視床下部-下垂体-精巣軸 を介した ラットの乏疹精子症の治療におけるShu-Mu脳-腎臓ツボのメカニズム

要約

この研究は、ラットの乏疹精子症に対するShu-Mu脳腎臓ツボの治療効果を検証し、視床下部-下垂体-精巣(HPT)軸を通じてその根底にあるメカニズムを探ることを目的としています。

要約

乏疹精子症は、男性不妊の一般的な原因です。視床下部-下垂体-精巣(HPT)軸は、生殖ホルモンの合成と放出を通じて性腺の分化と成熟を調節し、男性の生殖能力に重要な役割を果たします。HPT軸の安定性が乱れると、精子の産生が損なわれ、精液の質が低下します。HPT軸調節に対する電気鍼治療の影響を調査することで、乏疹精子症の治療に関する洞察が得られる可能性があります。50匹の8週齢の雄SDラットを、ブランク群、モデル群、Shu-Mu脳腎臓群、非ツボ群、およびL-カルニチン群に無作為に分けた(n = 10/群)。ブランクグループを除いて、ラットはモデルを確立するために28日間胃内にアデニンを投与されました。モデリング後、Shu-Mu Brain-Kidney グループは指定されたツボで電気鍼治療を受け、非ツボグループは毎日 30 分間偽治療を受けました。L-カルニチン群は、L-カルニチン(10mL/kg)を1日1回胃内に投与されました。治療は28日間続けられました。一般的な状態、臓器係数、および精液の質を評価しました。HE染色は組織形態を分析し、ELISAは血清ホルモンの変化を検出しました。モデル群と比較して、Shu-Mu、脳-腎臓、L-カルニチン群は、体重の増加に伴い、精神、食事、排便に有意な改善を示したが、非ツボ群は有意な変化を示さなかった。腎臓器係数は、Shu-Mu、脳-腎臓、L-カルニチン群で有意に減少しましたが、非ツボ群では変化しませんでした。.精巣臓器係数は、治療群間で有意差を示さなかった。精子の数、密度、生存率、および運動性は、Shu-Mu Brain-Kidney グループと L-カルニチングループで有意に改善しましたが、非ツボグループでは改善しませんでした。H&E染色では、Shu-Mu Brain-Kidney グループと L-カルニチングループで腎臓および精巣組織の損傷が改善したことが示されました。ELISAは、これらのグループでT、GnRH、およびINHBの増加とLH、FSH、E2、およびPRLレベルの減少を明らかにしました(p < 0.001)、非ツボグループでは有意な変化はありませんでした。これらの知見は、Shu-Mu Brain-Kidney ツボ療法が HPT 軸を調節することにより精子の質を改善し、精子減少症の潜在的な治療法を提供することを示しています。

概要

「精子減少症」と「精子減少症」に分けられる精子減少症は、男性不妊症の一般的なタイプの1つであり、男性不妊症の発症率は男性不妊症の約75%を占めています¹。乏疹精子症は、主に精巣の精子密度と運動性の減少を特徴とし、主に精子形成障害、精子数の減少、精子の運動性の低下として臨床的に現れます^2,3。近年、乏児精子症の発生率は年々増加しています⁴.効果的な治療をしなければ、患者の心身の健康、さらには家族の調和にさえ長期的な悪影響を及ぼす^{でしょう5。}遺伝的問題⁶、生殖内分泌障害⁷、泌尿生殖器感染症⁸、化学薬品⁹は、精子の生産と成熟に影響を及ぼし、精液の質を低下させることが研究で示されています。現在、損傷した精子の質を向上させることは、医療現場での課題となっています。

視床下部-下垂体-精巣(HPT)軸は、体内の生殖調節の主要な経路であり、視床下部、下垂体、および精巣に関連する生殖ホルモンの合成と放出を刺激することにより生殖腺の分化と成熟を調節でき、正常な男性の生殖機能を維持する上で重要な役割を果たします¹⁰。.HPT軸機能の安定性が損なわれると、精巣分泌がテストステロンの生理学的濃度に達するのに十分になり、精巣内の精子の数と質が低下する¹¹。したがって、乏血球精子症の治療は、主にHPT軸の機能を調節し、関連する内分泌ホルモンのバランスを維持する目的を達成することを目的としており、それによって精液中の精子の数を増やし、精子の活動を強化し、精液の質を改善します。

乏疹精子症の臨床治療では、現代医学は主に手術や抗酸化薬などの方法を採用し、精子の運動性^{を高めます12,13}、一方、電気鍼治療は伝統的な中国の鍼治療と現代の医療生体電気を組み合わせたものです。それは、迅速かつ正確であること、明らかな治療効果を有すること、副作用がほとんどないこと、適切な疾患の広い範囲、および低い治療費を有すること、および乏血饚精子症^14,15に対する良好な治療効果を有するという利点を有する。「背中は陽、腹部は陰です。」Shu-Muツボの組み合わせは、シュウポイントとムーポイントを組み合わせ、フロントとバックに1つずつ、陰と陽を1つずつ組み合わせ、一緒に働く、フロントバックツボの組み合わせ方法としても知られています。伝統的な中国医学(TCM)は、腎臓が出生前の本質の根源であり、病気は腎臓にあると信じています。腎臓のフロントムーポイントであるJingmen(GB25)とBack-shuポイントであるShenshu(BL23)が選択され、腎臓を温め、陽を助け、陰^16,17内で陽を求める効果があります。腎臓はエッセンスを貯蔵し、骨髄の生産を支配し、脳は骨髄の海であり、すべての陽の出会いの場であり、Taixi(KI3)は足のShaoyin腎臓経絡の源点であり、肝臓と腎臓を調節および緊張させ、陰に栄養を与え、骨髄^{を生成することができます18}。Epangsanxian(MS4)と組み合わせることで、TCM¹⁹の「Shu-Mu脳-腎臓ツボの組み合わせ」のアイデアを反映して、腎臓と脳をつなぎ、治療効果は通常の鍼治療よりも明白です。

精液の質に関する現在の治療研究は、主に精巣の構造と機能の改善に焦点を当てていますが、視床下部-下垂体-精巣(HPT)軸²⁰のさまざまな組織にわたる血清ホルモンレベルの調節に関する研究は限られています。予備研究では、RNAシーケンシング(RNA-Seq)を使用して、健康なラットとアデニン誘発性乏精子症モデルラットの視床下部、下垂体、および精巣組織内の精液質調節に関与する候補遺伝子と調節経路を特定しました²¹。さらに、精液質検査と精巣組織の組織学的分析が両方のグループで行われました。これらの知見は、アデニン誘発性乏醒菌ラットの精液質の根底にある分子メカニズムに関する洞察をもたらしました。遠方近似ツボを用いた電気鍼治療は、HPT軸を調節することにより、乏靭精子症ラットの精子の質を改善する可能性があり、その効果は酸化ストレスのプロセスに関連しています²²。しかし、Shu-Mu Brain-Kidney ツボがHPT軸を調節することにより、ラットの精液の質を改善できるかどうかは不明です。この研究では、乏血麩子症ラットの精液質を改善する調節メカニズムと効果的な治療法をさらに調査するために、アデニン誘発ラットモデルである乏血症のアデニン誘発ラットモデルを使用し、Epangsanxian、Shenshu、Jingmen、Taixiの4つのツボを選択して、ラットのオリゴアステノスペルミアに対するShu-Mu Brain-Kidney Pickpointの治療効果の関連メカニズムをHPT軸の観点から調査しました。 臨床治療のためのより科学的な基盤を提供します。

プロトコル

すべての動物実験は、寧夏医科大学の動物倫理委員会(承認番号:IACUC-NYLAC-2021-130)によって審査され、承認されました。この研究は、動物実験に関するARRIVEガイドライン2.0に厳密に従って実施され、NIHの実験動物のケアと使用に関するガイドに記載されている動物福祉の原則を遵守しました。このランダム化比較動物試験は、一元配置分散分析を採用し、2023年3月から5月にかけて寧夏医科大学の動物実験センターで実施されました。この研究では、体重180〜220gの8週齢のSPFグレードの雄SDラットを使用しました。使用した試薬や機器の詳細は 、資料表に記載されています。

1. 動物モデルの構築と治療手順

1. 実験動物・団体
   1. 体重180〜220gの8週齢のSPFグレードの雄SDラットを50匹入手します。
   2. すべてのラットを標準的な条件下で飼育し、室温を22〜25°C、湿度を50%〜60%に保ち、標準的なげっ歯類の飼料と水に無料でアクセスできるようにします。
   3. 適応の1週間後、乱数表法を使用して、ラットを空白(B )グループ(n = 10)とモデリンググループ(n = 40)にランダムに分けます。経口強制経口投与により、ブランク群に生理食塩水を投与し、モデリング群にアデニンを投与します。
   4. 28日後、モデリンググループをモデル(M)グループ、Shu-Mu脳腎臓(S)グループ、非ツボ(N)グループ、およびL-カルニチン(L)グループ(n = 1グループあたり10)にランダムに分けます。モデル・グループは未処理のままにします。
      1. Shu-Mu Brain-Kidney ツボマッチング法を使用して電気鍼治療介入を Shu-Mu Brain-Kidney グループに適用します。非ツボ群には非ツボ治療を、L-カルニチン群には強制経口投与します。すべてのグループを28日間連続して治療します。
2. モデル構築
   注:研究によると、高用量のアデニンはラットの精巣機能に影響を及ぼし、性ホルモンの異常な分泌、HPT軸の機能安定性の乱れ、および精子の質の低下につながることが示されています²³。したがって、アデニンは一般的に雄動物の不妊モデルを確立するために使用されます。
   1. 正常生理食塩水(1 mL / 100 g体重)をブランクグループに投与し、アデニン(20 mg / 100 g体重)をモデルグループに経口強制経口投与します(図1A)。.
   2. アデニンの沈殿と強制針の閉塞を防ぐために、強制経口投与中の連続的な攪拌を確保してください。治療は28日間毎日1回行われます。
3. 1.3 治療手順
   1. Shu-Mu Brain-Kidney グループ
      1. モデリング後の最初の日から介入を開始します。両側のポイントに使い捨ての滅菌鍼を使用して鍼治療を行います。ラットを固定した後、鍼治療部位を露出させて消毒します。
      2. 左手で経穴部位の皮膚を固定し、右手の使い捨て滅菌鍼で経穴をすばやく突き刺します。電気刺激装置を接続します。電気鍼治療の周波数2Hz、刺激強度1.5mA、局所筋肉のわずかな振戦で拡張波を適用します。
      3. 電気鍼治療を1日1回、30分間、連続して28日間行います(図1B)。
         注:Yong Tangの Experimental Acupuncture and Moxibustion Science、付録II、「実験動物で一般的に使用される経穴」を参照し、比較解剖学的ポイント選択法¹⁹と組み合わせて、ラットの経穴を選択します。次のポイントが選択されました:(1)Epangsanxian(MS4):Touweiポイントの下3mmと4mm外側にあります。操作:まっすぐに1-2 mmを刺します。(2)神舟(BL23):脊椎領域、第2腰椎の下部棘突起の両側、正中背線の6mm横にあります。操作:6mmストレートに刺します。(3)Jingmen(GB25):サイドウエスト、下側の13番目のリブの自由端にあります。操作:まっすぐに1-2 mmを刺します。(4)Taixi(KI3):足の内側、内側足首の高い点とアキレス腱の後縁の間のくぼみにあります。操作:3mmストレートに刺します。
   2. 非ツボグループ
      1. 経穴1、2、および3は、Shu-Mu Brain-Kidney グループと同じ方法で選択して操作します (図 1B)。
         注:非ツボは経絡に沿ったポイント選択の原則に従っていないため、および伝統的な中国医学(TCM)理論と長期臨床観察によれば、これら3つのツボは精子減少症の患者にほとんど治療効果がありません²⁴。(1)非ツボ1:肘の肘の先端と脇の下を結ぶ線の中間点、肘の内側に位置するもの。操作:まっすぐに1-2 mmを刺します。(2)非ツボ2:上腕骨の内側上顆と尺骨の手首の中点、尺骨縁にあります。操作:まっすぐに1-2 mmを刺します。(3)非ツボ3:内側の腕の三角筋前筋と上腕二頭筋の交点に位置する。操作:1〜2mmまっすぐ刺します。
   3. L-カルニチン基
      1. レボカルニチン経口液を経口強制経口投与し、1日1回、1日1回、28日間連続して投与します(図1A)。.
4. 安楽死
   1. 治療後、すべてのラットを24時間絶食させ、2%ペントバルビタールナトリウム(40mg / kg体重、施設的に承認されたプロトコルに従う)の腹腔内注射によって麻酔をかけ、使い捨ての静脈内採血針^21,24を使用して心臓の頂点から血液を採取します。
   2. 斬首による死後、精巣上体の片側を切除して精液の質を測定します。腎臓組織と精巣組織を採取し、秤量して記録し、パラホルムアルデヒド固定液に室温で48時間固定してから、パラフィン²⁴に埋め込みます。

2. 観測指標

1. 一般的な観察:ラットの精神状態、食事、排便を観察し、毎日体重を監視します。
2. 臓器係数:死後、腎臓組織と精巣組織の両方から表面脂肪と結合組織を慎重に取り除き、生理食塩水ですすぎ、濾紙で乾燥させ、天秤にかけ、臓器係数の計算のための測定値を記録します。臓器係数(%)=(臓器重量[g]/体重[g])×100%。
3. 精液の品質
   1. 余分な脂肪を取り除いた後、各ラットの精巣上体の片側を取り出して、37°Cの恒温水浴に5分間置きます。次に、サンプルを切断し、ろ過し、穏やかに吹き付け、よく混合します。
   2. 希釈した精子懸濁液の10μLアリコートを取り、予熱した計数プレートのカバーガラスの端に落とすと、精子懸濁液が自動的に計数チャンバーに浸透します。
   3. CASA(コンピュータ支援精液分析)システム²¹を使用して、精子数、密度、生存率、および運動性率を測定する。
4. ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色
   注:手順の詳細については、Yang, N. et ^al.21を参照してください。
   1. 固定したティッシュを流水ですすぎ、脱水して埋め込みます。
   2. パラフィン切片(厚さ5 μm)をミクロトームで切片し、65°Cで4時間焼きます。
   3. 切片を脱ろうし、水で再水和します。
   4. 切片をヘマトキシリン染色溶液で3分間染色し、流水ですすいでください。
   5. 切片を95%エタノールで1分間脱水し、次にエオシン溶液で2分間染色します。
   6. スライドをシールした後、スライドスキャナーでスキャンを行い、画像を収集して解析します。
5. 酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)
   注:手順の詳細については、Yang, N. et ^al.21を参照してください。
   1. 血清を調製するには、標準物質ウェルおよび測定サンプルウェルに標準物質および対応する濃度の血清を添加し、続いて酵素標識試薬を添加します。
   2. インキュベーション、洗浄、発色、および終了のステップを実行します。
   3. 酵素標識装置を使用して450nmの波長での吸光度を決定し、テストステロン(T)、ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)、インヒビンB(INHB)、黄体形成ホルモン(LH)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、エストラジオール(E2)、およびプロラクチン(PRL)の発現レベルを計算します。

3. 統計分析

1. 統計ソフトウェアを使用して実験データを分析し、各グループの結果を平均±標準偏差(平均±SD)として提示します。
2. 一元配置分散分析を使用して、正規性と分散の等質性の仮定を満たす複数のグループ間でサンプル平均を比較します。
3. t検定は2つのグループ間の比較に使用し、ノンパラメトリック検定は上記の仮定を満たさないデータに使用します。
4. pが0.05の場合<統計的に有意な差を考慮します。

結果

モデル評価

モデリング後、ラットを観察して、無気力、しゃがんだ姿勢、手足の冷え、食べるのをためらう、体重減少、尿量の増加、軟便、および腎臓陽欠損の症候群と一般的に一致するその他の症状について観察します。

解剖後、腎臓...

ディスカッション

TCMでは、「腎臓」は、現代医学における泌尿器系の機能を指す「内腎臓」と、視床下部-下垂体-性腺軸および解剖学的外部生殖器官を指す「外腎臓」から構成される²⁵。雄の精嚢は「外腎臓」に属し、その成分には精巣、精巣上体、精嚢などが含まれます²⁶。TCMはエッセンスを人体の物質的基盤と考えており、「腎臓エッセンス」に...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine	Beijing Solarbio Science & Technology Co. Ltd.	A8330
CASA computer-assisted semen analysis system	Nanning Songjing Tianlun Biotechnology Co., Ltd.	VICOS-SPERM
Centrifuge	Sartorius	A-14C
Differentiation fluid	Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd	C0163M
Disposable sterile acupuncture needles	Hanyi brand	0.25mm*13mm
Drying machine	Leica	HI1220
Electrical stimulator	Hua Tuo Brand	SDZ-II
Electronic balance	Hangzhou Youheng Weighing Equipment Co., Ltd	HLD-6002
ELISA kit	Shanghai Jianglai Biotechnology Co. LTD	JL13251?JL11473?JL11525?JL12505?JL13256?JL12201
Enzyme-labeled instrument	Rayto	RT-6100
Eosin staining solution	Zhuhai Beso Biotechnology Co. LTD	BA-4024
Hematoxylin staining solution	Zhuhai Beso Biotechnology Co. LTD	BA-4041
Levocarnitine oral liquid	Northeast Pharmaceutical Group Shenyang First Pharmaceutical Co. LTD.	H19990372
Microtome	Leica	RM2255
Neutral balsam	Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd	Zli-9555
Paraffin embedding machine	Leica	HistoCore Arcadia H
SD rat, 8-week-old, Male, 180-220 g	144 Animal Center of Ningxia Medical University
Slide scanner	Leica	Aperio LV1
Vortex oscillator	Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd	QL-902