Механизм акупунктурной точки Шу-му мозг-почка в лечении олигоастеноспермии у крыс через гипоталамо-гипофизарно-тестикулярную ось

Резюме

Данное исследование направлено на проверку терапевтического эффекта акупунктурной точки Shu-Mu Brain-Kidney на олигоастеноспермию у крыс и изучение ее основного механизма через ось гипоталамо-гипофиз-яичко (HPT).

Аннотация

Олигоастеноспермия является распространенной причиной мужского бесплодия. Гипоталамо-гипофизарно-тестикулярная ось (HPT) регулирует дифференцировку и созревание гонад посредством синтеза и высвобождения репродуктивных гормонов, играя жизненно важную роль в мужской фертильности. Нарушение стабильности оси HPT ухудшает выработку спермы, снижая качество спермы. Изучение влияния электроакупунктуры на регуляцию оси HPT может дать представление о лечении олигоастеноспермии. Пятьдесят 8-недельных самцов крыс SD были случайным образом разделены на пустые, модельные, Shu-Mu Brain-Kidney, неакупунктурные и L-карнитины (n = 10 в группе). За исключением холостой группы, крысы получали аденин внутрижелудочно в течение 28 дней для формирования модели. После моделирования группа Shu-Mu Brain-Kidney подвергалась электроакупунктуре в определенных акупунктурных точках, в то время как группа без акупунктурных точек получала фиктивное лечение в течение 30 минут ежедневно. Группа L-карнитина получала L-карнитин (10 мл/кг) внутрижелудочно один раз в сутки. Лечение продолжалось в течение 28 дней. Оценивали общее состояние, коэффициенты органов и качество спермы. При окрашивании HE анализировалась морфология тканей, а с помощью ИФА выявлялись изменения гормонов сыворотки крови. По сравнению с модельной группой, группы Shu-Mu Brain-Kidney и L-карнитин продемонстрировали значительные улучшения в духе, диете и опорожнении кишечника с увеличением массы тела, в то время как группа без акупунктурных точек не показала существенных изменений. Коэффициенты почечных органов значительно снизились в группах Shu-Mu Brain-Kidney и L-карнитина, но остались неизменными в группе без акупунктурных точек. Коэффициенты тестикулярных органов не показали достоверных различий между группами лечения. Количество сперматозоидов, их плотность, выживаемость и подвижность значительно улучшились в группах Shu-Mu Brain-Kidney и L-карнитина, но не в группах без акупунктурных точек. Окрашивание H&E показало улучшение повреждения почек и тканей яичек в группах Shu-Mu Brain-Kidney и L-карнитина. ИФА выявила повышение T, ГнРГ и INHB и снижение уровней ЛГ, ФСГ, Е2 и PRL в этих группах (p < 0,001), без существенных изменений в группе без акупунктурных точек. Эти результаты указывают на то, что акупунктурная терапия Shu-Mu Brain-Kidney улучшает качество спермы за счет регулирования оси HPT, предлагая потенциальное лечение олигоастеноспермии.

Введение

Олигоастеноспермия, разделенная на «олигоспермию» и «астеноспермию», является одним из распространенных типов мужского бесплодия, с частотой заболеваемости, составляющей около 75^{% случаев} мужского бесплодия. Олигоастеноспермия в основном характеризуется снижением плотности и подвижности сперматозоидов в яичках и в основном клинически проявляется нарушением сперматогенеза, снижением количества сперматозоидов и низкой подвижностью сперматозоидов ^2,3. В последние годы заболеваемость олигоастеноспермией увеличивается из года в⁴ года. Без эффективного лечения он будет иметь долгосрочные неблагоприятные последствия для физического и психического здоровья пациентов и даже для гармонии в семье⁵. Исследования показали, что генетические проблемы⁶, репродуктивные эндокринные расстройства⁷, инфекции урогенитального тракта⁸ и химические препараты⁹ могут влиять на производство и созревание сперматозоидов, что приводит к снижению качества спермы. В настоящее время улучшение качества поврежденной спермы стало сложной проблемой в медицинской сфере.

Гипоталамо-гипофизарно-тестикулярная ось (HPT) является основным путем регуляции репродуктивной функции в организме, который может регулировать дифференцировку и созревание половых желез, стимулируя синтез и высвобождение репродуктивных гормонов, связанных с гипоталамусом, гипофизом и яичками, и играет важную роль в поддержании нормальной мужской репродуктивной^{функции.}. Если стабильность функции оси HPT нарушена, это приведет к тому, что секреция яичек будет недостаточной для достижения физиологической концентрации тестостерона, что приведет к снижению количества и качества сперматозоидов в яичке¹¹. Таким образом, лечение олигоастеноспермии в основном направлено на регулирование функции оси HPT и достижение цели поддержания баланса родственных эндокринных гормонов, тем самым увеличивая количество сперматозоидов в сперме, повышая активность сперматозоидов и улучшая качество спермы.

В клиническом лечении олигоастеноспермии современная медицина в основном использует такие методы, как хирургия и препараты против окисления и повышения подвижности сперматозоидов^12,13, в то время как электроакупунктура сочетает в себе традиционную китайскую акупунктуру и современную медицинскую биоэлектрическую. Он имеет преимущества в том, что он быстрый и точный, имеет очевидный лечебный эффект, имеет небольшое количество побочных реакций, широкий спектр подходящих заболеваний и низкую стоимость лечения, а также имеет хороший лечебный эффект при олигоастеноспермии^14,15. «Задняя часть — ян, а живот — инь». Комбинация акупунктурных точек Шу-Му сочетает в себе точки Шу с точками Му, одну спереди и одну сзади, одну инь и одну ян, работающие вместе, также известный как метод комбинации акупунктурных точек спереди-сзади. Традиционная китайская медицина (ТКМ) считает, что почка является корнем пренатальной эссенции, а заболевание локализуется в почках. Выбрана точка Фронт-му почки, Цзинмэнь (GB25), и точка Бэк-шу, Шэньшу (BL23), которая имеет эффект согревания почки, помощи ян и поиска ян внутри инь^16,17; Почка хранит эссенцию и управляет производством костного мозга, мозг является морем костного мозга и местом встречи всего ян, а Тайси (KI3) является исходной точкой меридиана почек стопы Шаоинь, который может регулировать и тонизировать печень и почки, питать инь и вырабатывать костный мозг¹⁸. В сочетании с Epangsanxian (MS4) он соединяет почку и мозг, отражая идею «комбинации мозга и почек Шу-Му» в TCM¹⁹, и терапевтический эффект более очевиден, чем у обычной акупунктуры.

Текущие исследования качества спермы в первую очередь сосредоточены на улучшении структуры и функции яичек, в то время как были проведены ограниченные исследования по регуляции уровня гормонов в сыворотке крови в различных тканях гипоталамо-гипофизарно-тестикулярной оси (HPT)²⁰. В предварительных исследованиях секвенирование РНК (RNA-Seq) было использовано для идентификации генов-кандидатов и регуляторных путей, участвующих в регуляции качества спермы в гипоталамо-гипофизарных и тестикулярных тканях здоровых крыс и крыс с моделью олигозооспермии, индуцированной аденином²¹. Кроме того, в обеих группах был проведен анализ качества спермы и гистологический анализ тканей яичка. Эти результаты позволили получить представление о молекулярных механизмах, лежащих в основе качества спермы у крыс, страдающих олигоастеноспермией, вызванной аденином. Электроакупунктурная терапия с дистанционно-приближенной акупунктурной точкой может улучшить качество спермы у крыс с олигоастеноспермией за счет регуляции оси HPT, и этот эффект связан с процессом окислительного стресса²². Тем не менее, неизвестно, может ли акупунктурная точка Shu-Mu Brain-Kidney улучшить качество спермы крыс за счет регуляции оси HPT. Для дальнейшего изучения регуляторного механизма улучшения качества спермы у крыс с олигоастеноспермией и эффективных методов лечения, в этом исследовании использовалась модель олигоастеноспермии крыс, индуцированная аденином, и были выбраны четыре акупунктурные точки: Эпангсансянь, Шэньшу, Цзинмэнь и Тайси, чтобы изучить связанный механизм терапевтического эффекта акупунктурной точки Shu-Mu Brain-Kidney на олигоастеноспермию у крыс с точки зрения оси HPT. обеспечение более научной основы для клинического лечения.

протокол

Все эксперименты на животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по этике животных Медицинского университета Нинся (номер одобрения: IACUC-NYLAC-2021-130). Исследование проводилось в строгом соответствии с рекомендациями ARRIVEs Guidelines 2.0 для экспериментов на животных и с соблюдением принципов благополучия животных, описанных в Руководстве NIH по уходу и использованию лабораторных животных. Это рандомизированное контролируемое исследование на животных с использованием одностороннего дисперсионного анализа проводилось в Центре экспериментов на животных Медицинского университета Нинся с марта по май 2023 года. Для исследования были использованы восьминедельные самцы крыс-класса SPF с массой тела 180-220 г. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Процедуры создания и лечения животных моделей

1. Экспериментальные животные и группы
   1. Получить пятьдесят 8-недельных самцов крыс-SD класса SPF массой 180-220 г.
   2. Содержать всех крыс в стандартных условиях, поддерживая комнатную температуру 22-25 °C, влажность 50%-60%, а также обеспечивая свободный доступ к стандартному корму и воде для грызунов.
   3. После одной недели адаптации случайным образом разделите крыс на пустую (B) группу (n = 10) и моделирующую группу (n = 40) с помощью метода таблицы случайных чисел. Введение нормального физиологического раствора в пустую группу и аденина в моделирующую группу пероральным зондированием.
   4. Через 28 дней случайным образом разделите моделирующую группу на модельную группу (M), группу Shu-Mu Brain-Kidney (S), группу без акупунктурных точек (N) и группу L-карнитина (L) (n = 10 в группе). Оставьте модельную группу без лечения.
      1. Применение электроакупунктурного вмешательства с использованием метода сопоставления акупунктурных точек Shu-Mu Brain-Kidney к группе Shu-Mu Brain-Kidney group. Назначайте неакупунктурную терапию группе без акупунктурных точек и жидкость L-карнитина перорально через зонд группе L-карнитина. Лечите все группы непрерывно в течение 28 дней.
2. Построение модели
   ПРИМЕЧАНИЕ: Исследования показали, что высокие дозы аденина могут влиять на функцию яичек у крыс, что приводит к аномальной секреции половых гормонов, нарушению функциональной стабильности оси HPT и^{снижению качества} спермы. Таким образом, аденин обычно используется для установления моделей бесплодия самцов животных.
   1. Введите нормальный физиологический раствор (1 мл/100 г массы тела) в бланковую группу и аденин (20 мг/100 г массы тела) в модельную группу путем перорального зондирования (рис. 1A).
   2. Обеспечьте непрерывное перемешивание во время зондирования, чтобы предотвратить осаждение аденина и закупорку иглы зондажа. Применяйте лечение один раз в день в течение 28 дней.
3. 1.3 Процедура лечения
   1. Группа Шу-Му Мозг-Почки
      1. Начинайте вмешательство в первый день после моделирования. Выполняйте иглоукалывание одноразовыми стерильными акупунктурными иглами по двусторонним точкам. После фиксации крысы обнажите и продезинфицируйте место иглоукалывания.
      2. Зафиксируйте кожу места иглоукалывания левой рукой и быстро проткните точку акупунктуры одноразовой стерильной иглой для акупунктуры в правой руке. Подключите электростимулятор. Применяют дилатационные волны с частотой электроакупунктуры 2 Гц, интенсивностью стимуляции 1,5 мА и легким тремором местной мышцы.
      3. Проводите лечение электроакупунктурой в течение 30 минут каждый раз, один раз в день, в течение 28 дней подряд (рисунок 1B).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор акупунктурных точек у крыс со ссылкой на Экспериментальную науку об акупунктуре и прижигании Йонг Тана, Приложение II, «Акупунктурные точки, обычно используемые у экспериментальных животных», в сочетании со сравнительным методом выбора анатомических точек¹⁹. Были выбраны следующие точки: (1) Эпангсаньсянь (MS4): расположена на 3 мм ниже и на 4 мм за пределами точки Тоувэй. Операция: Прокол 1-2 мм прямо; (2) Шэньшу (BL23): Расположен в области позвоночника, по обе стороны от нижнего остистого отростка второго поясничного позвонка, в 6 мм от срединной дорсальной линии. Операция: Укол 6 мм прямой; (3) Цзинмэнь (GB25): Расположен на боковой талии, на свободном конце 13-го ребра на нижней стороне. Операция: Прокол 1-2 мм прямо; (4) Тайси (KI3): Расположен на внутренней стороне стопы, в углублении между верхней точкой медиальной лодыжки и задним краем ахиллова сухожилия. Применение: Укол 3 мм прямо.
   2. Группа без акупунктурных точек
      1. Выберите и управляйте неакупунктурными точками 1, 2 и 3 таким же образом, как и группа Shu-Mu Brain-Kidney (рисунок 1B).
         Примечание: Поскольку неакупунктурные точки не следуют принципу выбора точек вдоль меридианов, и в соответствии с теорией традиционной китайской медицины (ТКМ) и долгосрочным клиническим наблюдением, эти три акупунктурные точки оказывают незначительный терапевтический эффект на пациентов с олигоастенозооспермией²⁴. (1) Неакупунктура 1: Расположена в середине линии между кончиком локтя и подмышкой на внутренней стороне локтя. Операция: Прокол 1-2 мм прямо; (2) Неакупунктура 2: Расположена в средней точке между медиальным надмыщелком плечевой кости и запястьем локтевой кости, на локтевом крае. Операция: Прокол 1-2 мм прямо; (3) Неакупунктурная точка 3: Расположена на пересечении передней дельтовидной мышцы и двуглавой мышцы на внутренней стороне руки. Применение: Прокол 1-2 мм прямо.
   3. Группа L-карнитинов
      1. Применяйте левокарнитин перорально через зонд в дозе 10 мл/кг массы тела один раз в сутки в течение 28 дней подряд (рисунок 1A).
4. Эвтаназия
   1. После лечения дать всем крысам поголодать в течение 24 ч, обезболить их путем внутрибрюшинной инъекции 2% пентобарбитала натрия (40 мг/кг массы тела, в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами) и собрать кровь из верхушки сердца с помощью одноразовой иглы для внутривенного сбора крови^21,24.
   2. После смерти в результате обезглавливания удалите одну сторону придатка яичка, чтобы измерить качество спермы. Соберите ткани почек и яичек, взвесьте и запишите их, а затем зафиксируйте в параформальдегидном фиксаторе при комнатной температуре в течение 48 часов, прежде чем погрузить их в парафин²⁴.

2. Индексы наблюдений

1. Общее наблюдение: Наблюдайте за психическим состоянием, диетой и опорожнением кишечника крыс, а также ежедневно контролируйте вес их тела.
2. Коэффициенты органов: После смерти тщательно удалите поверхностный жир и соединительную ткань из почек и тканей яичек, промойте обычным физиологическим раствором, высушите фильтровальной бумагой, взвесьте на весах и запишите измерения для расчета коэффициентов органов. Коэффициент органа (%) = (масса органа [г] / масса тела [г]) x 100%.
3. Качество спермы
   1. После удаления лишнего жира удалите и поместите по одной стороне придатка яичка у каждой крысы на водяную баню постоянной температуры при температуре 37 °C на 5 минут. Затем нарежьте, профильтруйте, аккуратно подуйте и хорошо перемешайте образец.
   2. Возьмите аликвоту 10 мкл разведенной сперматозоидной суспензии и опустите ее на край покровного стекла предварительно нагретой счетной пластины, позволяя сперматозоидной суспензии автоматически проникнуть в счетную камеру.
   3. Измерьте количество сперматозоидов, их плотность, выживаемость и подвижность с помощью системы CASA (компьютерный анализ спермы)²¹.
4. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о процедуре обратитесь к Yang, N. et ^al.21.
   1. Промойте неподвижные ткани проточной водой, обезвожьте и заделайте их.
   2. Срезать срезы парафина (толщиной 5 мкм) с помощью микротома и выпекать при температуре 65 °C в течение 4 часов.
   3. Очистите срезы от воска и увлажните их водой.
   4. Окрашивайте срезы раствором для окрашивания гематоксилина в течение 3 минут, затем промойте проточной водой.
   5. Обезвоживайте участки 95% этанолом в течение 1 минуты, затем окрашивайте раствором эозина в течение 2 минут.
   6. После запечатывания слайдов выполните сканирование с помощью сканера слайдов, а также соберите и проанализируйте изображения.
5. Иммуноферментный анализ (ИФА)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о процедуре обратитесь к Yang, N. et ^al.21.
   1. Для приготовления сыворотки в лунки стандартного вещества и отмеряемые лунки для проб добавляют стандартные вещества и сыворотку соответствующих концентраций с последующим добавлением меченного ферментом реагента.
   2. Проведите этапы инкубации, промывки, развития цвета и уничтожения.
   3. Определите абсорбцию на длине волны 450 нм с помощью инструмента, меченного ферментами, и рассчитайте уровни экспрессии тестостерона (Т), гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ), ингибина В (INHB), лютеинизирующего гормона (ЛГ), фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), эстрадиола (Е2) и пролактина (ПРЛ).

3. Статистический анализ

1. Проанализируйте экспериментальные данные с помощью статистического программного обеспечения и представьте результаты каждой группы в виде среднего ± стандартного отклонения (среднее ± SD).
2. Используйте однофакторный ANOVA для сравнения средних выборок между несколькими группами, которые удовлетворяют предположениям нормальности и однородности дисперсии.
3. Используйте t-критерий для сравнения двух групп, а непараметрические тесты — для данных, которые не соответствуют вышеуказанным предположениям.
4. Учитывайте статистически значимые различия при p < 0,05.

Результаты

Оценка модели

После моделирования наблюдайте за крысами на предмет вялости, согнутой позы, холодных конечностей, нежелания есть, потери веса, увеличения объема мочи, жидкого стула и других симптомов, которые...

Обсуждение

В ТКМ «почка» состоит из «внутренней почки», относящейся к функциям мочевыделительной системы в современной медицине, и «наружной почки», относящейся к гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси и анатомическим внешним репродуктивным^{органам}. Мужские семенны?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine	Beijing Solarbio Science & Technology Co. Ltd.	A8330
CASA computer-assisted semen analysis system	Nanning Songjing Tianlun Biotechnology Co., Ltd.	VICOS-SPERM
Centrifuge	Sartorius	A-14C
Differentiation fluid	Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd	C0163M
Disposable sterile acupuncture needles	Hanyi brand	0.25mm*13mm
Drying machine	Leica	HI1220
Electrical stimulator	Hua Tuo Brand	SDZ-II
Electronic balance	Hangzhou Youheng Weighing Equipment Co., Ltd	HLD-6002
ELISA kit	Shanghai Jianglai Biotechnology Co. LTD	JL13251?JL11473?JL11525?JL12505?JL13256?JL12201
Enzyme-labeled instrument	Rayto	RT-6100
Eosin staining solution	Zhuhai Beso Biotechnology Co. LTD	BA-4024
Hematoxylin staining solution	Zhuhai Beso Biotechnology Co. LTD	BA-4041
Levocarnitine oral liquid	Northeast Pharmaceutical Group Shenyang First Pharmaceutical Co. LTD.	H19990372
Microtome	Leica	RM2255
Neutral balsam	Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd	Zli-9555
Paraffin embedding machine	Leica	HistoCore Arcadia H
SD rat, 8-week-old, Male, 180-220 g	144 Animal Center of Ningxia Medical University
Slide scanner	Leica	Aperio LV1
Vortex oscillator	Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd	QL-902