라이브 셀에서 Fura-2-Analog를 이용한 세포내 Ca²⁺ 측정을 위한 새로운 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 보정 방법

UV 흥분성 복수 프로브는 자동 복수음으로 인해 고유 신호 오염을 가지게 된다. NADH의 대부분의 문제점은 복수 프로브의 사용을 제한하고 있다. NADH로부터의 외부 플로레시브를 정밀하게 교정하여, 오염되지 않은 다원 탐사 신호를 추출하기 위해 방법을 사용할 수 있다.

그 절차를 시연하는 것은 제 실험실에서 연구조교수인 이정훈 교수입니다. 심근세포가 튜브 의 바닥에 정착 할 수 있도록 한 후, 슈퍼 나탄을 흡인. 갓 준비된 밀리머 1밀리머 fura-2-FFAM 희석 용액을 섭씨 4도에서 60분간 2밀리리터로 셀에 라벨을 붙입니다.

인큐베이션이 끝나면, 수퍼를 제거하기 전에 37도 의 수조에 튜브를 똑바로 세워 30 분 동안 배치하십시오. 그런 다음 실온에서 보관할 수 있는 실온 배양 배지 4밀리리터를 추가합니다. 시투 동위 상층포라-2-ffa 포인트 식별을 위해 희석된 세포를 현미경 단계에 장착하고 세포가 바닥으로 가라앉을 때까지 3분을 기다린다.

NADH가 없는 섭씨 37도 칼슘 없는 용액을 세포 배양에 투입하고 표적 세포를 찾습니다. NADH 가 없는 칼슘 없는 용액을 재사용하기 전에 60초 동안 사포닌 용액을 사용하십시오. 동시에 450 및 500 나노미터에서 fura-2-ff 방출 신호를 측정하여 350 ~ 365 나노미터의 암분 스캔을 사용하여 0.1 나노미터 단계로 NADH가없는 칼슘없는 용액으로 다시 profuse.

다음으로 칼슘 없는 조건의 신호로부터 칼슘 포화 용액의 신호를 빼는다. 그런 다음 각 여기에서 배출의 표준 편차를 계산하고 개별 동면 점으로 최소 표준 편차 값을 나타내는 흥분 파장을 선택합니다. 다중 파라메트릭 측정 시스템을 사용하여 배경 신호를 감지하고 세포 영역 내의 신호를 수정하려면 현미경 욕조에 염료가 없는 세포를 장착하고 세포가 3분 동안 정착할 수 있도록 합니다.

NADH 칼슘이 없는 용액을 분당 2~3밀리리터로 약 5분 동안 욕조에 넣고 표적 세포를 커버하기 위해 물체 필드를 설정합니다. 셀을 필드 밖으로 이동한 후 셀이 없는 창의 배경 신호를 측정하고 신호를 오프셋으로 설정합니다. 그런 다음 셀을 초기 위치로 되돌리고 셀 배경 신호 및 셀 영역을 측정합니다.

R-factor를 계산하기 위해 획득 한 세포 배경 및 영역 신호를 사용하여 염료가없는 세포를 현미경에 재장착하고 칼슘이없는 용액을 주입합니다. malate 용액으로 세포 현탁액을 교화하기 전에 표시된 신호를 측정합니다. 신호를 측정한 후 피루바테 용액으로 세포를 풍부하게 한 다음, malate-pyruvate 용액 및 로테네용액을 풍부하게 합니다.

그런 다음 각 신호에 대한 경사를 계산합니다. 여기에 교정 전후의 미토콘드리아 칼슘의 변화가 나타난다. 그 결과 1.03플러스 또는 마이너스 0.13 마이크로몰라 및 최대 미토콘드리아 칼슘 이없는 미토콘드리아 휴식 칼슘 농도를 가진 미토콘드리아 칼슘의 상당한 변화를 명확하게 밝혀 29.6 플러스 또는 마이너스 1.61 마이크로몰라의 한 마이크로몰라에서 최대 미토콘드리아 칼슘.

미토콘드리아 막 전위는 2나노몰라 TMRE의 풍부와 함께 모니터링되었다. 미토콘드리아 전위의 변화는 마이너스 150 밀리볼트의 초기 미토콘드리아 막 전위력을 기준으로 계산되었으며, 칼슘 첨가에 대한 반응으로 NADH의 감소를 입증하고 미토콘드리아 막 잠재력에 대한 무시할 만한 효과를 보였다. 미토콘디랄 pH는 카박스SNARF-1 하중에 의해 유도된 미토콘드리아 칼슘의 증가에 의해 영향을 받지 않았다.

잘못된 등약 점수로 인해 잘못된 R 및 NADH 보정이 발생합니다. 따라서 항상 세포가 없는 배경 과 셀 영역을 올바르게 측정하십시오. 이 기술은 생체 분석 유출에 있는 미토콘드리아 칼슘 동적 연구 결과를 준비하는 데 사용됩니다.