Le sonde plurali eccitabili UV, hanno una contaminazione intrinseca del segnale, a causa dei suoni auto-plurali. La maggior parte del problema con il NADH, è limitare l'uso di una sonda plurale. Un metodo può essere usato, per correggere con precisione la florescenza esterna dal NADH, al fine di estrarre un vero segnale di sonda plurale incontaminato.
A dimostrare la procedura sarà Jeong Hoon Lee, il nostro assistente di ricerca del mio laboratorio. Dopo aver permesso ai miociti di depositarsi sul fondo del tubo, aspirare il supernatante. Etichettare le cellule con due millilitri di una soluzione diluizione millimolare fura-2-FFAM preparata al momento per 60 minuti a quattro gradi Celsius.
Alla fine dell'incubazione, posizionare il tubo in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 30 minuti in posizione verticale prima di rimuovere il supernatante. Quindi aggiungere quattro millilitri di mezzo di coltura a temperatura ambiente per lo stoccaggio a temperatura ambiente. Per l'identificazione isobestica in situ del punto fura-2-ffa montare le cellule diluite sullo stadio del microscopio e attendere tre minuti affinché le cellule sprofondno sul fondo.
Abbondante soluzione priva di NADH di 37 gradi Celsius priva di calcio nella coltura cellulare e individuare una cellula bersaglio. Abbondante soluzione di saponina per 60 secondi prima di riprosaciare con la soluzione priva di calcio senza NADH. Misurare contemporaneamente i segnali emessi da fura-2-ff a 450 e 500 nanometri, utilizzando una scansione di eccitazione da 350 a 365 nanometri con un passo di 0,1 nanometri e ri-profusi con una soluzione priva di calcio senza NADH.
Quindi sottrarre i segnali nella soluzione satura di calcio dai segnali nelle condizioni libere dal calcio. Quindi calcolare le deviazioni standard dell'emissione ad ogni eccitazione e selezionare la lunghezza d'onda di eccitazione che mostra i valori minimi di deviazione standard come singoli punti isobestici. Per utilizzare un sistema di misurazione multi-parametrico per rilevare il segnale di fondo e correggere il segnale all'interno dell'area cellulare, montare le cellule senza coloranti nel bagno del microscopio e consentire alle cellule di depositarsi per tre minuti.
Abbondante soluzione priva di calcio NADH nel bagno per circa cinque minuti a una velocità da due a tre millilitri al minuto e impostare il campo dell'oggetto per coprire la cellula mirata. Dopo aver spostare la cella fuori dal campo, misurare i segnali di fondo della finestra senza celle e impostare i segnali come offset. Quindi riportare la cella nella posizione iniziale e misurare i segnali di sfondo della cella e l'area della cella.
Per calcolare il fattore R utilizzare lo sfondo cellulare acquisito e i segnali di area prima di rimontare le cellule senza coloranti al microscopio e profuse con soluzione priva di calcio. Misurare i segnali come indicato prima di abbondante la sospensione cellulare con soluzione malato. Dopo aver misurato i segnali profuse le cellule con soluzione piruvata seguita da profusione con soluzione malato-piruvato e soluzione di rotenone.
Quindi calcolare la pendenza per ogni segnale. Qui vengono mostrati i cambiamenti nel calcio mitocondriale prima e dopo la correzione. I risultati rivelano chiaramente cambiamenti sostanziali nel calcio mitocondriale con una concentrazione di calcio a riposo mitocondriale senza calcio citosolico di 1,03 più o meno 0,13 micromolare e calcio mitocondriale massimo ad un micromolare di calcio di 29,6 più o meno 1,61 micromolare.
Il potenziale transmembrana mitocondriale è stato monitorato con una profusione di due nanomolari TMRE. La variazione del potenziale mitocondriale è stata calcolata sulla base di un presunto potenziale iniziale di membrana mitocondriale di meno 150 millivolt, dimostrando una diminuzione del NADH in risposta all'aggiunta di calcio, con un effetto negliabile sul potenziale della membrana mitocondriale. Il pH mitocondriale non è stato fatto dall'aumento del calcio mitocondriale indotto dal carico carbossi SNARF-1.
Punti isobestici errati ducono una correzione R e NADH errata. Quindi fai attenzione a misurare sempre correttamente lo sfondo e l'area cellulare senza cellule. Questa tecnica viene utilizzata per preparare studi dinamici mitocondriali sul calcio nelle fuoriuscite bioanalitiche.
