시상하부-뇌하수체-고환 축을 통해 쥐의 희소점무정자증을 치료하는 Shu-Mu 뇌-신장 경혈의 메커니즘

요약

본 연구는 쥐의 희소고정정자증에 대한 Shu-Mu Brain-Kidney 경혈의 치료 효과를 검증하고, 시상하부-뇌하수체-고환(HPT) 축을 통해 그 기전을 살펴보는 것을 목적으로 한다.

초록

올리goasthenospermia는 남성 불임의 흔한 원인입니다. 시상하부-뇌하수체-고환(HPT) 축은 생식 호르몬 합성 및 방출을 통해 생식선 분화와 성숙을 조절하여 남성 생식력에 중요한 역할을 합니다. HPT 축 안정성이 방해를 받으면 정자 생산이 손상되어 정액의 질이 저하됩니다. 전기침술이 HPT 축 조절에 미치는 영향을 조사하면 희박혈 정자증 치료에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 50마리의 8주 된 수컷 SD 쥐를 무작위로 블랭크(blank), 모델(model), 슈무(Shu-Mu) 뇌-신장(Shu-Mu Brain-Kidney), 비경혈(non-acupoint) 및 L-카르니틴 그룹(그룹당 n = 10명)으로 나누었습니다. 블랭크 그룹을 제외하고, 쥐는 모델을 확립하기 위해 28일 동안 아데닌을 위장내로 투여받았다. 모델링 후, Shu-Mu Brain-Kidney 그룹은 지정된 경혈에서 전기 침술을 받았고, 경혈이 없는 그룹은 매일 30분 동안 가짜 치료를 받았습니다. L-카르니틴 그룹은 L-카르니틴(10mL/kg)을 1일 1회 위장내로 투여받았습니다. 치료는 28일 동안 계속되었습니다. 일반적인 상태, 장기 계수 및 정액의 질을 평가했습니다. HE 염색은 조직 형태를 분석했고, ELISA는 혈청 호르몬 변화를 감지했습니다. 모델 그룹과 비교했을 때, Shu-Mu Brain-Kidney, L-carnitine 그룹은 체중 증가와 함께 정신, 식단 및 배변 활동에서 유의한 개선을 보인 반면, 경혈이 없는 그룹은 유의한 변화를 보이지 않았습니다. 신장 장기 계수는 Shu-Mu Brain-Kidney 및 L-carnitine 그룹에서 크게 감소했지만 비경혈 그룹에서는 변하지 않았습니다. 고환 장기 계수는 치료 그룹 간에 유의한 차이를 보이지 않았다. 정자 수, 밀도, 생존율 및 운동성은 Shu-Mu Brain-Kidney 및 L-carnitine 그룹에서 유의하게 개선되었지만, 비경혈 그룹에서는 그렇지 않았습니다. H&E 염색 결과 Shu-Mu Brain-Kidney 및 L-carnitine 그룹에서 신장 및 고환 조직 손상이 개선된 것으로 나타났습니다. ELISA는 이들 그룹에서 T, GnRH 및 INHB가 증가하고 LH, FSH, E2 및 PRL 수치가 감소했으며(p < 0.001), 비경혈 그룹에서는 유의한 변화가 없었다. 이러한 결과는 Shu-Mu Brain-Kidney 경혈 요법이 HPT 축을 조절하여 정자의 질을 향상시켜 희소고정정자증에 대한 잠재적인 치료법을 제공한다는 것을 나타냅니다.

서문

"올리고스정자증(oligospermia)"과 "무안정정자증(asthenospermia)"으로 나뉘는 올리고무스템정자증(oligoasthenospermia)은 남성 불임의 흔한 유형 중 하나로, 남성 불임 사례의 약 75%를 차지하는 발병률이 있습니다¹. 올리고안정정자증(oligoasthenospermia)은 주로 고환의 정자 밀도와 운동성 감소를 특징으로 하며, 대부분 임상적으로 정자 형성 장애(spermatogenesis disorder), 정자 수 감소(sperm count 감소), 낮은 정자 운동성(sperm motility)으로 나타납니다 ^2,3. 최근 몇 년 동안 희박종무정자증의 발병률은⁴년마다 증가하고 있습니다. 효과적인 치료가 이루어지지 않으면 환자의 신체적, 정신적 건강은 물론 가족의 화목에도 장기적으로 악영향을 미칠 수 있다⁵. 연구에 따르면 유전적 문제⁶, 생식 내분비 장애⁷, 비뇨생식기 감염⁸ 및 화학 약물⁹이 정자 생산과 성숙에 영향을 미쳐 정액의 질을 저하시킬 수 있다고 한다. 현재 손상된 정자의 질을 개선하는 것은 의료 분야에서 어려운 과제가 되었습니다.

시상하부-뇌하수체-고환(HPT) 축은 신체의 생식 조절의 주요 경로로, 시상하부, 뇌하수체, 고환과 관련된 생식 호르몬의 합성과 분비를 자극하여 생식선의 분화와 성숙을 조절할 수 있으며, 정상적인 남성 생식 기능을 유지하는 데 중요한 역할을 한다¹⁰. HPT 축 기능의 안정성이 중단되면 고환 분비가 테스토스테론의 생리적 농도에 도달하기에 충분하지 않아 고환 내 정자의 수와 질이 저하됩니다¹¹. 따라서 올리고안정정자증의 치료는 주로 HPT 축의 기능을 조절하고 관련 내분비 호르몬의 균형을 유지하여 정액 내 정자 수를 늘리고 정자 활성을 향상시키며 정액의 질을 향상시키는 목적을 달성하는 것을 목표로 합니다.

올리고아스테노스정자증의 임상적 치료에서 현대의학은 주로 수술 및 항산화 약물과 같은 방법을 채택하고 정자 운동성을 향상시키는 반면,^전기침술 요법은 전통 중국 침술과 현대 의학 생체 전기를 결합합니다. 빠르고 정확하며, 명백한 치료 효과가 있고, 부작용이 적고, 적합한 질병이 다양하고, 치료 비용이 저렴하며, 희소고정정자증에 대한 우수한 치료 효과가 있다는 장점이 있습니다^14,15. "등은 양이고 복부는 음입니다." 슈-무 경혈 조합은 슈 포인트와 뮤 포인트를 결합하며, 하나는 앞쪽에, 다른 하나는 뒤쪽에, 하나는 음과 양이 함께 작용하며, 이를 앞뒤 경혈 조합 방법이라고도 합니다. 중국 전통 의학(TCM)은 신장이 태아 진액의 뿌리이며 질병은 신장에 있다고 믿습니다. 신장의 Front-mu 지점 인 Jingmen (GB25)과 Back-shu 지점 인 Shenshu (BL23)가 선택되며, 이는 신장을 따뜻하게하고, 양을 돕고, 음^16,17 내에서 양을 찾는 효과가 있습니다. 신장은 본질을 저장하고 골수 생산을 관장하며, 뇌는 골수의 바다이자 모든 양의 만남의 장소이며, Taixi (KI3)는 간과 신장을 조절하고 강화하며 음에 영양을 공급하고 골수를 생성 할 수있는 발 Shaoyin 신장 자오선의 근원 점입니다¹⁸. Epangsanxian(MS4)과 결합하여 신장과 뇌를 연결하여 TCM¹⁹의 "Shu-Mu 뇌-신장 경혈 조합"이라는 아이디어를 반영하며 치료 효과는 일반 침술보다 더 분명합니다.

정액의 질에 대한 현재의 치료 연구는 주로 고환 구조와 기능을 개선하는 데 초점을 맞추고 있는 반면, 시상하부-뇌하수체-고환(HPT) 축²⁰의 다양한 조직에 걸친 혈청 호르몬 수치 조절에 대한 연구는 제한적이다. 예비 연구에서는 RNA 염기서열분석(RNA-Seq)을 사용하여 건강한 쥐와 아데닌 유도 올리고정자증 모델 쥐의 시상하부, 뇌하수체 및 고환 조직 내에서 정액의 품질 조절에 관여하는 후보 유전자 및 조절 경로를 식별했습니다²¹. 또한 두 그룹 모두에서 정액 품질 검사 및 고환 조직의 조직학적 분석이 수행되었습니다. 이러한 발견은 아데닌 유도 oligoasthenospermia 쥐의 정액 품질의 기저에 있는 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공했습니다. 원거리-근사(distant-approximal acupoint)를 이용한 전기침술요법은 HPT 축을 조절함으로써 희박식정자증(oligoasthenospermia) 쥐의 정자 질을 향상시킬 수 있으며, 그 효과는 산화 스트레스 과정과 관련이 있다²². 그러나 Shu-Mu Brain-Kidney 경혈이 HPT 축을 조절하여 쥐의 정액의 질을 향상시킬 수 있는지는 알려져 있지 않습니다. 본 연구는 희소고정정자증 쥐의 정액질 개선에 대한 조절 기전과 효과적인 치료 방법을 추가로 탐구하기 위해 아데닌 유도 쥐 모델을 사용하여 희석고정정자증의 아데닌 유도 경혈을 사용하고 Epangsanxian, Shenshu, Jingmen 및 Taixi의 4개 경혈을 선택하여 HPT 축 측면에서 쥐의 희소고정정자증에 대한 Shu-Mu Brain-Kidney 경혈의 치료 효과의 관련 메커니즘을 탐색했습니다. 임상 치료를 위한 보다 과학적인 근거를 제공합니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 닝샤 의과대학 동물윤리위원회(승인 번호: IACUC-NYLAC-2021-130)의 검토 및 승인을 받았습니다. 이 연구는 동물 실험에 대한 ARRIVE 가이드라인 2.0에 따라 엄격하게 수행되었으며 NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals에 설명된 동물 복지 원칙을 준수했습니다. 이 무작위 대조 동물 연구는 분산의 일원 분석을 사용했으며 2023년 3월부터 5월까지 닝샤 의과대학 동물 실험 센터에서 수행되었습니다. 이 연구에는 180-220g의 8주 된 SPF 등급 수컷 SD 쥐가 사용되었습니다. 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 동물모델 수립 및 치료 절차

1. 실험 동물 및 그룹
   1. 180-220g의 8주 된 SPF 등급 수컷 SD 쥐 50마리를 얻습니다.
   2. 모든 쥐를 표준 조건에서 수용하고 실내 온도를 22-25 °C, 습도 50%-60%로 유지하고 표준 설치류 사료와 물을 자유롭게 이용할 수 있도록 합니다.
   3. 적응 일주일 후, 무작위 숫자 테이블 방법을 사용하여 쥐를 공백 그룹(B) 그룹(n = 10)과 모델링 그룹(n = 40)으로 무작위로 나눕니다. blank 그룹에는 생리식염수를 투여하고 경구 위장에 의한 모델링 그룹에는 아데닌을 투여합니다.
   4. 28일 후, 모델링 그룹을 모델(M) 그룹, Shu-Mu 뇌-신장(S) 그룹, 비경혈(N) 그룹 및 L-카르니틴(L) 그룹(그룹당 n = 10)으로 무작위로 나눕니다. 모델 그룹을 처리하지 않고 그대로 둡니다.
      1. Shu-Mu Brain-Kidney 경혈 일치 방법을 사용하여 Shu-Mu Brain-Kidney 그룹에 전기 침술 중재를 적용합니다. 비경혈 그룹에는 비경혈 치료를 투여하고 L-카르니틴 그룹에는 가스에 의한 L-카르니틴 경구액을 투여합니다. 28일 동안 모든 그룹을 지속적으로 치료하십시오.
2. 모델 구성
   참고: 연구에 따르면 고용량의 아데닌은 쥐의 고환 기능에 영향을 미쳐 비정상적인 성호르몬 분비, HPT 축의 기능적 안정성 파괴, 정자의 질 저하를 유발할 수 있다²³. 따라서 아데닌은 일반적으로 수컷 동물 불임 모델을 확립하는 데 사용됩니다.
   1. 경구 위절제를 통해 블랭크 그룹에는 생리식염수(1mL/체중 100g)를, 모델 그룹에는 아데닌(체중 20mg/100g)을 투여합니다(그림 1A).
   2. 아데닌 침전과 개배지 바늘의 막힘을 방지하기 위해 개배지 중 지속적인 교반을 보장하십시오. 28일 동안 하루에 한 번 트리트먼트를 투여합니다.
3. 1.3 치료 절차
   1. Shu-Mu 뇌-신장 그룹
      1. 모델링 후 첫 번째 날부터 개입을 시작합니다. 양측 지점에 일회용 멸균 침술로 침술을 시행합니다. 쥐를 고친 후 침술 부위를 노출시키고 소독합니다.
      2. 왼손으로 침 부위의 피부를 고정하고 오른손에는 일회용 멸균 침으로 경혈을 빠르게 찌릅니다. 전기 자극기를 연결합니다. 전기 침술 빈도 2Hz, 자극 강도 1.5mA, 국소 근육의 약간의 떨림으로 팽창파를 적용합니다.
      3. 28일 연속으로 하루에 한 번씩 30분 동안 전기침술을 실시한다(그림 1B).
         참고: Yong Tang의 Experimental Acupuncture and Moxibustion Science, 부록 II, "Acupuncture Points Commonly Used in Experimental Animals"를 참조하여 쥐의 경혈을 비교 해부학적 점 선택^{방법 19}과 결합하여 선택합니다. 다음 지점이 선택되었습니다 : (1) Epangsanxian (MS4) : Touwei 지점 아래 3mm, 외부 4mm에 위치합니다. 작동 : 찌르기 1-2 mm 스트레이트; (2) Shenshu (BL23) : 두 번째 요추의 아래쪽 가시 돌기 양쪽의 척추 부위에 위치하며 정중 등쪽 선 옆 6mm에 위치합니다. 작동 : 찌르기 6mm 직선; (3) Jingmen (GB25) : 아래쪽 13 번째 갈비뼈의 자유 끝에있는 측면 허리에 위치합니다. 작동 : 찌르기 1-2 mm 스트레이트; (4) Taixi (KI3) : 발 안쪽, 내측 발목의 높은 지점과 아킬레스 건의 뒤쪽 가장자리 사이의 함몰부에 위치합니다. 작동 : 3mm 직선으로 찌르십시오.
   2. 비경혈 그룹
      1. Shu-Mu Brain-Kidney 그룹과 동일한 방식으로 비경혈 1, 2, 3을 선택하고 조작합니다(그림 1B).
         참고: 비경혈은 경락을 따라 점 선택의 원리를 따르지 않기 때문에, 그리고 전통 중국 의학(Traditional Chinese Medicine, TCM) 이론과 장기간의 임상 관찰에 따르면, 이 세 가지 경혈은 희박자증 환자에게 치료 효과가 거의 없다²⁴. (1) 비경혈 1: 팔꿈치 끝과 팔꿈치 안쪽 겨드랑이 사이의 선의 중간 지점에 위치합니다. 작동 : 찌르기 1-2 mm 스트레이트; (2) Non-acupoint 2: 상완골의 내측 상과와 척골 손목 사이의 중간 지점, 척골 가장자리에 위치합니다. 작동 : 찌르기 1-2 mm 스트레이트; (3) 비경혈 3: 팔 안쪽의 전방 삼각근과 이두근의 교차점에 위치합니다. 작동: 1-2mm 직선으로 찌르십시오.
   3. L-카르니틴기
      1. 레보카르니틴 경구액을 1일 1회 연속 28일 동안 체중 10mL/kg의 용량으로 경구 위장으로 투여합니다(그림 1A).
4. 안락사
   1. 처리 후에, 모든 쥐가 24 시간 동안 단식하는 것을 허용하고, 2% 펜토바르비탈 나트륨 (40 mg/kg 체중, 기관으로 승인되는 의정서에 따름)의 복강 내 주입에 의하여 그(것)들을 마취하고, 처분할 수 있는 정맥 주사 바늘을 사용하여 심장의 정점에서 혈액을 모으십시오^21,24.
   2. 참수로 사망한 후 부고환의 한쪽 면을 제거하여 정액의 질을 측정합니다. 신장과 고환 조직을 적출하고, 무게를 측정하고 기록한 후 파라핀에 삽입하기 전에 실온에서 48시간 동안 파라포름알데히드 고정제로 고정합니다²⁴.

2. 관측 지수

1. 일반적인 관찰: 쥐의 정신 상태, 식단 및 배변 활동을 관찰하고 매일 체중을 모니터링합니다.
2. 장기 계수: 사망 후 신장과 고환 조직 모두에서 표면 지방과 결합 조직을 조심스럽게 제거하고 일반 식염수로 헹구고 여과지로 건조시킨 다음 저울에 올려 무게를 측정하고 장기 계수 계산을 위한 측정값을 기록합니다. 장기 계수(%) = (장기 중량[g] / 체중[g]) x 100%.
3. 정액의 질
   1. 과도한 지방을 제거한 후 각 쥐의 부고환 한쪽을 제거하고 37°C의 항온 수조에 5분 동안 놓습니다. 그런 다음 자르고, 여과하고, 부드럽게 불어 샘플을 잘 섞습니다.
   2. 희석된 정자 현탁액의 10μL 분취액을 예열된 계수판의 커버 유리 가장자리에 떨어뜨려 정자 현탁액이 계수실로 자동으로 침투할 수 있도록 합니다.
   3. CASA(Computer-Assisted Semen Analysis) 시스템을 사용하여 정자 수, 밀도, 생존율 및 운동성을 측정합니다²¹.
4. Hematoxylin 및 Eosin (H&E) 염색
   참고: 절차에 대한 자세한 내용은 Yang, N. et ^al.21을 참조하십시오.
   1. 고정된 조직을 흐르는 물로 헹구고 탈수시킨 다음 삽입하십시오.
   2. 마이크로톰을 사용하여 파라핀 절편(5μm 두께)을 자르고 65°C에서 4시간 동안 굽습니다.
   3. 섹션을 디왁스하고 물로 다시 수화하십시오.
   4. 헤마톡실린 염색 용액으로 섹션을 3분 동안 염색한 다음 흐르는 물로 헹굽니다.
   5. 95% 에탄올로 단면을 1분 동안 탈수한 다음 에오신 용액으로 2분 동안 염색합니다.
   6. 슬라이드를 밀봉한 후 슬라이드 스캐너를 사용하여 스캔을 수행하고 이미지를 수집 및 분석합니다.
5. 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)
   참고: 절차에 대한 자세한 내용은 Yang, N. et ^al.21을 참조하십시오.
   1. 혈청을 준비하려면 해당 농도의 표준 물질과 혈청을 측정할 표준 물질 웰과 샘플 웰에 추가한 다음 효소 표지 시약을 추가합니다.
   2. 배양, 세척, 발색 및 종료 단계를 수행합니다.
   3. 효소 표지 기기를 사용하여 450nm 파장에서 흡광도를 측정하고 테스토스테론(T), 성선 자극 호르몬 방출 호르몬(GnRH), 인히빈 B(INHB), 황체 형성 호르몬(LH), 난포 자극 호르몬(FSH), 에스트라디올(E2) 및 프로락틴(PRL)의 발현 수준을 계산합니다.

3. 통계 분석

1. 통계 소프트웨어를 사용하여 실험 데이터를 분석하고 각 그룹의 결과를 평균 ± 표준 편차(평균 ± SD)로 제시합니다.
2. 일원 분산 분석(One-way ANOVA)을 사용하여 정규성과 분산의 동질성 가정을 충족하는 여러 그룹 간의 표본 평균을 비교합니다.
3. 두 그룹 간의 비교에는 t-검정 을 사용하고, 위의 가정을 충족하지 않는 데이터에 대해서는 비모수 검정을 사용합니다.
4. p가 0.05일 때 통계적으로 유의< 차이를 고려합니다.

결과

모델 평가

모델링 후 쥐의 무기력증, 웅크린 자세, 차가워진 팔다리, 먹는 것을 꺼리는 경감, 체중 감소, 소변량 증가, 묽은 변 및 일반적으로 신장 양 결핍 증후군과 일치하는 기타 증상을 관찰합니다.

해부 후 신장이 질기고 하얗고 무거운지 ?...

토론

한의학의학에서 "신장(kidney)"은 현대 의학에서 비뇨기계의 기능을 지칭하는 "내부 신장(inner kidney)"과 시상하부-뇌하수체-생식선(hypothalamic-druitary-donnadal axis) 및 해부학적 외부 생식 기관을 의미하는 "외부 신장(outer kidney)"으로 구성된다²⁵. 남성의 정낭은 "바깥쪽 신장(outer kidney)"에 속하며, 그 구성 요소에는 고환(testes), 부고환(epididymides), 정낭(seminal vesicles...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine	Beijing Solarbio Science & Technology Co. Ltd.	A8330
CASA computer-assisted semen analysis system	Nanning Songjing Tianlun Biotechnology Co., Ltd.	VICOS-SPERM
Centrifuge	Sartorius	A-14C
Differentiation fluid	Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd	C0163M
Disposable sterile acupuncture needles	Hanyi brand	0.25mm*13mm
Drying machine	Leica	HI1220
Electrical stimulator	Hua Tuo Brand	SDZ-II
Electronic balance	Hangzhou Youheng Weighing Equipment Co., Ltd	HLD-6002
ELISA kit	Shanghai Jianglai Biotechnology Co. LTD	JL13251?JL11473?JL11525?JL12505?JL13256?JL12201
Enzyme-labeled instrument	Rayto	RT-6100
Eosin staining solution	Zhuhai Beso Biotechnology Co. LTD	BA-4024
Hematoxylin staining solution	Zhuhai Beso Biotechnology Co. LTD	BA-4041
Levocarnitine oral liquid	Northeast Pharmaceutical Group Shenyang First Pharmaceutical Co. LTD.	H19990372
Microtome	Leica	RM2255
Neutral balsam	Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd	Zli-9555
Paraffin embedding machine	Leica	HistoCore Arcadia H
SD rat, 8-week-old, Male, 180-220 g	144 Animal Center of Ningxia Medical University
Slide scanner	Leica	Aperio LV1
Vortex oscillator	Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd	QL-902