UV uyarılabilir çoğul problar, otomatik çoğul sesler nedeniyle, doğal bir sinyal kontaminasyonu var. NADH ile ilgili sorunun çoğu, çoğul bir sonda kullanımını sınırlamaktır. Bir yöntem, nadh gelen dış floresantam düzeltmek için kullanılabilir, gerçek, kirlenmemiş çoğul prob sinyali ayıklamak için.
Prosedürü gösteren jeong Hoon Lee, laboratuvarımdaki araştırma yardımcı doçenti olacak. Miyositlerin tüpün dibine yerleşmelerine izin vererek, süpernatantı aspire edin. Hücreleri iki mililitre taze hazırlanmış bir milimolar fura-2-FFAM seyreltme çözeltisi ile etiketleyin.
Kuluçka sonunda, supernatant çıkarmadan önce dik pozisyonda 30 dakika boyunca 37 derece santigrat su banyosu tüp yerleştirin. Sonra oda sıcaklığında depolamak için oda sıcaklığında kültür orta dört mililitre ekleyin. In situ isobestic fura-2-ffa noktası tanımlama için mikroskop aşamasına seyreltilmiş hücreleri monte ve hücrelerin dibe batmak için üç dakika bekleyin.
Nadh içermeyen 37 santigrat derece kalsiyumsuz çözeltihücre kültürüne bol ve bir hedef hücre bulmak. NADH içermeyen kalsiyumiçermeyen solüsyon ile yeniden profusing önce 60 saniye boyunca saponin çözeltisi bol. Aynı anda fura-2-ff yayılan sinyalleri 450 ve 500 nanometre olarak ölçün, 0,1 nanometre adım la 350 ila 365 nanometre arasında bir uyarma taramayı ve NADH içermeyen kalsiyumsuz çözeltiile yeniden bolca kullanın.
Daha sonra kalsiyumsuz koşullarda sinyallerden kalsiyum doymuş çözeltisi sinyalleri çıkarın. Daha sonra her uyarmada emisyonun standart sapmalarını hesaplayın ve tek tek isobestik noktalar olarak minimum standart sapma değerlerini gösteren uyarma dalga boyu seçin. Arka plan sinyalini tespit etmek ve hücre alanı içindeki sinyali düzeltmek için çok parametrik bir ölçüm sistemi kullanmak için, mikroskop banyosuna boyasız hücreler monte edin ve hücrelerin üç dakika lığına yerleşmesini bekleyin.
Nadh kalsiyumsuz çözeltiyi dakikada 2-3 mililitre hızla yaklaşık beş dakika boyunca banyoya verin ve nesne alanını hedeflenen hücreyi kapsayacak şekilde ayarlayın. Hücreyi alan dışına çıkardıktan sonra hücreserbest penceresinin arka plan sinyallerini ölçün ve sinyalleri uzaklık olarak ayarlayın. Sonra hücreyi ilk konuma döndürün ve hücre arka plan sinyallerini ve hücre alanını ölçün.
R-faktörünü hesaplamak için, boyaiçermeyen hücreleri mikroskoba yeniden monte etmeden ve kalsiyumsuz çözelti ile kullanmadan önce edinilmiş hücre arka planını ve alan sinyallerini kullanın. Masat çözeltisi ile hücre süspansiyonu profusing önce belirtildiği gibi sinyalleri ölçün. Sinyalleri ölçtükten sonra pirüvat çözeltisi ile hücreleri bol ve ardından malate-pirüuvat çözeltisi ve rotenone çözeltisi ile profüzyon.
Daha sonra her sinyal için eğimi hesaplayın. Burada düzeltme öncesi ve sonrası mitokondriyal kalsiyum değişiklikleri gösterilir. Sonuçlar, mitokondriyal kalsiyumda 1.03 artı veya eksi 0.13 mikromolar ve maksimum mitokondriyal kalsiyum ile mitokondriyal kalsiyum konsantrasyonunda önemli değişiklikler olduğunu açıkça ortaya koymaktadır.
Mitokondriyal transmembran potansiyeli iki nanomolar TMRE profüzyonu ile izlendi. Mitokondriyal potansiyeldeki değişim eksi 150 milivoltluk ilk mitokondriyal membran potansiyeline göre hesaplandı ve kalsiyum eklenmesine yanıt olarak NADH'da bir azalma gösterdi ve mitokondriyal membran potansiyeli üzerinde ihmal edilebilir bir etki gösterdi. Mitokondiral pH karboksi SNARF-1 yükleme ile indüklenen mitokondriyal kalsiyum artışı ndan etkilenmedi.
Yanlış isobestic noktaları yanlış R ve NADH düzeltme sayılsa neden olabilir. Bu nedenle, hücre içermeyen arka planı ve hücre alanını her zaman doğru bir şekilde ölçmeye özen tin.0k.000.000.000.000.000.000.000.0 Bu teknik biyoanalitik dökülmelerde mitokondriyal kalsiyum dinamik çalışmalarının hazırlanmasında kullanılır.
