cerveau-Rein (Figure 1B).
         REMARQUE : Parce que les non-points d’acupuncture ne suivent pas le principe de sélection des points le long des méridiens, et selon la théorie de la médecine traditionnelle chinoise (MTC) et l’observation clinique à long terme, ces trois points d’acupuncture ont peu d’effet thérapeutique sur les patients atteints d’oligoasthénozoospermie²⁴. (1) Non-point d’acupuncture 1 : Situé au milieu de la ligne entre l’extrémité du coude et l’aisselle sur la face interne du coude. Opération : Piqûre droite de 1 à 2 mm ; (2) Non-acupoint 2 : Situé au milieu entre l’épicondyle médial de l’humérus et le poignet du cubitus, sur le bord ulnaire. Opération : Piqûre droite de 1 à 2 mm ; (3) Non-point d’acupuncture 3 : Situé à l’intersection du muscle deltoïde antérieur et du muscle biceps à l’intérieur du bras. Opération : Piqûre de 1 à 2 mm droite.
   3. Groupe L-carnitine
      1. Administrer la lévocarnitine liquide par voie orale par gavage oral à une dose de 10 mL/kg de poids corporel, une fois par jour, pendant 28 jours consécutifs (figure 1A).
4. Euthanasie
   1. Après le traitement, laisser tous les rats à jeun pendant 24 heures, les anesthésier par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique à 2 % (40 mg/kg de poids corporel, conformément aux protocoles approuvés par l’établissement) et prélever du sang à l’apex du cœur à l’aide d’une aiguille de prélèvement de sang intraveineuse jetable^21,24.
   2. Après la mort par décapitation, retirez un côté de l’épididyme pour mesurer la qualité du sperme. Récoltez les tissus rénaux et testiculaires, pesez-les et enregistrez-les, puis fixez-les dans un fixateur de paraformaldéhyde à température ambiante pendant 48 h avant de les intégrer dans de la paraffine²⁴.

2. Indices d’observation

1. Observation générale : Observez l’état mental, le régime alimentaire et les selles des rats, et surveillez quotidiennement leur poids corporel.
2. Coefficients organiques : Après la mort, retirez soigneusement la graisse superficielle et le tissu conjonctif des tissus rénaux et testiculaires, rincez avec une solution saline normale, séchez avec du papier filtre, pesez sur une balance et enregistrez les mesures pour le calcul des coefficients organiques. Coefficient d’organe ( %) = (poids de l’organe [g] / poids corporel [g]) x 100 %.
3. Qualité du sperme
   1. Après avoir retiré l’excès de graisse, retirez et placez un côté de l’épididyme de chaque rat dans un bain-marie à température constante à 37 °C pendant 5 min. Ensuite, coupez, filtrez, soufflez doucement et mélangez bien l’échantillon.
   2. Prenez une aliquote de 10 μL de la suspension de spermatozoïdes diluée et déposez-la sur le bord du verre de couverture d’une plaque de comptage préchauffée, permettant à la suspension de spermatozoïdes de pénétrer automatiquement dans la chambre de comptage.
   3. Mesurez le nombre, la densité, le taux de survie et le taux de motilité des spermatozoïdes à l’aide d’un système CASA (analyse de sperme assistée par ordinateur)²¹.
4. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E)
   REMARQUE : Pour plus de détails sur la procédure, veuillez consulter Yang, N. et ^al.21.
   1. Rincez les tissus fixés à l’eau courante, déshydratez-les et incrustez-les.
   2. Coupez des tronçons de paraffine (5 m d’épaisseur) à l’aide d’un microtome et faites-les cuire au four à 65 °C pendant 4 h.
   3. Déparaffinez les sections et réhydratez-les avec de l’eau.
   4. Teindre les sections avec une solution de coloration à l’hématoxyline pendant 3 min, puis rincer à l’eau courante.
   5. Déshydratez les sections avec de l’éthanol à 95 % pendant 1 min, puis colorez avec une solution d’éosine pendant 2 min.
   6. Après avoir scellé les lames, effectuez la numérisation à l’aide d’un scanner de diapositives, puis collectez et analysez les images.
5. Dosage immuno-enzymatique (ELISA)
   REMARQUE : Pour plus de détails sur la procédure, veuillez consulter Yang, N. et ^al.21.
   1. Pour préparer le sérum, ajoutez des substances étalons et du sérum des concentrations correspondantes dans les puits de substance standard et les puits d’échantillonnage à mesurer, puis ajoutez le réactif marqué par enzyme.
   2. Effectuer les étapes d’incubation, de lavage, de développement de la couleur et de terminaison.
   3. Déterminez l’absorbance à une longueur d’onde de 450 nm à l’aide d’un instrument marqué par des enzymes et calculez les niveaux d’expression de la testostérone (T), de l’hormone de libération des gonadotrophines (GnRH), de l’inhibine B (INHB), de l’hormone lutéinisante (LH), de l’hormone folliculo-stimulante (FSH), de l’œstradiol (E2) et de la prolactine (PRL).

3. Analyse statistique

1. Analyser les données expérimentales à l’aide d’un logiciel statistique et présenter les résultats de chaque groupe sous forme de moyenne ± d’écart-type (moyenne ± écart-type).
2. Utilisez l’ANOVA à un facteur pour comparer les moyennes d’échantillon entre plusieurs groupes qui répondent aux hypothèses de normalité et d’homogénéité de la variance.
3. Utilisez le test t pour les comparaisons entre deux groupes et les tests non paramétriques pour les données qui ne répondent pas aux hypothèses ci-dessus.
4. Considérez les différences comme statistiquement significatives lorsque p < 0,05.

Résultats

Évaluation du modèle

Après la modélisation, observez les rats pour la léthargie, la posture accroupie, les membres froids, la réticence à manger, la perte de poids, l’augmentation du volume d’urine, les selles molles et d’autres symptômes, qui s’alignent généralement avec le syndrome de carence en rein-yang.

Discussion

En MTC, le « rein » se compose du « rein interne », faisant référence aux fonctions du système urinaire dans la médecine moderne, et du « rein externe », faisant référence à l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique et aux organes reproducteurs externes anatomiques²⁵. Les vésicules séminales mâles appartiennent au « rein externe » et leurs composants comprennent les testicules, les épididymes, les vésicules séminales, etc.^26<...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine	Beijing Solarbio Science & Technology Co. Ltd.	A8330
CASA computer-assisted semen analysis system	Nanning Songjing Tianlun Biotechnology Co., Ltd.	VICOS-SPERM
Centrifuge	Sartorius	A-14C
Differentiation fluid	Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd	C0163M
Disposable sterile acupuncture needles	Hanyi brand	0.25mm*13mm
Drying machine	Leica	HI1220
Electrical stimulator	Hua Tuo Brand	SDZ-II
Electronic balance	Hangzhou Youheng Weighing Equipment Co., Ltd	HLD-6002
ELISA kit	Shanghai Jianglai Biotechnology Co. LTD	JL13251?JL11473?JL11525?JL12505?JL13256?JL12201
Enzyme-labeled instrument	Rayto	RT-6100
Eosin staining solution	Zhuhai Beso Biotechnology Co. LTD	BA-4024
Hematoxylin staining solution	Zhuhai Beso Biotechnology Co. LTD	BA-4041
Levocarnitine oral liquid	Northeast Pharmaceutical Group Shenyang First Pharmaceutical Co. LTD.	H19990372
Microtome	Leica	RM2255
Neutral balsam	Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd	Zli-9555
Paraffin embedding machine	Leica	HistoCore Arcadia H
SD rat, 8-week-old, Male, 180-220 g	144 Animal Center of Ningxia Medical University
Slide scanner	Leica	Aperio LV1
Vortex oscillator	Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd	QL-902