رواية نيكوتيناميد الدينين الدينوكليوتيد طريقة تصحيح لقياس Ca^{2 +} داخل الخلايا مع Fura-2-التناظرية في الخلايا الحية

الأشعة فوق البنفسجية المجسات الجمع، لديها تلوث إشارة متأصلة، وذلك بسبب الأصوات الجمع التلقائي. معظم المشكلة مع NADH، هو الحد من استخدام مسبار الجمع. ويمكن استخدام طريقة، لتصحيح دقيق للفلوريس الخارجي من NADH، من أجل استخراج صحيح، غير مُلَكّع إشارة مسبار الجمع.

إثبات الإجراء سيكون جيونغ هون لي، أستاذ أبحاثنا المساعد من مختبري. بعد السماح myocytes لتسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوب ، وpirnatate عظمى. تسمية الخلايا مع مليلترين من الطازجة أعدت واحد ملليمتر fura-2-FFAM تخفيف حل لمدة 60 دقيقة في أربع درجات مئوية.

في نهاية الحضانة، ضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في وضع مستقيم قبل إزالة المابير. ثم إضافة أربعة ملليلتر من درجة حرارة الغرفة ثقافة المتوسطة للتخزين في درجة حرارة الغرفة. في الموقع isobestic الفورا-2-Ffa نقطة تحديد جبل الخلايا المخففة على مرحلة المجهر والانتظار ثلاث دقائق للخلايا لتغرق إلى أسفل.

افراط NADH خالية من 37 درجة مئوية خالية من الكالسيوم حل في الخلية ثقافة وتحديد خلية الهدف. محلول سابونين الزفير لمدة 60 ثانية قبل إعادة الإفراط مع محلول خالي من الكالسيوم الخالي من الكالسيوم من NADH. في وقت واحد قياس الإشارات المنبعثة من فورا-2-ff في 450 و 500 نانومتر، وذلك باستخدام مسح استثارة من 350 إلى 365 نانومتر مع خطوة 0.1 نانومتر وإعادة إسراف مع محلول خالية من الكالسيوم NADH.

طرح التالي الإشارات في محلول الكالسيوم المشبعة من الإشارات في ظروف خالية من الكالسيوم. ثم حساب الانحرافات المعيارية للانبعاثات عند كل استثارة وتحديد الطول الموجي الإثارة تبين الحد الأدنى من قيم الانحراف المعياري كنقاط اسكوبية فردية. لاستخدام نظام قياس متعدد الباراتترية للكشف عن إشارة الخلفية وتصحيح الإشارة داخل منطقة الخلية ، قم بتركيب خلايا خالية من الصبغة في حمام المجهر والسماح للخلايا بالاستقرار لمدة ثلاث دقائق.

وافرت ناده حل خالي من الكالسيوم في الحمام لمدة خمس دقائق بمعدل 2-3 ملليلتر في الدقيقة، وتعيين حقل الكائن لتغطية الخلية المستهدفة. بعد نقل الخلية من حقل قياس إشارات الخلفية من نافذة خالية من الخلايا وتعيين إشارات كما الإزاحات. ثم ارجع الخلية إلى الموضع الأولي وقم بقياس إشارات خلفية الخلية ومنطقة الخلية.

لحساب عامل R استخدام خلفية الخلية المكتسبة وإشارات المنطقة قبل إعادة تركيب الخلايا الخالية من الصبغة على المجهر والاستفادة مع محلول خال من الكالسيوم. قياس الإشارات كما هو مبين قبل الإسراف في تعليق الخلية مع حل malate. بعد قياس الإشارات بغزارة الخلايا مع محلول بيروفات تليها وفرة مع محلول malate-بيروفات ومحلول الروتينون.

ثم حساب الميل لكل إشارة. هنا تظهر التغيرات في الكالسيوم الميتوكوندريا قبل وبعد التصحيح. النتائج تكشف بوضوح عن تغييرات كبيرة في الكالسيوم الميتوكوندريا مع تركيز الكالسيوم الميتوكوندريا يستريح دون الكالسيوم السيتوسولي من 1.03 زائد أو ناقص 0.13 ميكرومولار والحد الأقصى للكالسيوم الميتوكوندريا في واحد ميكرومولار من الكالسيوم 29.6 زائد أو ناقص 1.61 ميكرومولار.

تم رصد إمكانات عبر الميكوندرية مع وفرة من اثنين من نانومولار TMRE. تم حساب التغير في إمكانات الميتوكوندريا على أساس احتمال غشاء ميتوكوندريا أولي مفترض من ناقص 150 ملليفولت، مما يدل على انخفاض في NADH استجابة لإضافة الكالسيوم، مع تأثير سلبي على إمكانات غشاء الميتوكوندريا. لم يتأثر الجسم بالضمر الميتوكوندري بسبب الزيادة في الكالسيوم الميتوكوندريا الناجم عن تحميل الكاربوكسي SNARF-1.

نقاط isobestic غير صحيحة ينتج تصحيح R و NADH غير صحيحة. لذا عليك أن تأخذ الحرص على قياس دائما بشكل صحيح في الخلفية خالية من الخلية ومنطقة الخلية. وتستخدم هذه التقنية في إعداد دراسات الكالسيوم الميتوكوندريا الديناميكية في الانسكابات البيولوجية.