UV-erregbare Pluralsonden haben aufgrund der Auto-Plural-Sounds eine inhärente Signalkontamination. Das meiste Problem mit NADH, ist die Begrenzung der Verwendung einer Pluralsonde. Es kann eine Methode verwendet werden, um die äußere Blütenstand von NADH genau zu korrigieren, um ein echtes, nicht kontaminiertes Plural-Sondensignal zu extrahieren.
Demonstriert wird das Verfahren von Jeong Hoon Lee, unserem wissenschaftlichen Assistenzprofessor aus meinem Labor. Nachdem Sie die Myozyten an der Unterseite der Röhre absetzen lassen, aspirieren Sie den Überstand. Beschriften Sie die Zellen mit zwei Millilitern frisch zubereiteter Millimolar-Fura-2-FFAM-Verdünnungslösung für 60 Minuten bei vier Grad Celsius.
Am Ende der Inkubation, legen Sie die Röhre in einem 37 Grad Celsius Wasserbad für 30 Minuten in der aufrechten Position, bevor Sie den Überstand entfernen. Dann fügen Sie vier Milliliter Raumtemperatur Kulturmedium für die Lagerung bei Raumtemperatur. Denn in situ isobestic fura-2-ffa Punkt-Identifikation montieren die verdünnten Zellen auf die Mikroskop-Bühne und warten drei Minuten, bis die Zellen auf den Boden sinken.
NADH-freie 37 Grad Celsius kalziumfreie Lösung in die Zellkultur einfließen lassen und eine Zielzelle lokalisieren. Eine profuse Saponin-Lösung für 60 Sekunden vor dem Wiederauflösen mit der NADH-freien calciumfreien Lösung. Messen Sie gleichzeitig die fura-2-ff emittierten Signale bei 450 und 500 Nanometern, wobei ein Anregungsscan von 350 bis 365 Nanometern mit einem 0,1 Nanometer-Schritt verwendet und mit NADH-freier Calcium-freier Lösung wieder aufgefroren wird.
Als nächstes subtrahieren Sie die Signale in der kalziumgesättigten Lösung von den Signalen in den kalziumfreien Bedingungen. Berechnen Sie dann die Standardabweichungen der Emission bei jeder Anregung und wählen Sie die Anregungswellenlänge aus, die die minimalen Standardabweichungswerte als einzelne isobestische Punkte anzeigt. Um ein multiparametrisches Messsystem zu verwenden, um das Hintergrundsignal zu erkennen und das Signal im Zellbereich zu korrigieren, montieren Sie farbfreie Zellen im Mikroskopbad und lassen Sie die Zellen sich für drei Minuten absetzen.
NADH-Calciumfreie Lösung für etwa fünf Minuten bei einer Rate von zwei bis drei Millilitern pro Minute ins Bad bringen und das Objektfeld so einstellen, dass es die Zielzelle abdeckt. Nach dem Verschieben der Zelle aus dem Feld messen Sie die Hintergrundsignale des zellfreien Fensters und stellen Sie die Signale als Offsets ein. Kehren Sie dann die Zelle an die Ausgangsposition zurück und messen Sie die Zellhintergrundsignale und den Zellbereich.
Um den R-Faktor zu berechnen, verwenden Sie den erfassten Zellhintergrund und die Flächensignale, bevor Sie die farbfreien Zellen wieder auf das Mikroskop montieren und mit kalziumfreier Lösung beschneiden. Messen Sie die Signale wie angegeben, bevor Sie die Zellsuspension mit Malatlösung entweiht. Nach der Messung der Signale überaus die Zellen mit Pyruvat-Lösung gefolgt von Überfluss mit Malat-Pyruvat-Lösung und Roton-Lösung.
Berechnen Sie dann die Steigung für jedes Signal. Hier werden die Veränderungen des mitochondrialen Kalziums vor und nach der Korrektur angezeigt. Die Ergebnisse zeigen deutlich wesentliche Veränderungen des mitochondrialen Kalziums mit einer mitochondrialen ruhenden Calciumkonzentration ohne zytosolisches Calcium von 1,03 plus oder minus 0,13 Mikromolar und maximales mitochondriales Kalzium bei einem Mikromolaren Calcium von 29,6 plus oder minus 1,61 Mikromolar.
Das mitochondriale Transmembranpotential wurde mit einer Fülle von zwei Nanomolaren TMRE überwacht. Die Veränderung des mitochondrialen Potentials wurde auf der Grundlage eines angenommenen anfänglichen mitochondrialen Membranpotentials von minus 150 Millivolt berechnet, was eine Abnahme der NADH als Reaktion auf Kalziumzugabe zeigt, mit einer negierbaren Wirkung auf das mitochondriale Membranpotenzial. Der mitochondirale pH-Wert wurde nicht durch die Erhöhung des durch carboxy SNARF-1-Belastung induzierten mitochondrialen Kalziums bewirkt.
Falsche isobestische Punkte führen zu einer falschen R- und NADH-Korrektur. Achten Sie also darauf, den zellfreien Hintergrund und den Zellbereich immer richtig zu messen. Diese Technik wird verwendet, um mitochondriale Kalzium-Dynamische Studien in den bioanalytischen Verschüttungen vorzubereiten.
