激光辅助慢病毒基因传递到小鼠受精卵

这是一种替代且易于使用的方法，通过激光穿孔的佐纳佩普伦西达和扁病毒基因传递，将感兴趣的基因传递到受精小鼠卵子。小鼠供体程序的激光辅助穿孔也适用于其他物种的受精卵，以便利其他类型的病毒或转染试剂的进入。这项技术的主要优点是，它不需要专门的技能，为受精小鼠卵子的微操作和微注射。

展示受精小鼠卵子分离程序将是佩奇迈尔斯，一个研究科学家从比较医学分支在NIEHS。交配后16至24小时，根据标准协议，将卵巢和卵巢与阴道塞的雌性小鼠分离。收集所有组织后，将每个卵巢的安培分开，释放受精卵，周围是积木细胞，将细胞转移到一个35毫米的培养皿中，在新鲜的M2培养基中含有一个x hyaluronidase，在室温下孵育3至5分钟。

移液几个次的鸡蛋释放的细胞，并转移鸡蛋到一个新的35毫米的菜含有M2培养，用移液洗掉酶。接下来，将洗净的鸡蛋转移到一个35毫米的盘中，含有钾，简单优化的介质，或KSOM，和移液器洗掉剩余的M2介质和透明酶。然后，将鸡蛋转移到35毫米组织培养处理板，用50微升的KSOM和两毫升二甲基二氧化硅烷的种子在37摄氏度、5%的二氧化碳和氧气以及90%的氮气下平衡两小时。

当鸡蛋在孵化器中时，根据制造商的建议，设置并校准XYClone激光器。当卵子准备好时，将第一个滴盘放在激光显微镜阶段，然后手动聚焦佐纳佩鲁西达。在确认激光 LED 光通过目标可见后，移动显微镜阶段以 LED 激光瞄准 Zona，并使用计算机软件将 XYClone 激光设置为 250 微秒。

将 LED 灯尺寸调整到适当的尺寸，用激光打孔三次，产生三个 10 微米的孔。快速进行穿孔至关重要，但请小心，因为受精卵不能保持在孵化器之外超过 15 分钟。然后，将穿孔的鸡蛋返回孵化器再两个小时。

在第二次孵育结束时，用两个微升浓缩扁家病毒的微升处理50微升KSOM滴，无需混合。把鸡蛋还到孵化器四天。当卵子发育成胚胎时，使用非手术胚胎移植装置，将大约10-15个胚胎沉积在大约两个微升的KSOM中。

胚胎移植后17天，允许怀孕小鼠自然分娩或必要时通过剖腹产收集新生儿。然后，从幼崽中收集组织进行基因分型，以确定转生成率。隔离和转导小鼠受精卵的发展可以每天在显微镜下检查。

60-70%的健康、未经治疗的胚胎在三到四天内发育成胚胎。虽然大约47%的激光穿孔，转导胚胎发展成胚子，其中85%表示转导的基因感兴趣。瞄准激光变薄的佐纳，而不是创造一个洞，使发育中的胚胎受益于一个完好无损的，封装的佐纳佩鲁西达，同时保持宽松的扁病毒转导。

与重组的扁病毒的转导，从伸长因子1A促进剂表达应付GFP诱导多个扁病毒整合，在蓝色LED灯下GFP的高表达。在尝试此程序时，重要的是要记住，虽然扁病毒整合到宿主基因组的能力使它们成为稳定基因传递的有力工具，但随机整合也可能引入插入性突变。这项技术可以使遗传学领域的研究人员迅速开发转基因动物模型，用于研究体内蛋白质生产或功能基因研究的疾病。

按照这个程序，其他方法，如免疫组织化学可以执行从转导幼崽的分离组织样本，以回答有关位置和基因表达在各种感兴趣的组织的程度的其他问题。不要忘记，使用扁病毒可能是极其危险的。因此，请遵循您的机构指南，使用扁病毒。

在处置前，请穿个人防护服，净化所有废物。