УФ возбудимые множественные зонды, имеют присущее сигнальное загрязнение, из-за автоматического множественного числа звуков. Большая часть проблемы с NADH, ограничивает использование множественного числа зонда. Метод может быть использован, чтобы точно исправить внешнюю флуоресценцию от NADH, для того, чтобы извлечь истинный, незагрязненый сигнал множественного числа зонда.
Демонстрацией процедуры будет Чон Хун Ли, наш доцент из моей лаборатории. После того, как миоциты оседают на дне трубки, аспирируют супернатант. Этикетка клеток с двумя миллилитров свежеприготовленных один миллимолярный фура-2-FFAM разбавления раствора в течение 60 минут при четырех градусах по Цельсию.
В конце инкубации поместите трубку в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 30 минут в вертикальном положении, прежде чем удалить супернатант. Затем добавьте четыре миллилитров среды культуры комнатной температуры для хранения при комнатной температуре. Ибо на месте isobestic фура-2-ffa точки идентификации горе разбавленных клеток на стадии микроскопа и ждать три минуты для клеток, чтобы опуститься на дно.
Профанный NADH-бесплатный 37 градусов по Цельсию без кальция раствор в клеточной культуре и найти целевую клетку. Профанный раствор сапонина в течение 60 секунд, прежде чем повторно профанать с NADH-бесплатный раствор без кальция. Одновременно измеряйте сигналы фуры-2-ff на 450 и 500 нанометров, используя возбудительный скан от 350 до 365 нанометров с шагом 0,1 нанометров и повторно обитая с раствором без кальция NADH.
Далее вычесть сигналы в растворе кальция насыщенных от сигналов в условиях, свободных от кальция. Затем вычислите стандартные отклонения излучения при каждом возбуждении и выберите длину волны возбуждения, показывающую минимальные стандартные значения отклонения в качестве отдельных точек изобестики. Чтобы использовать многопамарометрическую систему измерения для обнаружения фонового сигнала и коррекции сигнала в области клетки, монтировать клетки без красителя в ванне микроскопа и позволить клеткам осесть в течение трех минут.
Профанный раствор NADH без кальция в ванну в течение примерно пяти минут со скоростью от двух до трех миллилитров в минуту и установить объект поле для покрытия целевой клетки. После перемещения ячейки из поля измеряют фоновые сигналы свободного от ячейки окна и устанавливают сигналы в качестве смещений. Затем верните ячейку в исходное положение и измерьте фоновые сигналы клетки и область клетки.
Для расчета R-фактора используйте приобретенные клеточные фоновые и областные сигналы перед перемонтированием клеток, свободных от красителей, на микроскоп и изобилием раствором без кальция. Измерьте сигналы, как указано, прежде чем обитать клеточной подвески с раствором малата. После измерения сигналов обильно клетки с пируватным раствором следуют изобилие с раствором малат-пируват и раствором ротенона.
Затем вычислите наклон для каждого сигнала. Здесь показаны изменения митохондриального кальция до и после коррекции. Результаты ясно показывают существенные изменения в митохондриальном кальции с митохондриальной концентрацией кальция отдыха без цитозолового кальция 1.03 плюс или минус 0.13 микромолара и максимального митохондриального кальция на одном микромоле кальция 29.6 плюс или минус 1.61 микромолара.
Митохондриальный трансмембранный потенциал отслеживался с использованием двух наномоларов TMRE. Изменение митохондриального потенциала было рассчитано на основе предполагаемого первоначального митохондриального мембранного потенциала в минус 150 милливольт, демонстрируя снижение NADH в ответ на добавление кальция, с неопоясным воздействием на митохондриальный мембранный потенциал. Митохондиральный рН не был вызван увеличением митохондриального кальция, вызванного нагрузкой carboxy SNARF-1.
Неправильные изобетические точки приводят к неправильной коррекции R и NADH. Так что позаботьтесь, чтобы всегда правильно измерить безклеточный фон и область клетки. Этот метод используется для подготовленных митохондриальных динамических исследований кальция в биоаналитических разливов.
