该协议是重要的，因为癌症干细胞的存在可能与复发或放射治疗后不良的结果有关。研究放射性抗性干细胞可能为克服放射性抗性提供线索。在该技术中，通过流式细胞测定用造物标记对癌症干细胞进行盐化，通过球体形成测定评估盐化细胞的自我更新能力。
进行菌落形成测定，以评估盐化细胞的放射性敏性。它确定有多少细胞失去了在一定剂量的辐射后产生形成菌落的合成的能力。本手稿为癌症干细胞的放射性敏感研究提供了初步的几个步骤，为更充分的机理研究提供了基础。
机制研究可能涉及与DNA损伤修复、活性氧物种清除、细胞周期阻止等有关的蛋白质。它将提供重要的见解，癌症干细胞如何获得辐射抵抗以及如何克服阻力。演示辐射程序的将是我们部门辐射技术员李陈楠。
为了开始这个程序，在RPMI-1640介质培养A549细胞在37摄氏度的10厘米的培养皿中辅以10%FBS，用5%的二氧化碳。当细胞达到80至90%汇合时，去除培养培养。用三毫升PBS简单清洗细胞。
接下来，在每道菜中加入三毫升0.05%的三辛。取出三辛，让留生三辛在37摄氏度下消化细胞一至三分钟。经常检查细胞的分离，以避免过度消化。
当细胞变得松散，并开始从盘子分离，加入三毫升的RPMI-1640介质，辅以10%FBS，并将细胞悬浮转移到50毫升管。在300倍g和4摄氏度下离心5分钟。丢弃上一液，将细胞重新在10毫升PBS中。
将 0.5 毫升的细胞悬浮液转移到新管中，作为等型控制。将控制管和实验管在300倍g和4摄氏度下离心5分钟。丢弃超自然剂。
然后，将PBS中的荧光二联错异型控制和抗体稀释到最佳浓度滴定，以准备工作溶液。将控制和实验细胞与每个工作溶液一起重新暂停，并轻轻混合。在黑暗中和室温下孵育样品30至40分钟。
通过加入10毫升PBS，轻轻混合，在300倍g和4摄氏度下离心5分钟，清洗细胞。丢弃超自然剂，用10毫升PBS重新暂停细胞。接下来，将40微米细胞过滤器放在新的50毫升管上，确保为控制和实验细胞准备单独的管和应变器设置。
将每个细胞悬浮液应用到相应的过滤器上，并收集流经。在300倍g和4摄氏度下将流量离心5分钟。丢弃上流剂，用0.2至1.0毫升PBS重新悬浮细胞，将每个细胞悬浮液转移到单独的5毫升管中，用于流动细胞切除术。
在生物安全柜中，为每种辐射剂量准备一个六井板，包括零灰组。向每井添加 1.5 毫升已完成的 1640 个介质。用已完成的1640个培养基稀释收获的细胞，使每毫升1000个细胞的细胞密度。
然后，将稀释的细胞悬浮液添加到井中，水平摇动板，以均匀分布井中的细胞。记录每个剂量组中添加的体积。在37摄氏度的培养与5%的二氧化碳。
在细胞附着到井底后，将完成的 1640 个介质添加到每口井中，直到介质高度达到 1 厘米。当板在细胞培养室和放射治疗室之间转移时，用铝箔包裹板或将其放入干净的盒子里，以避免污染。将板保持平坦，以避免介质溢出。
接下来，设定为20厘米20厘米辐射场。将1.0厘米厚的组织等价物放在治疗沙发上，将六个井板放在波卢斯上，以保持它们接触。确保整个板在辐射场内。
将源-皮肤距离设置为 100 厘米，并调整治疗沙发的高度，使中等表面水平与激光水平对齐。按顺序将分配的剂量交付到每个板。之后，将盘子放在细胞培养室的生物安全柜。
将每井中的介质替换为两毫升完成的 1640 介质。在37摄氏度的培养下，二氧化碳含量为5%，确保每三到五天更换一次培养。辐射后7至10天，取出介质，用PBS短暂清洗细胞。
在烟罩中，在每井中加入一毫升4%甲醛，以固定细胞10分钟。然后，去除甲醛，每次洗涤使用两毫升蒸馏水洗两次井。在每个井中加入1%水晶紫罗兰染色溶液1毫升，染色10分钟。
在此之后，去除水晶紫罗兰染色溶液，用蒸馏水洗三次细胞。取出水，让盘子干燥 30 分钟。计算具有 50 个细胞的菌落数量。
在这项研究中，对α二三角洲一高和阿尔法两个三角洲一个低A549细胞进行排序。一些标记可能显示不同的种群，并且易于门禁。然而，一些标记只显示高和低表达模式，而不是明显的正负量。
在这种情况下，等型控制对于浇注非常重要。通过 qPCR 验证排序单元格中 alpha 两个增量一的表达式。与α二三角洲一低细胞相比，编码α两个三角洲一基因CACNA2D1的表达在排序的α二三角洲一高细胞中更高。
此处显示了球体的典型形态和球体形成效率。Alpha二三角洲一高细胞显示更高的球体形成效率，表明较高的自我更新能力。这里显示了殖民地和生存曲线的典型图像。
一个包含大约50个细胞的群体可以在显微镜下检查，并标记为参考。菌落的数量被计算在内，然后可以计算每个剂量的存活分数，并绘制一个生存曲线。阿尔法二三角洲一高细胞相对抗辐射相比，阿尔法二三角洲一低细胞。
与细胞培养相关的任何步骤都应在生物安全柜或层清洁工作台上执行。为避免污染，建议在分拣后将抗生素添加到培养介质中。当通过球体形成测定初步识别肿瘤干细胞标记时，可以通过体内限制稀释测定进行进一步表征，以评估肿瘤生成能力。
从辐射抗性机制研究，研究人员可以检查与DNA损伤修复、活性氧物种清除和细胞周期停止对辐射作出反应有关的蛋白质。在细胞辐射期间，请注意，线性加速器只能由合格的技术人员操作。远离辐射。
站立时，请注意甲醛是挥发性且危险的。在烟罩中使用甲醛。
