Les sondes plurielles excitables UV, ont une contamination inhérente au signal, en raison des sons auto-pluriels. La plupart du problème avec NADH, est de limiter l’utilisation d’une sonde plurielle. Une méthode peut être utilisée, pour corriger avec précision la florescence externe du NADH, afin d’extraire un véritable signal de sonde pluriel non contaminé.
Jeong Hoon Lee, notre professeur adjoint de recherche de mon laboratoire, démontrera la procédure. Après avoir permis aux myocytes de s’installer au fond du tube, aspirer le surnatant. Étiquetez les cellules avec deux millilitres de solution de dilution diluante fura-2-FFAM fraîchement préparée pendant 60 minutes à quatre degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, placer le tube dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 30 minutes en position verticale avant d’enlever le supernatant. Ajouter ensuite quatre millilitres de milieu de culture de température ambiante pour le stockage à température ambiante. Pour in situ isobestic fura-2-ffa point d’identification monter les cellules diluées sur le stade du microscope et attendre trois minutes pour les cellules de couler vers le fond.
Profuse NADH-libre de 37 degrés Celsius solution sans calcium dans la culture cellulaire et de localiser une cellule cible. Profuse solution saponine pendant 60 secondes avant de ré-profusing avec la solution sans calcium SANS NADH. Mesurez simultanément les signaux émis fura-2-ff à 450 et 500 nanomètres, à l’aide d’un balayage d’excitation de 350 à 365 nanomètres avec une étape de 0,1 nanomètre et ré-profuse avec nadh-libre solution sans calcium.
Ensuite, soustrayez les signaux dans la solution saturée de calcium des signaux dans les conditions sans calcium. Calculez ensuite les écarts types de l’émission à chaque excitation et sélectionnez la longueur d’onde d’excitation montrant les valeurs minimales d’écart type en tant que points isobestic individuels. Pour utiliser un système de mesure multi-paramétrique pour détecter le signal d’arrière-plan et pour corriger le signal dans la zone cellulaire, monter des cellules sans colorant dans le bain microscope et permettre aux cellules de se contenter de trois minutes.
Profuse NADH solution sans calcium dans le bain pendant environ cinq minutes à une vitesse de deux à trois millilitres par minute et mettre le champ d’objet pour couvrir la cellule ciblée. Après avoir sorti la cellule du champ, mesurez les signaux de fond de la fenêtre sans cellule et réglez les signaux comme des décalages. Retournez ensuite la cellule à la position initiale et mesurez les signaux de fond cellulaire et la zone cellulaire.
Pour calculer le facteur R, utilisez le fond cellulaire acquis et les signaux de zone avant de remonter les cellules sans colorant sur le microscope et de profuser avec une solution sans calcium. Mesurez les signaux comme indiqué avant de profuser la suspension cellulaire avec une solution malate. Après avoir mesuré les signaux profuse les cellules avec la solution pyruvate suivie de profusion avec la solution malate-pyruvate et la solution de rotenone.
Calculez ensuite la pente pour chaque signal. Ici, les changements dans le calcium mitochondrial avant et après la correction sont montrés. Les résultats indiquent clairement des changements substantiels dans le calcium mitochondrial avec une concentration mitochondrique de calcium de repos sans calcium cytosolic de 1.03 plus ou moins 0.13 micromolar et calcium mitochondrique maximum à un micromolaire de calcium de 29.6 plus ou moins 1.61 micromolar.
Le potentiel transmembrane mitochondrial a été surveillé avec une profusion de deux nanomolaires TMRE. Le changement dans le potentiel mitochondrial a été calculé basé sur un potentiel initial supposé de membrane mitochondrique de moins 150 millivolts, démontrant une diminution de NADH en réponse à l’addition de calcium, avec un effet négligeable sur le potentiel mitochondrique de membrane. Le pH mitochondiral n’a pas été réalisé par l’augmentation du calcium mitochondrial induite par la charge carboxy SNARF-1.
Des points isobestiques incorrects entraînent une correction incorrecte de R et de NADH. Prenez donc soin de toujours mesurer correctement le fond sans cellule et la zone cellulaire. Cette technique est utilisée pour préparer des études dynamiques mitochondriques sur le calcium dans les déversements bioanalytiques.
