מנגנון של נקודת דיקור מוח-כליה Shu-Mu בטיפול באוליגואסטנוספרמיה בחולדות דרך ציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-אשך

Summary

מחקר זה נועד לאמת את ההשפעה הטיפולית של נקודת הדיקור Shu-Mu Brain-Kidney על אוליגואסטנוספרמיה בחולדות ולחקור את המנגנון הבסיסי שלה דרך ציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-אשך (HPT).

Abstract

אוליגואסטנוספרמיה היא גורם שכיח לאי פוריות גברית. ציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-אשך (HPT) מווסת את ההתמיינות וההתבגרות של בלוטות המין באמצעות סינתזה ושחרור של הורמוני הרבייה, וממלא תפקיד חיוני בפוריות הגבר. שיבוש יציבות ציר ה-HPT פוגע בייצור הזרע, ומפחית את איכות הזרע. חקירת השפעת הדיקור האלקטרו-סיני על ויסות ציר ה-HPT עשויה לספק תובנות לטיפול באוליגואסתנוספרמיה. חמישים חולדות SD זכרות בנות 8 שבועות חולקו באופן אקראי לקבוצות ריקות, מודל, Shu-Mu מוח-כליה, ללא דיקור ו-L-קרניטין (n = 10 לקבוצה). מלבד הקבוצה הריקה, החולדות קיבלו אדנין תוך קיבה למשך 28 יום כדי לבסס את המודל. לאחר המודל, קבוצת המוח-כליה של שו-מו עברה דיקור חשמלי בנקודות דיקור ייעודיות, בעוד שהקבוצה ללא נקודת דיקור קיבלה טיפול דמה במשך 30 דקות ביום. הקבוצה שקיבלה L-קרניטין קיבלה L-קרניטין (10 מ"ל/ק"ג) דרך הקיבה פעם ביום. הטיפולים נמשכו 28 יום. הוערכו תנאים כלליים, מקדמי איברים ואיכות הזרע. צביעת HE ניתחה מורפולוגיה של רקמות, ו-ELISA זיהתה שינויים בהורמונים בסרום. בהשוואה לקבוצת המודל, הקבוצות Shu-Mu Brain-Kidney ו-L-carnitine הדגימו שיפור משמעותי ברוח, בתזונה וביציאות, עם עלייה במשקל הגוף, בעוד שהקבוצה ללא נקודת דיקור לא הראתה שינוי משמעותי. מקדמי איברי הכליה ירדו באופן משמעותי בקבוצות Shu-Mu Brain-Kidney ו-L-carnitine אך נותרו ללא שינוי בקבוצה ללא נקודת דיקור. מקדמי איברי האשכים לא הראו הבדלים משמעותיים בין קבוצות הטיפול. ספירת הזרע, הצפיפות, ההישרדות ושיעורי התנועתיות השתפרו באופן משמעותי בקבוצות Shu-Mu Brain-Kidney ו-L-carnitine, אך לא בקבוצה ללא נקודת דיקור. צביעת H&E הראתה נזק משופר לכליות ולרקמות האשכים בקבוצות Shu-Mu Brain-Kidney ו-L-carnitine. ELISA חשפה עלייה ברמות T, GnRH ו-INHB וירידה ברמות LH, FSH, E2 ו-PRL בקבוצות אלה (p < 0.001), ללא שינויים משמעותיים בקבוצה ללא נקודת דיקור. ממצאים אלה מצביעים על כך שטיפול בנקודת דיקור מוח-כליה של Shu-Mu משפר את איכות הזרע על ידי ויסות ציר ה-HPT, ומציע טיפול פוטנציאלי לאוליגואסטנוספרמיה.

Introduction

אוליגואסטנוספרמיה, המחולקת ל"אוליגוספרמיה" ו"אסתנוספרמיה", היא אחד הסוגים הנפוצים של אי פוריות גברית, עם שיעור היארעות המהווה כ-75% ממקרי אי פוריות הגבר¹. אוליגואסטנוספרמיה מאופיינת בעיקר בירידה בצפיפות הזרע ובתנועתיות באשכים ומתבטאת בעיקר קלינית כהפרעת זרע, ספירת זרע מופחתת ותנועתיות זרע נמוכה ^2,3. בשנים האחרונות, שכיחות האוליגואסתנוספרמיה עלתה משנה לשנה⁴. ללא טיפול יעיל, יהיו לכך השפעות שליליות ארוכות טווח על בריאותם הפיזית והנפשית של המטופלים ואפילו על ההרמוניה המשפחתית⁵. מחקרים הראו שבעיות גנטיות⁶, הפרעות אנדוקריניות רבייה⁷, דלקות בדרכי השתן⁸ ותרופות כימיות⁹ יכולות להשפיע על ייצור הזרע והבשלתו, מה שמוביל לירידה באיכות הזרע. כיום, שיפור איכות הזרע הפגום הפך לבעיה מאתגרת בתחום הרפואי.

ציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-אשך (HPT) הוא המסלול העיקרי של ויסות הרבייה בגוף, שיכול לווסת את ההתמיינות וההתבגרות של בלוטות המין על ידי גירוי הסינתזה והשחרור של הורמוני רבייה הקשורים להיפותלמוס, בלוטת יותרת המוח והאשכים, וממלא תפקיד חשוב בשמירה על תפקוד רבייה תקין של גברים¹⁰. אם היציבות של תפקוד ציר ה-HPT מופרעת, זה יגרום להפרשת האשכים להיות לא מספיקה כדי להגיע לריכוז הפיזיולוגי של טסטוסטרון, וכתוצאה מכך ירידה במספר ובאיכות הזרע באשך¹¹. לכן, הטיפול באוליגואסטנוספרמיה נועד בעיקר לווסת את תפקוד ציר ה-HPT ולהשיג את המטרה של שמירה על איזון ההורמונים האנדוקריניים הקשורים, ובכך להגדיל את מספר הזרע בזרע, לשפר את פעילות הזרע ולשפר את איכות הזרע.

בטיפול הקליני באוליגואסתנוספרמיה, הרפואה המודרנית מאמצת בעיקר שיטות כמו ניתוחים ותרופות נוגדות חמצון ומשפרות את תנועתיות הזרע^12,13, בעוד שטיפול באלקטרו-אקופונקטורה משלב דיקור סיני מסורתי וביו-חשמל רפואי מודרני. יש לו את היתרונות של היותו מהיר ומדויק, בעל השפעה מרפא ברורה, בעל מעט תגובות שליליות, מגוון רחב של מחלות מתאימות ועלות טיפול נמוכה, ובעל השפעה טיפולית טובה על אוליגואסטנוספרמיה^14,15. "הגב הוא יאנג, והבטן היא יין". שילוב נקודות הדיקור של שו-מו משלב את נקודות השו עם נקודות המו, אחת מלפנים ואחת מאחור, יין אחד ויאנג אחד, בעבודה יחד, הידועה גם בשם שיטת שילוב נקודות הדיקור הקדמי-אחורי. הרפואה הסינית המסורתית מאמינה כי הכליה היא שורש המהות הטרום לידתית, והמחלה ממוקמת בכליה. הנקודה הקדמית-מו של הכליה, ג'ינגמן (GB25), ונקודת ה-Back-shu, Shenshu (BL23), נבחרות, שיש לה השפעה של חימום הכליה, סיוע ליאנג וחיפוש יאנג בתוך יין^16,17; הכליה אוגרת את המהות ושולטת בייצור מח העצם, המוח הוא ים המח ומקום המפגש של כל היאנג, וטאישי (KI3) היא נקודת המקור של מרידיאן הכליות של כף הרגל, שיכול לווסת ולחזק את הכבד והכליות, להזין יין ולייצר מח עצם¹⁸. בשילוב עם Epangsanxian (MS4), הוא מחבר בין הכליה למוח, ומשקף את הרעיון של "שילוב דיקור מוח-כליה של שו-מו" ברפואה הסינית המסורתית¹⁹, וההשפעה הטיפולית ברורה יותר מזו של דיקור רגיל.

מחקרי הטיפול הנוכחיים על איכות הזרע מתמקדים בעיקר בשיפור מבנה ותפקוד האשכים, בעוד שמחקר מוגבל נערך על ויסות רמות ההורמונים בסרום ברקמות שונות של ציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-אשך (HPT)²⁰. במחקר ראשוני, ריצוף RNA (RNA-Seq) שימש לזיהוי גנים מועמדים ומסלולי ויסות המעורבים בוויסות איכות הזרע ברקמות ההיפותלמוס, יותרת המוח והאשכים של חולדות בריאות וחולדות מודל אוליגוזוספרמיה הנגרמות על ידי אדנין²¹. בנוסף, בוצעו בדיקות איכות זרע וניתוח היסטולוגי של רקמות האשכים בשתי הקבוצות. ממצאים אלה סיפקו תובנות לגבי המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס איכות הזרע בחולדות אוליגואסטנוספרמיה הנגרמות על ידי אדנין. טיפול בדיקור אלקטרו-סיני עם נקודת דיקור רחוקה-מקורבת יכול לשפר את איכות הזרע בחולדות אוליגואסטנוספרמיה על ידי ויסות ציר ה-HPT, וההשפעה קשורה לתהליך של מתח חמצוני²². עם זאת, לא ידוע אם נקודת הדיקור Shu-Mu Brain-Kidney יכולה לשפר את איכות הזרע של חולדות על ידי ויסות ציר ה-HPT. כדי לחקור עוד יותר את המנגנון הרגולטורי של שיפור איכות הזרע בחולדות אוליגואסטנוספרמיה ושיטות טיפול יעילות, מחקר זה השתמש במודל חולדות המושרה על ידי אדנין של אוליגואסטנוספרמיה ובחר ארבע נקודות דיקור, Epangsanxian, Shenshu, Jingmen ו-Taixi, כדי לחקור את המנגנון הקשור להשפעה הטיפולית של נקודת דיקור מוח-כליה של Shu-Mu על אוליגואסטנוספרמיה בחולדות מההיבט של ציר ה-HPT, מתן בסיס מדעי יותר לטיפול קליני.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית נינגשיה (מספר אישור: IACUC-NYLAC-2021-130). המחקר בוצע בהתאם להנחיות ARRIVE 2.0 לניסויים בבעלי חיים ודבק בעקרונות רווחת בעלי החיים המתוארים במדריך ה-NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. מחקר אקראי מבוקר זה בבעלי חיים השתמש בניתוח חד כיווני של שונות ונערך במרכז הניסויים בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית נינגשיה ממרץ עד מאי 2023. למחקר זה נעשה שימוש בחולדות SD זכרות בדרגת SPF במשקל 180-220 גרם. פרטי הריאגנטים והציוד המשמשים מפורטים בטבלת החומרים.

1. הקמת מודלים של בעלי חיים ונהלי טיפול

1. חיות ניסוי וקבוצות
   1. השג חמישים חולדות SD זכרות בנות 8 שבועות בדרגת SPF במשקל 180-220 גרם.
   2. מאכלסים את כל החולדות בתנאים סטנדרטיים, שומרים על טמפרטורת חדר של 22-25 מעלות צלזיוס, לחות של 50%-60%, ומספקים גישה חופשית להזנת מכרסמים ומים סטנדרטיים.
   3. לאחר שבוע אחד של הסתגלות, חלקו את החולדות באופן אקראי לקבוצה ריקה (B) (n = 10) ולקבוצת מידול (n = 40) באמצעות שיטת טבלת מספרים אקראית. תן מי מלח רגילים לקבוצה הריקה ואדנין לקבוצת הדוגמנות על ידי גבאז' דרך הפה.
   4. לאחר 28 ימים, חלקו באופן אקראי את קבוצת המודלים לקבוצת מודל (M), קבוצת Shu-Mu מוח-כליה (S), קבוצה ללא נקודת דיקור (N) וקבוצת L-קרניטין (L) (n = 10 לקבוצה). השאירו את קבוצת המודל ללא טיפול.
      1. ליישם התערבות בדיקור אלקטרו-סיני בשיטת התאמת נקודת דיקור מוח-כליה Shu-Mu לקבוצת Shu-Mu מוח-כליה. מתן טיפול ללא נקודת דיקור לקבוצה ללא נקודת דיקור ונוזל אוראלי L-קרניטין על ידי הגדלה לקבוצת L-קרניטין. טפלו בכל הקבוצות ברציפות במשך 28 יום.
2. בניית דגם
   הערה: מחקרים הראו כי מינונים גבוהים של אדנין יכולים להשפיע על תפקוד האשכים בחולדות, מה שמוביל להפרשה לא תקינה של הורמוני מין, הפרעה ביציבות התפקודית של ציר ה-HPT וירידה באיכות הזרע²³. לכן, אדנין משמש בדרך כלל לביסוס מודלים של אי פוריות של בעלי חיים זכרים.
   1. מתן תמיסת מלח רגילה (1 מ"ל/100 גרם משקל גוף) לקבוצה הריקה ואדנין (20 מ"ג/100 גרם משקל גוף) לקבוצת המודל על ידי גבאז' דרך הפה (איור 1A).
   2. הקפידו על תסיסה מתמשכת במהלך הגאווג' כדי למנוע משקעי אדנין וחסימה של מחט הגאווג'. יש לתת את הטיפול פעם ביום למשך 28 יום.
3. 1.3 הליך טיפול
   1. קבוצת Shu-Mu מוח-כליה
      1. התחל התערבות ביום הראשון לאחר הדוגמנות. בצע דיקור סיני עם מחטי דיקור סטריליות חד פעמיות בנקודות דו-צדדיות. לאחר תיקון החולדה, יש לחשוף ולחטא את אתר הדיקור.
      2. תקן את העור של אתר הדיקור ביד שמאל ונקב במהירות את נקודת הדיקור עם מחט הדיקור הסטרילית החד פעמית ביד ימין. חבר ממריץ חשמלי. החל גלים מתרחבים בתדר דיקור חשמלי של 2 הרץ, עוצמת גירוי של 1.5 mA ורעד קל של השריר המקומי.
      3. בצעו טיפול בדיקור חשמלי במשך 30 דקות בכל פעם, פעם ביום, במשך 28 ימים רצופים (איור 1B).
         הערה: בחר נקודות דיקור בחולדות תוך התייחסות למדע הדיקור הניסיוני והמוקסה של יונג טאנג, נספח II, "נקודות דיקור נפוצות בחיות ניסוי", בשילוב עם שיטת בחירת נקודות אנטומיות השוואתית¹⁹. נבחרו הנקודות הבאות: (1) Epangsanxian (MS4): ממוקם 3 מ"מ מתחת ו-4 מ"מ מחוץ לנקודת Touwei. פעולה: דקירה 1-2 מ"מ ישר; (2) Shenshu (BL23): ממוקם באזור עמוד השדרה, משני צידי התהליך הקוצני התחתון של החוליה המותנית השנייה, 6 מ"מ ליד קו הגב החציוני. פעולה: דקירה 6 מ"מ ישר; (3) ג'ינגמן (GB25): ממוקם על המותניים הצדדיות, בקצה החופשי של הצלע ה-13 בצד התחתון. פעולה: דקירה 1-2 מ"מ ישר; (4) Taixi (KI3): ממוקם בצד הפנימי של כף הרגל, בשקע בין הנקודה הגבוהה של הקרסול המדיאלי לקצה האחורי של גיד אכילס. פעולה: דקירה 3 מ"מ ישר.
   2. קבוצה ללא דיקור
      1. בחרו והפעילו נקודות דיקור 1, 2 ו-3 באותו אופן כמו קבוצת המוח-כליה של שו-מו (איור 1B).
         הערה: מכיוון שנקודות הדיקור אינן עוקבות אחר העיקרון של בחירת נקודות לאורך המרידיאנים, ועל פי תיאוריית הרפואה הסינית המסורתית (TCM) ותצפית קלינית ארוכת טווח, לשלוש נקודות הדיקור הללו יש השפעה טיפולית מועטה על חולים עם אוליגואסטנוזוספרמיה²⁴. (1) ללא נקודת דיקור 1: ממוקם בנקודת האמצע של הקו בין קצה המרפק לבית השחי בצד הפנימי של המרפק. פעולה: דקירה 1-2 מ"מ ישר; (2) שאינו דיקור 2: ממוקם בנקודת האמצע בין האפיקונדיל המדיאלי של עצם הזרוע לשורש כף היד של האולנה, בשוליים האולנרים. פעולה: דקירה 1-2 מ"מ ישר; (3) ללא נקודת דיקור 3: ממוקם בצומת של שריר הדלתא הקדמי ושריר הזרוע הדו-ראשי בזרוע הפנימית. פעולה: דקירה 1-2 מ"מ ישר.
   3. קבוצת L-קרניטין
      1. מתן נוזל פומי לבוקרניטין דרך הפה במינון של 10 מ"ל/ק"ג משקל גוף, פעם ביום, במשך 28 ימים רצופים (איור 1A).
4. המתת חסד
   1. לאחר הטיפול, אפשר לכל החולדות לצום במשך 24 שעות, להרדים אותן על ידי הזרקה תוך-צפקית של 2% נתרן פנטוברביטל (40 מ"ג/ק"ג משקל גוף, בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד), ולאסוף דם מקודקוד הלב באמצעות מחט חד פעמית לאיסוף דם תוך ורידי^21,24.
   2. לאחר המוות בעריפת ראש, הסר צד אחד של האפידידימיס כדי למדוד את איכות הזרע. קצרו את רקמות הכליה והאשכים, שקלו ורשמו אותם, וקבעו אותם בקיבוע פרפורמלדהיד בטמפרטורת החדר למשך 48 שעות לפני הטמעתם בפרפין²⁴.

2. מדדי תצפית

1. התבוננות כללית: התבוננו במצב הנפשי, בתזונה וביציאות של החולדות, ועקבו אחר משקל גופן מדי יום.
2. מקדמי איברים: לאחר המוות, הסר בזהירות את השומן פני השטח ורקמת החיבור הן מרקמות הכליה והן מרקמות האשכים, שטוף במי מלח רגילים, יבש בנייר פילטר, שקל על איזון ורשום את המדידות לחישוב מקדמי האיברים. מקדם איברים (%) = (משקל איבר [g] / משקל גוף [g]) x 100%.
3. איכות זרע
   1. לאחר הסרת עודפי שומן, הסר והניח צד אחד של האפידידימיס מכל חולדה באמבט מים בטמפרטורה קבועה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לאחר מכן, חותכים, מסננים, נושפים בעדינות ומערבבים היטב את הדגימה.
   2. קח מנה של 10 מיקרוליטר מתרחיף הזרע המדולל והפיל אותו על קצה זכוכית הכיסוי של לוחית ספירה מחוממת מראש, מה שמאפשר לתרחיף הזרע לחלחל אוטומטית לתוך תא הספירה.
   3. מדוד את ספירת הזרע, הצפיפות, שיעור ההישרדות ושיעור התנועתיות באמצעות מערכת CASA (ניתוח זרע בעזרת מחשב)²¹.
4. צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E)
   הערה: לפרטים על ההליך, עיין ב-Yang, N. et ^al.21.
   1. שוטפים את הרקמות הקבועות במים זורמים, מייבשים ומטמיעים אותן.
   2. חותכים חתיכות פרפין (בעובי 5 מיקרומטר) בעזרת מיקרוטום ואופים בחום של 65 מעלות למשך 4 שעות.
   3. הסירו שעווה מהחלקים והחזירו להם לחות במים.
   4. מכתימים את החלקים בתמיסת מכתים המטוקסילין למשך 3 דקות, ואז שוטפים במים זורמים.
   5. ייבשו את החלקים עם 95% אתנול למשך דקה, ואז הכתמו בתמיסת אאוזין למשך 2 דקות.
   6. לאחר איטום השקופיות, בצע סריקה באמצעות סורק שקופיות, ואסוף ונתח את התמונות.
5. בדיקת אימונוסורבנט מקושרת לאנזים (ELISA)
   הערה: לפרטים על ההליך, עיין ב-Yang, N. et ^al.21.
   1. להכנת הסרום, הוסף חומרים סטנדרטיים וסרום בריכוזים המתאימים לבארות החומרים הסטנדרטיות ולבארות הדגימה שיש למדוד, ולאחר מכן הוספת המגיב המסומן באנזים.
   2. בצע שלבי דגירה, כביסה, פיתוח צבע וסיום.
   3. קבע את הספיגה באורך גל של 450 ננומטר באמצעות מכשיר המסומן באנזים, וחשב את רמות הביטוי של טסטוסטרון (T), הורמון משחרר גונדוטרופין (GnRH), אינהיבין B (INHB), הורמון לוטניזציה (LH), הורמון מגרה זקיק (FSH), אסטרדיול (E2) ופרולקטין (PRL).

3. ניתוח סטטיסטי

1. לנתח את נתוני הניסוי באמצעות תוכנות סטטיסטיות, ולהציג את התוצאות של כל קבוצה כממוצע ± סטיית תקן (ממוצע ± SD).
2. השתמש ב-ANOVA חד-כיווני כדי להשוות ממוצעי מדגם בין מספר קבוצות העומדות בהנחות הנורמליות וההומוגניות של השונות.
3. השתמש במבחן t להשוואה בין שתי קבוצות, ובמבחנים לא פרמטריים לנתונים שאינם עומדים בהנחות לעיל.
4. קחו בחשבון הבדלים מובהקים סטטיסטית כאשר p < 0.05.

תוצאות

הערכת מודל

לאחר הדוגמנות, התבונן בחולדות לעייפות, יציבה כפופה, גפיים קרות, חוסר רצון לאכול, ירידה במשקל, נפח שתן מוגבר, צואה רכה ותסמינים אחרים, אשר בדרך כלל מתיישבים עם תסמונת מחסור בכליות-יאנג.

Discussion

ברפואה הסינית המסורתית, ה"כליה" מורכבת מ"הכליה הפנימית", המתייחסת לתפקודי מערכת השתן ברפואה המודרנית, ו"הכליה החיצונית", המתייחסת לציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-בלוטת המין ואיברי הרבייה החיצוניים האנטומיים²⁵. שלפוחיות הזרע הזכריות שייכות ל"כליה החיצונית", ומרכיב...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine	Beijing Solarbio Science & Technology Co. Ltd.	A8330
CASA computer-assisted semen analysis system	Nanning Songjing Tianlun Biotechnology Co., Ltd.	VICOS-SPERM
Centrifuge	Sartorius	A-14C
Differentiation fluid	Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd	C0163M
Disposable sterile acupuncture needles	Hanyi brand	0.25mm*13mm
Drying machine	Leica	HI1220
Electrical stimulator	Hua Tuo Brand	SDZ-II
Electronic balance	Hangzhou Youheng Weighing Equipment Co., Ltd	HLD-6002
ELISA kit	Shanghai Jianglai Biotechnology Co. LTD	JL13251?JL11473?JL11525?JL12505?JL13256?JL12201
Enzyme-labeled instrument	Rayto	RT-6100
Eosin staining solution	Zhuhai Beso Biotechnology Co. LTD	BA-4024
Hematoxylin staining solution	Zhuhai Beso Biotechnology Co. LTD	BA-4041
Levocarnitine oral liquid	Northeast Pharmaceutical Group Shenyang First Pharmaceutical Co. LTD.	H19990372
Microtome	Leica	RM2255
Neutral balsam	Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd	Zli-9555
Paraffin embedding machine	Leica	HistoCore Arcadia H
SD rat, 8-week-old, Male, 180-220 g	144 Animal Center of Ningxia Medical University
Slide scanner	Leica	Aperio LV1
Vortex oscillator	Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd	QL-902