Sondas plurales excitables UV, tienen una contaminación de señal inherente, debido a los sonidos auto-plurales. La mayor parte del problema con NADH, está limitando el uso de una sonda plural. Se puede utilizar un método para corregir con precisión la florescencia externa de NADH, con el fin de extraer una señal de sonda plural verdadera y no contaminada.
Demostrando el procedimiento estará Jeong Hoon Lee, nuestro profesor asistente de investigación de mi laboratorio. Después de permitir que los miocitos se asienten en el fondo del tubo, aspirar el sobrenadante. Etiquete las células con dos mililitros de solución diluyente de fura-2-FFAM recién preparada durante 60 minutos a cuatro grados centígrados.
Al final de la incubación, coloque el tubo en un baño de agua Celsius de 37 grados durante 30 minutos en posición vertical antes de retirar el sobrenadante. A continuación, agregue cuatro mililitros de medio de cultivo de temperatura ambiente para almacenar a temperatura ambiente. Para la identificación de punto fura-2-ffa isobestico in situ monte las células diluidas en la etapa del microscopio y espere tres minutos a que las células se hundan hasta el fondo.
Profuse nadH-libre de NADH 37 grados Celsius solución libre de calcio en el cultivo celular y localizar una célula de destino. Profuse la solución de saponina durante 60 segundos antes de volver a profusar con la solución sin calcio sin NADH. Mida simultáneamente las señales emitidas fura-2-ff a 450 y 500 nanómetros, utilizando un escaneo de excitación de 350 a 365 nanómetros con un paso de 0,1 nanómetros y re-profuso con solución libre de calcio sin NADH.
A continuación resta las señales de la solución saturada de calcio de las señales en las condiciones libres de calcio. A continuación, calcule las desviaciones estándar de la emisión en cada excitación y seleccione la longitud de onda de excitación que muestra los valores mínimos de desviación estándar como puntos isobesticos individuales. Para utilizar un sistema de medición multiparamétrico para detectar la señal de fondo y corregir la señal dentro del área celular, monte células libres de tinte en el baño del microscopio y permita que las células se asienten durante tres minutos.
Profusa la solución sin calcio NADH en el baño durante unos cinco minutos a una velocidad de dos a tres mililitros por minuto y establezca el campo de objeto para cubrir la célula objetivo. Después de mover la celda fuera del campo, mida las señales de fondo de la ventana libre de celdas y establezca las señales como desplazamientos. Luego devuelva la celda a la posición inicial y mida las señales de fondo de la celda y el área de la celda.
Para calcular el factor R, utilice las señales de fondo y área de la célula adquirida antes de volver a montar las células libres de tinte en el microscopio y profusar con una solución libre de calcio. Mida las señales como se indica antes de profusar la suspensión celular con solución de malato. Después de medir las señales profusa las células con solución de piruvato seguida de profusión con solución de malate-piruvato y solución de rotenona.
A continuación, calcule la pendiente de cada señal. Aquí se muestran los cambios en el calcio mitocondrial antes y después de la corrección. Los resultados revelan claramente cambios sustanciales en el calcio mitocondrial con una concentración de calcio en reposo mitocondrial sin calcio citosolólico de 1,03 más o menos 0,13 micromolares y calcio mitocondrial máximo a un micromolar de calcio de 29,6 más o menos 1,61 micromolares.
El potencial de la transmembrana mitocondrial fue monitoreado con una profusión de dos nanomolares TMRE. El cambio en el potencial mitocondrial se calculó sobre la base de un potencial de membrana mitocondrial inicial supuesto de menos 150 milivoltios, lo que demuestra una disminución de la NADH en respuesta a la adición de calcio, con un efecto negliable sobre el potencial de la membrana mitocondrial. El pH mitocondiral no se vio por el aumento del calcio mitocondrial inducido por la carga de carboxy SNARF-1.
Los puntos isobesticos incorrectos dan lugar a una corrección incorrecta de R y NADH. Así que tenga cuidado de medir siempre correctamente el fondo libre de celdas y el área de la celda. Esta técnica se utiliza para preparar estudios dinámicos de calcio mitocondrial en los derrames bioanalíticos.
