Questo è un metodo alternativo e facile da usare per fornire geni di interesse alle uova di topo fecondate tramite perforazione laser della zona pellucida e consegna del gene lentivirale. La perforazione assistita da laser della procedura del donatore di topi può essere applicabile anche alle uova fecondate di altre specie per facilitare l'ingresso di altri tipi di virus o reagenti di trasfezione. Il principale vantaggio di questa tecnica è che non richiede competenze specializzate per la micromanipolazione e la micro iniezione delle uova di topo fecondate.
A dimostrare la procedura di isolamento delle uova di topo fecondato sarà Page Myers, una ricercatrice della filiale di Medicina Comparata del NIEHS. Da 16 a 24 ore dopo l'accoppiamento, isolare le ovaie e gli ovadotti da topi femmine con spine vaginali, secondo protocolli standard. Quando tutti i tessuti sono stati raccolti, strappare l'ampolla di ogni ovaia e rilasciare le uova fecondate, circondate da cellule cumulate, e trasferire le uova in cellule cumulate in un piatto di 35 millimetri contenente una x ialuronidasi in mezzo M2 fresco, per un'incubazione da tre a cinque minuti a temperatura ambiente.
Pipettare le uova alcune volte per rilasciare le cellule cumule e trasferire le uova in un nuovo piatto da 35 millimetri contenente mezzo M2, con pipettazione per lavare via l'enzima. Successivamente, trasferire le uova lavate in un piatto da 35 millimetri contenente mezzo ottimizzato simplex di potassio, o KSOM, e pipetta per lavare via il mezzo M2 rimanente e l'ialuronidasi. Quindi, trasferire le uova in piastre trattate con coltura tissutale di 35 millimetri sementi con 50 microlitri di KSOM e due millilitri di dimetilpolisiloxano per un equilibrazione di due ore a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e ossigeno e 90% azoto.
Mentre le uova sono nell'incubatrice, impostare e calibrare il laser XYClone, secondo le raccomandazioni del produttore. Quando le uova sono pronte, posizionare la prima piastra di caduta sullo stadio del microscopio laser e mettere a fuoco manualmente la zona pellucida. Dopo aver confermato che la luce led laser è visibile attraverso l'obiettivo, spostare lo stadio del microscopio per colpire la zona con il laser a LED e utilizzare il software del computer per impostare il laser XYClone su 250 microsecondi.
Regolare le dimensioni della luce a LED in base alle dimensioni appropriate e perforare la zona pellucida di ogni uovo tre volte con il laser per produrre tre fori da 10 micrometri. È fondamentale eseguire rapidamente la perforazione, ma con attenzione, poiché le uova fecondate non possono tenere al di fuori dell'incubatrice per più di 15 minuti. Quindi, restituire le uova perforate all'incubatrice per altre due ore.
Al termine della seconda incubazione, trattare la goccia KSOM da 50 microlitri con due microlitri di lentivirus concentrato senza miscelazione. E riportare le uova nell'incubatrice per quattro giorni. Quando le uova si sono sviluppate in blastocisti, utilizzare un dispositivo di trasferimento dell'embrione non chirurgico, per depositare circa 10-15 embrioni in circa due microlitri di KSOM.
17 giorni dopo il trasferimento dell'embrione, consentire al topo incinta di partorire naturalmente o raccogliere i neonati per sezione cesarea se necessario. Quindi, raccogliere il tessuto dai cuccioli per il genotipizzazione, per determinare il tasso di transgenesi. Lo sviluppo isolato e trasdotto di uova fecondate con topo può essere controllato al microscopio ogni giorno.
Dal 60 al 70% degli embrioni sani e non trattati si trasformano in blastocsti entro tre o quattro giorni. Mentre circa il 47% degli embrioni trasdotti perforati al laser si sviluppa in blastocsti, l'85% dei quali esprime il gene trasdotto di interesse. Puntare il laser a assottigliare la zona, invece di creare un foro, permette agli embrioni in via di sviluppo di beneficiare di una zona pellucida intatta e incapsulante pur rimanendo permissiva alla trasduzione lentivirale.
La trasduzione con un lentivirus ricombinante, che esprime il copepode GFP da un fattore di allungamento 1A promoter induce molteplici integrazioni lentivirali e un'alta espressione di GFP sotto una lampada a LED blu. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che, mentre la capacità dei lentivirus di integrarsi nel genoma ospite li rende un potente strumento per il parto genico stabile, ma l'integrazione casuale può anche introdurre mutazioni inserizionali. Questa tecnica potrebbe consentire ai ricercatori nel campo della genetica di sviluppare rapidamente modelli animali transgenici per lo studio delle malattie per la produzione di proteine in vivo o per studi genici funzionali.
Seguendo questa procedura, altri metodi come l'immunoistochimica possono essere eseguiti su campioni di tessuto isolati da cuccioli trasdotti per rispondere a domande aggiuntive sulla posizione e l'estensione dell'espressione genica in vari tessuti di interesse. Non dimenticare che lavorare con i lentivirus può essere estremamente pericoloso. Pertanto, si prega di seguire le linee guida istituzionali per lavorare con i lentivirus.
Indossare indumenti protettivi personali e decontaminare tutti i rifiuti prima dello smaltimento.
