Mecanismo del punto de acupuntura cerebro-riñón Shu-Mu en el tratamiento de la oligoastenospermia en ratas a través del eje hipotálamo-hipófisis-testicular

Resumen

Este estudio tiene como objetivo verificar el efecto terapéutico del punto de acupuntura cerebro-riñón Shu-Mu sobre la oligoastenospermia en ratas y explorar su mecanismo subyacente a través del eje hipotálamo-hipófisis-testicular (HPT).

Resumen

La oligoastenospermia es una causa común de infertilidad masculina. El eje hipotálamo-hipófisis-testicular (HPT) regula la diferenciación y maduración gonadal a través de la síntesis y liberación de hormonas reproductivas, desempeñando un papel vital en la fertilidad masculina. La interrupción de la estabilidad del eje HPT perjudica la producción de espermatozoides, lo que reduce la calidad del semen. La investigación del efecto de la electroacupuntura en la regulación del eje HPT puede proporcionar información sobre el tratamiento de la oligoastenospermia. Cincuenta ratas SD macho de 8 semanas de edad se dividieron aleatoriamente en grupos en blanco, modelo, Shu-Mu Cerebro-Riñón, sin acupuntura y L-carnitina (n = 10 por grupo). A excepción del grupo en blanco, las ratas recibieron adenina por vía intragástrica durante 28 días para establecer el modelo. Después del modelado, el grupo Shu-Mu Cerebro-Riñón se sometió a electroacupuntura en los puntos de acupuntura designados, mientras que el grupo sin punto de acupuntura recibió un tratamiento simulado durante 30 minutos al día. El grupo de L-carnitina recibió L-carnitina (10 mL/kg) por vía intragástrica una vez al día. Los tratamientos continuaron durante 28 días. Se evaluaron las condiciones generales, los coeficientes orgánicos y la calidad del semen. La tinción HE analizó la morfología del tejido y el ELISA detectó cambios en las hormonas séricas. En comparación con el grupo modelo, los grupos Shu-Mu Cerebro-Riñón y L-carnitina mostraron mejoras significativas en el espíritu, la dieta y los movimientos intestinales, con un aumento del peso corporal, mientras que el grupo sin punto de acupuntura no mostró cambios significativos. Los coeficientes de los órganos renales disminuyeron significativamente en los grupos Shu-Mu Cerebro-Riñón y L-carnitina, pero permanecieron sin cambios en el grupo sin punto de acupuntura. Los coeficientes de los órganos testiculares no mostraron diferencias significativas entre los grupos de tratamiento. El recuento, la densidad, la supervivencia y las tasas de motilidad de los espermatozoides mejoraron significativamente en los grupos Shu-Mu Cerebro-Riñón y L-carnitina, pero no en el grupo sin punto de acupuntura. La tinción de H&E mostró una mejora en el daño renal y tisular testicular en los grupos Shu-Mu Cerebro-Riñón y L-carnitina. El ELISA reveló un aumento de T, GnRH e INHB y una disminución de los niveles de LH, FSH, E2 y PRL en estos grupos (p < 0,001), sin cambios significativos en el grupo sin punto de acupuntura. Estos hallazgos indican que la terapia de acupuntura cerebro-riñón Shu-Mu mejora la calidad del esperma al regular el eje HPT, lo que ofrece un tratamiento potencial para la oligoastenospermia.

Introducción

La oligoastenospermia, dividida en "oligospermia" y "astenospermia", es uno de los tipos comunes de infertilidad masculina, con una tasa de incidencia que representa alrededor del 75% de los casos de infertilidad masculina¹. La oligoastenospermia se caracteriza principalmente por una disminución de la densidad y la motilidad de los espermatozoides en los testículos y se manifiesta clínicamente principalmente como un trastorno de la espermatogénesis, disminución del recuento de espermatozoides y baja motilidad de los espermatozoides ^2,3. En los últimos años, la incidencia de oligoastenospermia ha aumentado año tras año⁴. Sin un tratamiento eficaz, tendrá efectos adversos a largo plazo en la salud física y mental de los pacientes e incluso en la armonía familiar⁵. Los estudios han demostrado que los problemas genéticos⁶, los trastornos endocrinos reproductivos⁷, las infecciones del tracto urogenital⁸ y los fármacos químicos⁹ pueden afectar la producción y maduración de los espermatozoides, lo que lleva a una disminución de la calidad del semen. Actualmente, mejorar la calidad de los espermatozoides dañados se ha convertido en un problema desafiante en el campo de la medicina.

El eje hipotálamo-hipófisis-testicular (HPT) es la principal vía de regulación reproductiva en el cuerpo, que puede regular la diferenciación y maduración de las gónadas estimulando la síntesis y liberación de hormonas reproductivas relacionadas con el hipotálamo, la glándula pituitaria y los testículos, y desempeña un papel importante en el mantenimiento de la función reproductiva masculina normal¹⁰. Si se interrumpe la estabilidad de la función del eje HPT, hará que la secreción testicular sea insuficiente para alcanzar la concentración fisiológica de testosterona, lo que resultará en una disminución en el número y la calidad de los espermatozoides en el testículo¹¹. Por lo tanto, el tratamiento de la oligoastenospermia tiene como objetivo principal regular la función del eje HPT y lograr el propósito de mantener el equilibrio de las hormonas endocrinas relacionadas, aumentando así la cantidad de espermatozoides en el semen, mejorando la actividad de los espermatozoides y mejorando la calidad del semen.

En el tratamiento clínico de la oligoastenospermia, la medicina moderna adopta principalmente métodos como la cirugía y los medicamentos antioxidantes y mejoran la motilidad de los espermatozoides^12,13, mientras que la terapia de electroacupuntura combina la acupuntura tradicional china y la bioelectricidad médica moderna. Tiene las ventajas de ser rápido y preciso, tener un efecto curativo evidente, tener pocas reacciones adversas, una amplia gama de enfermedades adecuadas y un bajo costo de tratamiento, y tener un buen efecto de tratamiento sobre la oligoastenospermia^14,15. "La espalda es yang y el abdomen es yin". La combinación de puntos de acupuntura Shu-Mu combina los puntos Shu con los puntos Mu, uno en el frente y otro en la parte posterior, un yin y un yang, trabajando juntos, también conocido como el método de combinación de puntos de acupuntura delantero-trasero. La medicina tradicional china (MTC) cree que el riñón es la raíz de la esencia prenatal, y la enfermedad se localiza en el riñón. Se seleccionan el punto mu delantero del riñón, Jingmen (GB25), y el punto shu posterior, Shenshu (BL23), que tiene el efecto de calentar el riñón, ayudar al yang y buscar el yang dentro del yin^16,17; el riñón almacena la esencia y gobierna la producción de médula, el cerebro es el mar de médula y el lugar de encuentro de todo el yang, y Taixi (KI3) es el punto de origen del meridiano del riñón Shaoyin del pie, que puede regular y tonificar el hígado y el riñón, nutrir el yin y generar médula¹⁸. Combinado con Epangsanxian (MS4), conecta el riñón y el cerebro, reflejando la idea de la "combinación de punto de acupuntura Shu-Mu Cerebro-Riñón" en TCM¹⁹, y el efecto terapéutico es más obvio que el de la acupuntura ordinaria.

Los estudios de tratamiento actuales sobre la calidad del semen se centran principalmente en mejorar la estructura y la función testicular, mientras que se han realizado investigaciones limitadas sobre la regulación de los niveles de hormonas séricas en diferentes tejidos del eje hipotálamo-hipófisis-testicular (HPT)²⁰. En la investigación preliminar, se utilizó la secuenciación de ARN (RNA-Seq) para identificar genes candidatos y vías reguladoras involucradas en la regulación de la calidad del semen dentro de los tejidos hipotálamo, hipofisario y testicular de ratas sanas y ratas modelo de oligozoospermia inducida por adenina²¹. Además, se realizaron pruebas de calidad seminal y análisis histológico de los tejidos testiculares en ambos grupos. Estos hallazgos proporcionaron información sobre los mecanismos moleculares que subyacen a la calidad del semen en ratas con oligoastenospermia inducida por adenina. La terapia de electroacupuntura con punto de acupuntura aproximado distante podría mejorar la calidad del esperma en ratas oligoastenospermas mediante la regulación del eje HPT, y el efecto está relacionado con el proceso de estrés oxidativo²². Sin embargo, se desconoce si el punto de acupuntura cerebro-riñón Shu-Mu puede mejorar la calidad del semen de las ratas mediante la regulación del eje HPT. Para explorar más a fondo el mecanismo regulador de la mejora de la calidad del semen en ratas oligoastenospermas y los métodos de tratamiento efectivos, este estudio utilizó un modelo de rata inducida por adenina de oligoastenospermia y seleccionó cuatro puntos de acupuntura, Epangsanxian, Shenshu, Jingmen y Taixi, para explorar el mecanismo relacionado con el efecto terapéutico del punto de acupuntura cerebro-riñón Shu-Mu sobre la oligoastenospermia en ratas desde el aspecto del eje HPT. proporcionando una base más científica para el tratamiento clínico.

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad Médica de Ningxia (número de aprobación: IACUC-NYLAC-2021-130). El estudio se realizó en estricta conformidad con las Directrices ARRIVE 2.0 para experimentos con animales y se adhirió a los principios de bienestar animal descritos en la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Este estudio aleatorizado controlado en animales empleó un análisis unidireccional de la varianza y se llevó a cabo en el Centro de Experimentos Animales de la Universidad Médica de Ningxia de marzo a mayo de 2023. Para este estudio se utilizaron ratas SD macho de ocho semanas de edad con grado SPF que pesaron entre 180 y 220 g. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Procedimientos de establecimiento y tratamiento de modelos animales

1. Animales de experimentación y grupos
   1. Obtenga cincuenta ratas SD macho de grado SPF de 8 semanas de edad con un peso de 180-220 g.
   2. Aloje a todas las ratas en condiciones estándar, manteniendo una temperatura ambiente de 22-25 °C, una humedad del 50% al 60% y proporcionando acceso libre a la alimentación y el agua estándar para roedores.
   3. Después de una semana de adaptación, divida aleatoriamente las ratas en un grupo en blanco (B) (n = 10) y un grupo de modelado (n = 40) utilizando un método de tabla de números aleatorios. Administrar solución salina normal al grupo blanco y adenina al grupo modelar por sonda nasogástrica oral.
   4. Después de 28 días, divida aleatoriamente el grupo de modelado en un grupo modelo (M), un grupo Shu-Mu Cerebro-Riñón (S), un grupo sin punto de acupuntura (N) y un grupo de L-carnitina (L) (n = 10 por grupo). Deje el grupo de modelos sin tratar.
      1. Aplique la intervención de electroacupuntura utilizando el método de coincidencia de puntos de acupuntura Shu-Mu Cerebro-Riñón al grupo Shu-Mu Cerebro-Riñón. Administrar tratamiento sin punto de acupuntura al grupo sin punto de acupuntura y líquido oral con L-carnitina por sonda nasogástrica al grupo con L-carnitina. Tratar a todos los grupos de forma continua durante 28 días.
2. Construcción del modelo
   NOTA: Los estudios han demostrado que altas dosis de adenina pueden afectar la función testicular en ratas, lo que conduce a una secreción anormal de hormonas sexuales, la interrupción de la estabilidad funcional del eje HPT y una disminución en la calidad del esperma²³. Por lo tanto, la adenina se usa comúnmente para establecer modelos de infertilidad animal masculino.
   1. Administrar solución salina normal (1 mL/100 g de peso corporal) al grupo en blanco y adenina (20 mg/100 g de peso corporal) al grupo modelo por sonda nasogástrica oral (Figura 1A).
   2. Asegure la agitación continua durante la sonda nasogástrica para evitar la precipitación de adenina y el bloqueo de la aguja de la sonda nasogástrica. Administrar el tratamiento una vez al día durante 28 días.
3. 1.3 Procedimiento de tratamiento
   1. Grupo Shu-Mu Cerebro-Riñón
      1. Comience la intervención el primer día después del modelado. Realizar la acupuntura con agujas de acupuntura estériles desechables en puntos bilaterales. Después de arreglar la rata, exponga y desinfecte el sitio de acupuntura.
      2. Fije la piel del sitio de acupuntura con la mano izquierda y perfore rápidamente el punto de acupuntura con la aguja de acupuntura estéril desechable en la mano derecha. Conecte un estimulador eléctrico. Aplicar ondas dilatadoras con una frecuencia de electroacupuntura de 2 Hz, una intensidad de estimulación de 1,5 mA y un ligero temblor del músculo local.
      3. Realizar el tratamiento de electroacupuntura durante 30 minutos cada vez, una vez al día, durante 28 días consecutivos (Figura 1B).
         NOTA: Seleccione los puntos de acupuntura en ratas con referencia a la Ciencia de la Acupuntura y la Moxibustión Experimental de Yong Tang, Apéndice II, "Puntos de Acupuntura Comúnmente Utilizados en Animales de Experimentación", combinado con un método comparativo de selección de puntos anatómicos¹⁹. Se seleccionaron los siguientes puntos: (1) Epangsanxian (MS4): Ubicado 3 mm por debajo y 4 mm fuera del punto Touwei. Operación: Pinche 1-2 mm recto; (2) Shenshu (BL23): Situado en la zona de la columna vertebral, a ambos lados de la apófisis espinosa inferior de la segunda vértebra lumbar, a 6 mm al lado de la línea dorsal media. Operación: Pinchazo de 6 mm recto; (3) Jingmen (GB25): Ubicado en la cintura lateral, en el extremo libre de la 13ª costilla en la parte inferior. Operación: Pinche 1-2 mm recto; (4) Taixi (KI3): Situado en la cara interna del pie, en la depresión entre el punto alto del tobillo medial y el borde posterior del tendón de Aquiles. Funcionamiento: Pinchar 3 mm recto.
   2. Grupo sin acupuntura
      1. Seleccione y opere los puntos de acupuntura 1, 2 y 3 que no son de la misma manera que el grupo Shu-Mu Cerebro-Riñón (Figura 1B).
         NOTA: Debido a que los puntos de no acupuntura no siguen el principio de selección de puntos a lo largo de los meridianos, y de acuerdo con la teoría de la Medicina Tradicional China (MTC) y la observación clínica a largo plazo, estos tres puntos de acupuntura tienen poco efecto terapéutico en pacientes con oligoastenozoospermia²⁴. (1) No punto de acupuntura 1: Ubicado en el punto medio de la línea entre la punta del codo y la axila en el lado interno del codo. Operación: Pinche 1-2 mm recto; (2) No punto de acupuntura 2: Situado en el punto medio entre el epicóndilo medial del húmero y la muñeca del cúbito, en el margen cubital. Operación: Pinche 1-2 mm recto; (3) No punto de acupuntura 3: Ubicado en la intersección del músculo deltoides anterior y el músculo bíceps en la parte interna del brazo. Funcionamiento: Pinchar 1-2 mm recto.
   3. Grupo L-carnitina
      1. Administrar levocarnitina líquida oral por sonda nasogástrica oral a una dosis de 10 mL/kg de peso corporal, una vez al día, durante 28 días consecutivos (Figura 1A).
4. Eutanasia
   1. Después del tratamiento, permitir que todas las ratas ayunen durante 24 h, anestesiarlas mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 2% (40 mg/kg de peso corporal, siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente) y recoger sangre del ápice del corazón utilizando una aguja de extracción de sangre intravenosa desechable^21,24.
   2. Después de la muerte por decapitación, se extirpa un lado del epidídimo para medir la calidad del semen. Extraiga el riñón y los tejidos testiculares, péselos y regístrese, y fíjelos en fijador de paraformaldehído a temperatura ambiente durante 48 h antes de incorporarlos en parafina²⁴.

2. Índices de observación

1. Observación general: Observe el estado mental, la dieta y los movimientos intestinales de las ratas, y controle su peso corporal diariamente.
2. Coeficientes de los órganos: Después de la muerte, retire cuidadosamente la grasa de la superficie y el tejido conectivo de los tejidos renales y testiculares, enjuague con solución salina normal, seque con papel de filtro, pese en una balanza y registre las mediciones para el cálculo de los coeficientes de los órganos. Coeficiente de órgano (%) = (peso del órgano [g] / peso corporal [g]) x 100%.
3. Calidad del semen
   1. Después de eliminar el exceso de grasa, retire y coloque un lado del epidídimo de cada rata en un baño de agua a temperatura constante a 37 °C durante 5 min. Luego, corte, filtre, sople suavemente y mezcle bien la muestra.
   2. Tome una alícuota de 10 μL de la suspensión de esperma diluida y colóquela en el borde del cubreobjetos de una placa de recuento precalentada, permitiendo que la suspensión de esperma penetre automáticamente en la cámara de recuento.
   3. Mida el recuento, la densidad, la tasa de supervivencia y la tasa de motilidad de los espermatozoides utilizando un sistema CASA (análisis de semen asistido por computadora)²¹.
4. Tinción de hematoxilina y eosina (H&E)
   NOTA: Para más detalles sobre el procedimiento, consultar Yang, N. et ^al.21.
   1. Enjuague los tejidos fijados con agua corriente, deshidrítelos e insértelos.
   2. Cortar trozos de parafina (5 μm de grosor) con un micrótomo y hornear a 65 °C durante 4 h.
   3. Desparafina las secciones y rehidrátalas con agua.
   4. Tiñe las secciones con solución de tinción de hematoxilina durante 3 minutos, luego enjuague con agua corriente.
   5. Deshidrate las secciones con etanol al 95% durante 1 min, luego tiña con solución de eosina durante 2 min.
   6. Después de sellar las diapositivas, escanee con un escáner de diapositivas y recopile y analice las imágenes.
5. Ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA)
   NOTA: Para más detalles sobre el procedimiento, consultar Yang, N. et ^al.21.
   1. Para preparar el suero, agregue sustancias patrón y suero de las concentraciones correspondientes a los pocillos de sustancia estándar y pocillos de muestra que se van a medir, seguido de la adición del reactivo marcado con enzimas.
   2. Lleve a cabo los pasos de incubación, lavado, desarrollo de color y terminación.
   3. Determine la absorbancia a una longitud de onda de 450 nm utilizando un instrumento marcado con enzimas y calcule los niveles de expresión de testosterona (T), hormona liberadora de gonadotropina (GnRH), inhibina B (INHB), hormona luteinizante (LH), hormona estimulante del folículo (FSH), estradiol (E2) y prolactina (PRL).

3. Análisis estadístico

1. Analizar los datos experimentales utilizando software estadístico y presentar los resultados de cada grupo como media ± desviación estándar (media ± DE).
2. Utilice el ANOVA de un factor para comparar las medias de las muestras entre varios grupos que cumplen los supuestos de normalidad y homogeneidad de la varianza.
3. Utilice la prueba t para comparaciones entre dos grupos y pruebas no paramétricas para los datos que no cumplen con los supuestos anteriores.
4. Considere las diferencias estadísticamente significativas cuando p < 0,05.

Resultados

Evaluación de modelos

Después de modelar, observe a las ratas en busca de letargo, postura agachada, extremidades frías, renuencia a comer, pérdida de peso, aumento del volumen de orina, heces blandas y otros síntomas, que generalmente se alinean con el síndrome de deficiencia de riñón-yang.

Después de la dise...

Discusión

En la medicina tradicional china, el "riñón" consiste en el "riñón interno", refiriéndose a las funciones del sistema urinario en la medicina moderna, y el "riñón externo", refiriéndose al eje hipotálamo-hipófisis-gonadal y los órganos reproductores anatómicos externos²⁵. Las vesículas seminales masculinas pertenecen al "riñón externo" y sus componentes incluyen los testículos, los epidídimos, las vesículas seminales, etc.²⁶

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine	Beijing Solarbio Science & Technology Co. Ltd.	A8330
CASA computer-assisted semen analysis system	Nanning Songjing Tianlun Biotechnology Co., Ltd.	VICOS-SPERM
Centrifuge	Sartorius	A-14C
Differentiation fluid	Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd	C0163M
Disposable sterile acupuncture needles	Hanyi brand	0.25mm*13mm
Drying machine	Leica	HI1220
Electrical stimulator	Hua Tuo Brand	SDZ-II
Electronic balance	Hangzhou Youheng Weighing Equipment Co., Ltd	HLD-6002
ELISA kit	Shanghai Jianglai Biotechnology Co. LTD	JL13251?JL11473?JL11525?JL12505?JL13256?JL12201
Enzyme-labeled instrument	Rayto	RT-6100
Eosin staining solution	Zhuhai Beso Biotechnology Co. LTD	BA-4024
Hematoxylin staining solution	Zhuhai Beso Biotechnology Co. LTD	BA-4041
Levocarnitine oral liquid	Northeast Pharmaceutical Group Shenyang First Pharmaceutical Co. LTD.	H19990372
Microtome	Leica	RM2255
Neutral balsam	Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd	Zli-9555
Paraffin embedding machine	Leica	HistoCore Arcadia H
SD rat, 8-week-old, Male, 180-220 g	144 Animal Center of Ningxia Medical University
Slide scanner	Leica	Aperio LV1
Vortex oscillator	Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd	QL-902