一种新型的尼古丁酰胺二丁二核苷酸校正方法，用于在活细胞中使用Fura-2-模拟进行细胞内Ca²⁺测量

UV兴奋复数探头，由于自动复数声音，具有固有的信号污染。NADH 的主要问题是限制复数探头的使用。一种方法，可以精确地从NADH的外荧光，以提取一个真正的，未污染的复数探头信号。

演示这个程序的将是我实验室的研究助理教授李俊俊。在允许菌分泌到管底后，吸进上清液。用两毫升新鲜准备的一毫升毛茸茸-2-FFAM稀释溶液在4摄氏度下为细胞贴上60分钟的标签。

在孵育结束时，将管子放在37摄氏度的水浴中，在直立位置放置30分钟，然后取出上经器。然后加入四毫升的室温培养介质，在室温下储存。对于原位是肥胖的毛茸茸-2-ffa点识别将稀释的细胞安装到显微镜阶段，并等待三分钟，让细胞沉入底部。

将无 NADH 无钙溶液移植到细胞培养中并定位目标细胞。使用无 NADH 无钙溶液再使用皂素溶液 60 秒。同时测量 450 和 500 纳米的 fura-2-ff 发射信号，使用 350 到 365 纳米的激励扫描，步长为 0.1 纳米，并使用无 NADH 无钙溶液进行再 prof。

接下来从无钙条件下的信号中减去钙饱和溶液中的信号。然后计算每个激发时发射的标准偏差，并选择显示最小标准差值作为单个肥胖点的激励波长。要使用多参数测量系统来检测背景信号并纠正细胞区域内的信号，请将无染料细胞安装在显微镜浴中，并允许细胞沉淀三分钟。

将 NADH 无钙溶液以每分钟两到三毫升的速度放入浴缸中约五分钟，并设置对象场以覆盖目标细胞。将单元格移动到字段后，测量无单元格窗口的背景信号，并设置信号为偏移。然后将单元格返回到初始位置并测量单元格背景信号和单元格区域。

要计算 R 因子，请使用获得的细胞背景和面积信号，然后再将无染料细胞重新安装到显微镜上，并使用无钙溶液进行补充。在用麦芽溶液使细胞悬浮液扩散之前，测量指示的信号。测量信号后，用丙酮酸盐溶液大量测量细胞，然后用麦芽酸-丙酮溶液和罗泰诺溶液大量注入。

然后计算每个信号的斜率。这里显示纠正之前和之后线粒体钙的变化。结果清楚地显示线粒体钙的显著变化，线粒体休息钙浓度没有细胞酸钙1.03加或减0.13微摩尔和最大线粒体钙在一微摩尔钙29.6加或负1.61微摩尔。

线粒体跨膜电位监测与两个纳米摩尔TMR的大量监测。线粒体电位的变化是根据假定的初始线粒体膜电位为负150毫伏计算出来的，表明NADH对钙添加的反应减少，对线粒体膜电位有不可忽略的影响。线粒体pHH没有受到碳氧SNARF-1负荷引起的线粒体钙增加的影响。

不正确的是肥胖点会导致不正确的 R 和 NADH 校正。因此，请注意始终正确测量无细胞背景和单元格区域。该技术用于在生物分析溢出中准备线粒体钙动态研究。